循環(huán)毒毒蛇咬傷患者外周血Th1/Th2細胞因子的表達及意義

呂彩萍 姚洪鋒* 駱方軍 段銀波 何玉領(lǐng) 金蓉佳

毒蛇咬傷是常見熱帶、亞熱帶中毒性疾病，在世界范圍內(nèi)每年約有270萬例發(fā)生，死亡人數(shù)達8.1萬至13.8萬［1］。我國每年被毒蛇咬傷患者約10萬人次，蛇咬傷重癥患者死亡率約10%～15%，另有25%～30%的患者遺留肢體殘疾［2］。毒蛇咬傷后，蛇毒毒素進入人體，損害心、肝、腎等重要器官功能，出現(xiàn)臟器功能衰竭甚至導致死亡［3-4］。劉志國等［5］研究發(fā)現(xiàn)，毒蛇咬傷危害程度與機體免疫應(yīng)答相關(guān)。淋巴細胞亞群數(shù)量、功能發(fā)生異常，可導致免疫系統(tǒng)紊亂并發(fā)生一系列病理變化，通過抑制毒蛇咬傷患者的免疫反應(yīng)可能有助于改善該病預后。本研究通過檢測分析循環(huán)毒毒蛇咬傷患者外周血T淋巴細胞亞群數(shù)量及Th1/Th2細胞因子的表達，探討其在蛇咬傷患者病情評估中的指導意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2016年3月至2017年10月諸暨市人民醫(yī)院收治循環(huán)毒毒蛇咬傷患者108例，根據(jù)國際蛇傷診斷標準分為輕度蛇咬傷組與重度蛇咬傷組。輕度蛇咬傷組，男54例，女28例；平均年齡（50.3±30.5）歲。其中蝮蛇咬傷68例，眼鏡蛇咬傷8例，五步蛇咬傷6例。重度蛇咬傷組，男20例，女6例；平均年齡（52.1±28.8）歲。其中蝮蛇咬傷19例，眼鏡蛇咬傷4例，五步蛇咬傷3例。另選取同期本院體檢健康者30例為對照組，男18例，女12例；平均年齡（49.8±30.6）歲。三組受試者性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。（1）納入標準：①符合《中國毒蛇及蛇傷救治》診斷標準［6］，明確為循環(huán)毒毒蛇咬傷；②在蛇咬傷后24 h內(nèi)入院；③未在外院就診，包括使用抗蛇毒血清等。（2）排除標準：①有自身免疫性疾病、細菌性感染、病毒性感染及其它可引起炎癥的基礎(chǔ)疾??；②合并有多器官功能障礙、昏迷、嚴重心、肝、腎、血液等系統(tǒng)疾病以及精神疾病。本項目經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，所有受試者均簽署知情同意書。

1.2 方法 （1）T淋巴細胞亞群計數(shù)檢測：采用BD FACSCanto II流式細胞儀，檢測患者外周血T淋巴細胞亞群（CD3/CD4/CD8），50 μl標本+20 μl熒光標記抗體試劑于BDCount計數(shù)管中，室溫避光孵育15 min，加溶血劑450 μl，充分混勻并靜置5 min，上機檢測并用Canto軟件分析。（2）外周血Th1/Th2細胞因子檢測：采用人Th1/Th2細胞因子檢測試劑盒，基于免疫熒光技術(shù)，捕獲微球混合液中不同熒光強度的捕獲微球表面分別包被白介素2（IL-2）、白介素4（IL-4）、白介素6（IL-6）、白介素10（IL-10）和腫瘤壞死因子α（TNF-α）、干擾素γ（INF-γ）特異性抗體分別與待測樣本中的IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ特異性結(jié)合后，再與PE標記的熒光檢測試劑結(jié)合。捕獲微球、待測樣本、檢測抗體形成雙抗體夾心復合物，利用流式細胞術(shù)檢測此復合物熒光強度得到待測樣本IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、INF-γ含量。取25 μl標本以及制備的不同梯度稀釋的標準品，加入25 μl捕獲微球混合液與25 μl熒光檢測試劑，渦旋混勻室溫避光孵育2.5 h，隨后加入1 ml PBS（1M）溶液，200 g離心5 min，棄上清液，加入100 μl PBS溶液，渦旋混勻3～5 s立即上機檢測，用BD FACSCanto Diva軟件分析結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用 SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布計量資料以（±s）表示，兩組比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組外周血T淋巴細胞亞群分布情況比較 重度蛇咬傷組中CD3+T淋巴細胞、CD4+T淋巴細胞數(shù)量低于輕度蛇咬傷組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）；與輕度蛇咬傷組比較，重度蛇咬傷組中CD4+/ CD8+比例降低，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。見圖1。

2.2 各組外周血Th1/Th2細胞因子表達水平比較 重度蛇咬傷組IL-6水平高于輕度蛇咬傷組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）；輕度蛇咬傷組與重度蛇咬傷組血清IL-10水平均高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；重度蛇咬傷組IL-4、TNF-α高于輕度蛇咬傷組和對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見圖2。

圖1 各組外周血T淋巴細胞亞群分布情況比較

圖2 各組Th1/Th2細胞因子表達水平比較

3 討論

蛇咬傷是臨床常見外傷之一，根據(jù)毒蛇毒液中所含的毒素成分以及臨床癥狀的不同可分為神經(jīng)毒蛇、血循毒蛇、混合毒蛇3大類。蛇毒素可以引發(fā)傷口感染或應(yīng)激性炎癥反應(yīng)，在炎癥過程中，機體免疫狀態(tài)發(fā)生變化，與疾病的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。WAIKHOM等［7］研究指出，蝰蛇咬傷的患者存在細胞免疫功能缺陷，可能與T淋巴細胞的數(shù)量和質(zhì)量缺陷及抗原遞呈細胞如樹突狀細胞異常有關(guān)?？梢娧h(huán)毒毒蛇咬傷患者體內(nèi)免疫狀態(tài)與疾病的發(fā)生發(fā)展有重要聯(lián)系。

本資料結(jié)果顯示，重癥循環(huán)毒毒蛇咬傷患者CD3+、CD4+T淋巴細胞水平及CD4+/CD8+比值較輕度組和正常對照組明顯降低，可能是循環(huán)毒毒素抑制T淋巴細胞免疫功能，T細胞活化被抑制。CD4+T細胞亞群為輔助性T細胞（Th），可介導遲發(fā)性細胞免疫，并影響機體炎癥的發(fā)生；CD8+T細胞亞群為細胞毒性T細胞（Tc）或抑制性T細胞（Ts），能抑制炎癥的產(chǎn)生。這兩種免疫調(diào)節(jié)細胞的數(shù)量及其比例可反映機體內(nèi)免疫系統(tǒng)功能的狀態(tài)，兩者比例失衡提示機體免疫功能發(fā)生紊亂，因此檢測CD4+和CD8+T細胞數(shù)量對于評價循環(huán)毒毒蛇咬傷患者的機體免疫功能具有重要意義。

CD4+T細胞可分化為成熟的Th1和Th2細胞，Th1/Th2細胞可表達不同細胞因子，如促炎性細胞因子（TNF-α，IL-6）和抗炎性細胞因子（IL-10，IL-4）等。機體正常狀態(tài)下，Th1/Th2處于相對平衡狀態(tài)，若一方功能增強，另一方的功能便會被減弱，導致Th1/Th2失衡，進而引起細胞因子表達的紊亂［8］。被毒蛇咬傷后，蛇毒素作用可引發(fā)患者機體出現(xiàn)不同程度的急性炎癥反應(yīng)［9］。

MONZAVI等［10］研究表明，蝮蛇咬傷患者機體內(nèi)的IL-1、IL-6、TNF-α等細胞因子水平明顯升高，且與病情嚴重程度呈正相關(guān)，可引發(fā)局部或全身炎癥反應(yīng)，使用抗蛇毒血清治療后，上述細胞因子水平明顯降低，病情明顯改善。劉志國等［5］研究發(fā)現(xiàn)，IL-6越高機體損傷越嚴重，提示炎性細胞因子水平與病情嚴重程度相關(guān)，可以作為評估蛇咬傷患者就診時病情嚴重程度的客觀指標。本資料結(jié)果顯示，促炎因子TNF-α、IL-6在重癥蛇咬傷患者中均有不同程度的升高，與對照組和輕度蛇咬傷組比較，差異有統(tǒng)計學意義。TNF-α在細胞因子級聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，可以調(diào)控其他促炎因子的分泌。TNF-α、IL-6過度表達會刺激機體發(fā)生免疫反應(yīng)，從而加重病情。且輕度蛇咬傷組和重度蛇咬傷組的IL-10濃度高于對照組，這可能是蛇毒毒素刺激炎癥反應(yīng)所致。IL-10是已知最重要的抗炎和免疫抑制性細胞因子，能夠抑制TNF-α、IL-6等細胞因子的表達，減輕炎癥反應(yīng)，起到抗炎作用［11］。監(jiān)測循環(huán)毒毒蛇咬傷患者外周血Th1/Th2細胞因子的表達和T淋巴細胞亞群分布情況，有助于評估患者的病情嚴重程度。