影響家畜耳型變異遺傳位點(diǎn)的研究進(jìn)展

郭家中，鐘 杰，李鵬飛，李 利，張紅平

(四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，成都 611130)

耳朵類型(簡(jiǎn)稱耳型)是現(xiàn)代家畜品種的一個(gè)重要性狀，其主要包括耳朵(耳廓)大小、形狀和直立性三個(gè)方面的特征[1-2]。在一個(gè)家畜品種內(nèi)，不同個(gè)體之間往往具有相同的耳型，且能夠穩(wěn)定地遺傳；因此，耳型是家畜品種鑒定的理想表型指標(biāo)之一。另外，近年來有關(guān)動(dòng)物福利的研究結(jié)果表明，耳朵姿勢(shì)可作為動(dòng)物情緒評(píng)估的重要依據(jù)[3-6]。

哺乳動(dòng)物的耳朵包含內(nèi)耳、中耳、外耳三部分；其中，外耳又分為外耳道與耳廓兩部分。一般而言，哺乳動(dòng)物出生時(shí)，其耳朵形態(tài)與結(jié)構(gòu)已基本形成[7]。以人耳為例，內(nèi)耳、中耳、外耳依次在胚胎期第3、4、5周開始發(fā)育；其中，外耳耳廓最早發(fā)育成熟，到第20周時(shí)，已經(jīng)具備成人耳廓的基本形態(tài)[8]。另外，內(nèi)耳骨迷路于第23周發(fā)育完成，在前庭窗與鐙骨底板連接，完成內(nèi)中耳的整合[9]；包含3個(gè)聽小骨(錘骨、砧骨、鐙骨)的中耳腔于第30周形成，并逐漸完成中外耳的整合[10-11]。如果與耳朵發(fā)育相關(guān)的基因發(fā)生突變，則可能會(huì)導(dǎo)致畸形耳。例如，周海梅等[12]總結(jié)了維甲酸和HOX基因家族對(duì)哺乳動(dòng)物畸形耳的影響。但哺乳動(dòng)物耳朵發(fā)育過程復(fù)雜，涉及多個(gè)基因，故影響不同家畜品種耳型變異的遺傳位點(diǎn)也不盡相同。本文總結(jié)歸納了影響豬、綿羊、山羊等家畜耳朵大小、外耳直立性以及小耳畸形等性狀遺傳位點(diǎn)的研究進(jìn)展，旨在為家畜遺傳育種工作以及人類耳朵相關(guān)疾病研究提供參考。

1 影響豬耳型的遺傳位點(diǎn)

1.1 影響豬耳朵大小的遺傳位點(diǎn)

在養(yǎng)豬業(yè)中，大白、長(zhǎng)白、杜洛克等著名的商業(yè)品種豬的耳型多為直立耳或前傾耳，而中國(guó)地方品種豬的耳型一般為長(zhǎng)垂耳[13]。為探究影響家豬耳型變異的遺傳位點(diǎn)，Wei等[14]依據(jù)圖像信息，將大白豬和梅山豬雜交的F2代個(gè)體的耳朵分為大、中、小三類，最終在5號(hào)、7號(hào)染色體上分別鑒定到1個(gè)與耳朵大小和外耳直立性顯著關(guān)聯(lián)的數(shù)量性狀座位(quantitative trait loci，QTL)。Ma等[15]則利用圖像軟件準(zhǔn)確測(cè)定了杜洛克和二花臉豬雜交的F2代個(gè)體豬耳面積，最終檢測(cè)到23個(gè)與耳朵質(zhì)量、面積和直立性呈現(xiàn)顯著關(guān)聯(lián)的QTL；其中一個(gè)位于7號(hào)染色體58 cM區(qū)域的QTL與上述三個(gè)性狀顯著關(guān)聯(lián)，這與Wei等[14]的研究結(jié)果一致。基于此，Ren等[1]進(jìn)一步利用同源相同(IBD)定位的方法將該QTL區(qū)間縮小至750 kb區(qū)域。相比較于該區(qū)域內(nèi)其他8個(gè)候選基因，PPARD在皮膚穩(wěn)態(tài)[16]和軟骨發(fā)育過程中[17]發(fā)揮重要作用，該基因的一個(gè)錯(cuò)義突變(G>A，G32E)被確定是調(diào)控豬耳朵大小變異的一個(gè)因果突變。mRNA水平的基因表達(dá)量表明，G32E突變降低PPARD的表達(dá)，解除了PPARD對(duì)耳朵軟骨生長(zhǎng)的抑制作用，從而間接促進(jìn)耳朵過度生長(zhǎng)，導(dǎo)致豬的耳朵變大[18]。綜上所述，PPARD被確定為首個(gè)影響家豬耳朵大小的基因(表1)。

表1 影響家畜不同耳型的遺傳位點(diǎn)Table 1 Genetic loci affecting different ear types in domestic animals

除上述7號(hào)染色體的QTL，多項(xiàng)研究表明，位于5號(hào)染色體30.14～40.92 Mb的基因組區(qū)域也是一個(gè)影響豬耳型變異的遺傳座位，但上述研究所報(bào)道的主效基因卻有差異[19, 22-24]。Li等[22]基于對(duì)HMGA2、SOX5、PTHLH這3個(gè)候選基因中7個(gè)SNPs位點(diǎn)的關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)HMGA2的一個(gè)SNP位點(diǎn)(g.2836A>G)與耳朵大小相關(guān)性最高，從而將HMGA2確定為影響豬耳朵大小的基因。與之不同的是，Zhang等[24]基于對(duì)民豬(中國(guó)地方品種)和大白豬雜交的F2代資源群體的全基因組關(guān)聯(lián)分析(GWAS)結(jié)果，認(rèn)為L(zhǎng)EMD3和WIF1是影響豬耳朵大小的候選基因。進(jìn)一步研究表明，WIF1的mRNA和蛋白表達(dá)量在60日齡大白豬中均顯著高于同日齡二花臉豬[19]。由于WIF1基因內(nèi)的一個(gè)錯(cuò)義突變(c.1167C>G)與豬耳朵大小顯著關(guān)聯(lián)[23]，因此，與HMGA2基因相比，WIF1更有可能是影響豬耳朵大小的一個(gè)候選基因。

此外，有研究表明，除基因點(diǎn)突變之外，拷貝數(shù)變異也會(huì)引起豬耳型變異。Chen等[20]鑒定到1個(gè)38.7 kb拷貝數(shù)變異(CNV)影響MSRB3基因的最后兩個(gè)外顯子，該變異僅在6個(gè)中國(guó)本土長(zhǎng)垂耳豬和半垂耳豬中存在?；趀QTL分析的結(jié)果顯示，CNV與miR-584-5p的表達(dá)顯著關(guān)聯(lián)，而活體和離體的試驗(yàn)又表明miR-584-5p會(huì)抑制MSRB3基因的mRNA翻譯，從而導(dǎo)致豬耳變大。這項(xiàng)深入系統(tǒng)的研究排除早前研究提出的與家豬耳朵大小相關(guān)的候選基因：HMGA2[22]、LEMD3、WIF1[19, 23-24]。與上述研究結(jié)果不同的是，Zhang等[21]發(fā)現(xiàn)MSRB3的mRNA表達(dá)量在60日齡的民豬中顯著高于同日齡的大白豬；并且表達(dá)量越高的個(gè)體，耳廓越大。蛋白水平的證據(jù)表明，MSRB3的表達(dá)量在60日齡二花臉豬中比同日齡大白豬更高[19]?？偟膩碚f，上述研究結(jié)果之間的差異可能是由不同的試驗(yàn)動(dòng)物或者不同的樣品采集時(shí)間引起的。因此，為進(jìn)一步探究MSRB3是否在調(diào)控耳朵生長(zhǎng)及發(fā)育過程中發(fā)揮作用，有必要深入研究在同一品種內(nèi)，MSRB3的時(shí)間序列表達(dá)特征，從而深入理解該基因的功能。

1.2 控制豬耳畸形的遺傳位點(diǎn)

小耳畸形是一種先天性外耳畸形，具體表現(xiàn)為耳廓變小甚至外耳完全消失，從而導(dǎo)致聽力不同程度的喪失[39]。這種由小耳畸形導(dǎo)致的聽力喪失與內(nèi)耳耳蝸中間細(xì)胞早期退化引起的聽力喪失不同[40]，但人們對(duì)其遺傳機(jī)制知之甚少。在人類上，患有小耳畸形的個(gè)體還表現(xiàn)出顱面畸形、小齒畸形、唇腭裂等[41]異常。該結(jié)果表明有些基因在胚胎發(fā)育早期發(fā)揮作用，不僅調(diào)控耳朵發(fā)育，而且也參與到其他組織器官的發(fā)育。

最近，Qiao等[25]利用GWAS分析在沙子嶺豬上揭示了HOXA1基因第一外顯子的一個(gè)突變(c.451delinsTC)使蛋白翻譯提前終止，導(dǎo)致HOXA1蛋白的核心結(jié)構(gòu)域殘缺，從而引起豬的小耳畸形。Li等[26]利用基因編輯技術(shù)，以豬為模型模擬在人類中發(fā)現(xiàn)的TWIST2突變(p.E75K)[42]，所有基因編輯成功的個(gè)體均表現(xiàn)出小耳畸形。類似地，Hai等[43]構(gòu)建了攜帶MITF突變(L247S)的巴馬香豬模型，該模型豬聽力損失特征與人類的聽力損失非常相似。上述研究表明，豬可以作為研究與人類耳朵發(fā)育異常相關(guān)疾病的模式動(dòng)物。

2 影響綿羊耳型的遺傳位點(diǎn)

現(xiàn)有綿羊品種的耳型主要分為短直耳和長(zhǎng)垂耳兩類，而中國(guó)地方綿羊品種的耳型多為長(zhǎng)垂耳或半下垂耳[44]。綿羊耳型變異主要分為耳朵大小和形狀的變異；有趣的是，基于計(jì)算機(jī)斷層掃描獲取的外耳、中耳和內(nèi)耳的解剖結(jié)構(gòu)顯示，綿羊和人類的耳朵在結(jié)構(gòu)上較為相似[45-46]。因此，綿羊耳朵可以作為人類耳朵相關(guān)醫(yī)學(xué)研究中的模型。

截至目前，共有7個(gè)與綿羊耳型變異相關(guān)的遺傳位點(diǎn)被報(bào)道[2, 27-29]?；陂L(zhǎng)耳的多浪綿羊與短耳的迪慶綿羊的SNP芯片數(shù)據(jù)，Wei等[27]利用GWAS分析檢測(cè)到3號(hào)染色體上MSRB3基因內(nèi)的一個(gè)SNP位點(diǎn)在兩個(gè)群體間表現(xiàn)出巨大的等位基因頻率差異，認(rèn)為該位點(diǎn)與綿羊的耳朵大小關(guān)聯(lián)。最近，Gao等[2]利用一般線性模型和全基因組高效混合模型(GEMMA)，對(duì)耳朵大小不同的115只多浪綿羊進(jìn)行GWAS分析，鑒定到DCC、PTPRD、SOX5共3個(gè)與綿羊耳朵大小顯著關(guān)聯(lián)的候選基因。

在綿羊小耳畸形方面，Jawasreh等[28]基于GWAS的研究表明，位于23號(hào)染色體GATA6基因上游的一個(gè)SNP位點(diǎn)是導(dǎo)致阿瓦西綿羊(Awassi sheep)小耳畸形的因果突變；這與GATA6基因調(diào)控脊椎動(dòng)物軟骨組織發(fā)育的功能相一致[47]。Mastrangelo等[29]綜合利用GWAS和比較基因組學(xué)研究方法，確定1號(hào)染色體上CLRN1基因第3內(nèi)含子區(qū)域的一個(gè)SNP位點(diǎn)(rs419889303)與貝里斯山谷綿羊(Valle del Belice sheep)小耳畸形顯著關(guān)聯(lián)。由于CLRN1是Usher綜合征(先天神經(jīng)性耳聾)的致病基因之一[48]；因此，CLRN1被初步認(rèn)為是引起綿羊耳朵畸形的一個(gè)候選基因[29]。最近，He等[30]采用病例-對(duì)照設(shè)計(jì)的GWAS研究，在畸形耳阿勒泰羊的HMX1基因增強(qiáng)子區(qū)域鑒定到一個(gè) 76 bp的片段重復(fù)，初步確定該變異與畸形耳性狀顯著關(guān)聯(lián)。

3 影響山羊耳型的遺傳位點(diǎn)

在全世界現(xiàn)有的山羊品種中，原產(chǎn)于非洲地區(qū)的山羊品種多為長(zhǎng)垂耳類型；而亞洲地區(qū)的多為短直耳類型[44]。例如，中國(guó)成都麻羊、太行山羊、中衛(wèi)山羊等地方品種[49]?？傮w而言，目前關(guān)于山羊耳型變異的遺傳研究相對(duì)較少。Kumar等[31]利用SNP芯片研究7個(gè)巴基斯坦本土山羊品種間的遺傳變異，發(fā)現(xiàn)MSRB3基因與山羊耳朵大小相關(guān)。Brito等[32]為鑒定控制拉曼查山羊短耳性狀的遺傳位點(diǎn)，將努比亞、波爾等長(zhǎng)耳山羊品種作為對(duì)照，在全基因組水平檢測(cè)到7號(hào)染色體的48.5～57.3 Mb區(qū)域最有可能與山羊短耳性狀關(guān)聯(lián)；雖然該區(qū)域內(nèi)存在CXCL14、POU4F3、NDST1等與耳朵發(fā)育相關(guān)的基因[32]，但因果突變尚未被確定。最近，鐘杰等[33]在西藏仲巴縣帕江鄉(xiāng)的藏山羊群體中，發(fā)現(xiàn)部分山羊的耳朵發(fā)育不完全、外耳較小，總體上與拉曼查山羊的耳型相似；比較基因組學(xué)分析結(jié)果顯示，7號(hào)染色體45.05～59.76 Mb區(qū)域在正常耳和小耳型藏山羊之間存在顯著的遺傳分化；這與Brito等[32]在拉曼查山羊上的研究結(jié)果一致。簡(jiǎn)言之，上述研究初步表明，該基因組區(qū)域是影響山羊耳型變異的一個(gè)遺傳位點(diǎn)。

4 影響其他家養(yǎng)動(dòng)物耳型的遺傳位點(diǎn)

關(guān)于耳型變異的遺傳位點(diǎn)在其他家養(yǎng)動(dòng)物中亦有報(bào)道。例如，Boyko等[34]利用915只家犬(80個(gè)品種)、83只灰狼、10只非洲犬的基因組芯片數(shù)據(jù)以及57個(gè)性狀的表型數(shù)據(jù)，開展GWAS研究；最終確定MSRB3基因上游100 kb區(qū)域與家犬的垂耳表型顯著關(guān)聯(lián)。Vaysse等[35]基于12個(gè)直立耳和15個(gè)垂耳家犬品種的GWAS分析，鑒定到23個(gè)SNPs位點(diǎn)與垂耳表型顯著關(guān)聯(lián)，其中最顯著的SNP位于HGMA2與MSRB3基因之間。近年來，Webster等[36]對(duì)46個(gè)不同耳型的家犬品種進(jìn)行了GWAS分析，同樣鑒定到該位點(diǎn)與垂耳表型關(guān)聯(lián)。綜上所述，MSRB3所在基因組區(qū)域是影響家犬耳型變異的遺傳座位。馬作為最早被人類馴化的動(dòng)物之一，如今已經(jīng)形成了多個(gè)品種[50]。原產(chǎn)于印度的馬瓦里馬(Marwari horse)是一種耳朵直立，耳尖向內(nèi)翻卷的特殊品種[51]；Jun等[37]在該品種中檢測(cè)到TSHZ1基因的一個(gè)錯(cuò)義突變(p.Ala344>Val)與馬瓦里馬耳尖向內(nèi)翻卷有關(guān)。雖然已有TSHZ1基因缺陷導(dǎo)致小鼠中耳畸形的報(bào)道[52]，但Jun等的研究?jī)H使用了1個(gè)樣本，結(jié)果的準(zhǔn)確性有待在更大的樣本群體中驗(yàn)證。在牛上，部分瑞士高原牛的外耳表現(xiàn)出鋸齒狀耳廓或耳廓縮短等畸形特征。Koch等[38]基于GWAS分析，首先將因果突變定位于6號(hào)染色體的4 Mb區(qū)域內(nèi)，進(jìn)一步依據(jù)全基因組重測(cè)序的數(shù)據(jù)，確定該區(qū)域內(nèi)HMX1基因下游發(fā)生的CNV是因果突變，這與阿勒泰羊畸形耳的形成原因一致[30]。

5 小 結(jié)

盡管從分子機(jī)制角度，耳朵的生長(zhǎng)發(fā)育過程受到多基因協(xié)同調(diào)控，但基于全基因組水平的研究結(jié)果表明，影響家畜耳型變異的候選基因主要包括MSRB3[14-15, 19-21, 27, 31, 34-36]、PPARD[1, 14-15, 18]、HMX1[30, 38]等。尤其是，MSRB3在豬、綿羊、山羊、犬上均有報(bào)道；最近，Mastrangelo等[53]的研究表明，MSRB3基因變異與綿羊的脂肪沉積相關(guān)。因此，可以推測(cè)該基因變異導(dǎo)致脂肪沉積過程異常，從而造成家畜耳朵變大、下垂。

總體來說，借助全基因組遺傳多態(tài)性數(shù)據(jù)以及基因表達(dá)數(shù)據(jù)，現(xiàn)有研究鑒定到多個(gè)影響家畜耳型變異的遺傳座位，增強(qiáng)人們對(duì)家畜耳朵發(fā)育機(jī)制的理解。盡管如此，上述研究仍存在諸多分歧。例如，對(duì)于耳型屬于質(zhì)量性狀還是數(shù)量性狀尚無(wú)定論；在一些研究中，耳型被視作質(zhì)量性狀[27, 31-32, 34]，簡(jiǎn)單地劃分為三類(大、中、小)。顯然，利用定量手段準(zhǔn)確測(cè)定耳朵的面積則有利于提高分析的準(zhǔn)確性。因此，一些研究利用圖像處理軟件等工具準(zhǔn)確測(cè)定家畜(例如，豬)耳面積，將其作為數(shù)量性狀進(jìn)行分析[1, 15, 18, 20, 22]。另外，有些研究使用的樣本量太少，相關(guān)結(jié)果需要在更大的樣本群體中進(jìn)行驗(yàn)證。同時(shí)，在已有研究中，人們針對(duì)耳朵大小、直立性等性狀分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析；但考慮到這些性狀間的遺傳相關(guān)，采用多性狀統(tǒng)計(jì)分析模型理論上更為合理。此外，甲基化測(cè)序、三維基因組(例如，Hi-C)等系統(tǒng)性研究技術(shù)的應(yīng)用，將會(huì)提高因果突變的鑒定及分子機(jī)制研究的準(zhǔn)確性和效率。因此，綜合運(yùn)用現(xiàn)代遺傳學(xué)的各種方法和技術(shù)，將有助于全面解析家畜耳型變異機(jī)制，從而為家養(yǎng)動(dòng)物遺傳育種工作以及人類耳朵相關(guān)疾病研究提供參考。