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    小鼠口腔癌不同時期淋巴結(jié)和骨髓的VEGF表達(dá)情況及其微環(huán)境對淋巴道轉(zhuǎn)移的影響

    2021-02-05 02:17:34顏啟璋郭夢竹于大海
    中國臨床新醫(yī)學(xué) 2021年1期
    關(guān)鍵詞:口腔癌骨髓免疫組化

    路 瑩,程 立,顏啟璋,陳 念,李 晶,郭夢竹,于大海

    口腔鱗狀細(xì)胞癌是上皮來源口腔惡性腫瘤,主要發(fā)生淋巴道轉(zhuǎn)移[1]。腫瘤轉(zhuǎn)移的一個關(guān)鍵步驟是循環(huán)腫瘤細(xì)胞進(jìn)入二級或較遠(yuǎn)的器官部位,成為播散腫瘤細(xì)胞(disseminated tumor cell,DTC)[2]。DTC能否在遠(yuǎn)處器官定植、生長成瘤的影響因素很多[3,4]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是一種分泌性生長因子,其主要作用是促進(jìn)血管生成,與腫瘤的發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān),其在口腔癌發(fā)生、發(fā)展中的作用已有較多研究[5,6]。但是,關(guān)于口腔癌發(fā)展過程中淋巴結(jié)和骨髓內(nèi)的VEGF表達(dá)及其與DTC的相互作用尚無研究。在前期研究[7,8]中,本課題組成功使用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide,4-NQO)飲水法構(gòu)建了Balb/c小鼠口腔癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型,該模型可以獲取口腔癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中不同時期的頜下淋巴結(jié)、骨髓進(jìn)行研究,且小鼠間個體差異小,可連續(xù)觀測,結(jié)果的可靠性及精確度較高。因此,在前期研究基礎(chǔ)上,本研究旨在觀察口腔癌發(fā)展各階段中骨髓、淋巴結(jié)微環(huán)境及癌細(xì)胞的VEGF表達(dá)情況,探討其在口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移靶向性的相互作用。

    1 材料與方法

    1.1動物來源與建模 選入40只6周齡雄性健康Balb/c小鼠(購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司)構(gòu)建小鼠口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移模型,將其隨機(jī)分為A、B、C、D、E組,每組8只。建模方法[7,8]:用純水將4-NQO(購自Sigma,美國)配置成1%濃度,4 ℃冰箱保存。A組小鼠將自來水置于塑料瓶中,自由飲用。B~E組小鼠將配制好的4-NQO溶液以自來水稀釋成200 mg/L濃度置于避光飲水瓶內(nèi),自由飲用,后改喂自來水。B組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水8周后改喂單純自來水,該時期小鼠舌部黏膜尚未出現(xiàn)病理改變,但已經(jīng)存在4-NQO藥物影響。C組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后處死,該時期小鼠舌部黏膜已經(jīng)出現(xiàn)異常增生表現(xiàn),但未形成癌癥。D組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后改喂單純自來水4~8周,該時期小鼠已經(jīng)形成舌癌,但尚未發(fā)生轉(zhuǎn)移。E組小鼠飲用混有4-NQO溶液的自來水20周后改喂單純自來水8~12周,該時期小鼠口腔癌已經(jīng)形成,并伴有下頜淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。

    1.2標(biāo)本的獲取方法與檢測

    1.2.1 標(biāo)本的獲取方法 (1)HE染色與免疫組化染色的標(biāo)本獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠,切取小鼠舌體組織及雙側(cè)下頜下淋巴結(jié),以福爾馬林溶液進(jìn)行固定。取雙側(cè)股骨,清洗去凈肌肉及軟骨組織,剪去股骨兩端,應(yīng)用注射器抽取1 ml生理鹽水,沖洗股骨骨髓至EDTA抗凝管,上下顛倒幾次后充分搖勻,置于冰盒內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?2)液相芯片法的標(biāo)本獲?。侯i椎脫臼法處死小鼠,取小鼠頜下淋巴結(jié),放入DMEM培養(yǎng)液中剪碎研磨,過濾獲得單細(xì)胞懸液,作為淋巴結(jié)微環(huán)境樣本。應(yīng)用注射器抽取培養(yǎng)液沖出股骨骨髓,作為骨髓微環(huán)境樣本。

    1.2.2 HE染色與免疫組化染色法檢測小鼠口腔癌分期 分別收集5組小鼠的舌體組織及頜下淋巴結(jié)組織,常規(guī)脫水包埋,連續(xù)5 μm切片,60 ℃烤片3 h。舌體組織切片進(jìn)行常規(guī)HE染色,光學(xué)顯微鏡下觀察各組病理學(xué)特點(diǎn)。頜下淋巴結(jié)組織切片行Pan-CK免疫組化染色,檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原,3% H2O2封閉處理,4 ℃下Pan-CK一抗(兔抗鼠多克隆抗體,博士德)孵育過夜,滴加二抗,室溫下孵育30 min,二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine,DAB)顯色。采用已知Pan-CK抗體陽性組織作為陽性對照,以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)代替一抗作為陰性對照。

    1.2.3 免疫組化法檢測VEGF表達(dá) 收集5組小鼠的頜下淋巴結(jié)組織,常規(guī)脫水包埋,連續(xù)5 μm切片,60 ℃烤片3 h。滴1滴骨髓溶液至載玻片,將骨髓溶液向載玻片的另一端方向推動涂抹,直至骨髓鋪完成膜,室溫下晾干,4%多聚甲醛固定,制作骨髓涂片。免疫組織化學(xué)染色采用常規(guī)SP法。淋巴結(jié)組織石蠟切片脫蠟復(fù)水,檸檬酸鹽緩沖液高壓修復(fù)抗原。骨髓涂片0.5% Triton X-100室溫下孵育10 min。淋巴結(jié)組織切片及骨髓涂片均用H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶。滴加VEGF一抗(兔單克隆抗體,濃度:1∶400,Abcam),4 ℃孵育過夜。滴加二抗,室溫下孵育30 min,滴加DAB顯色,鏡下觀察并控制顯色時間。以已知VEGF抗體陽性組織作為陽性對照,PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:VEGF表達(dá)于胞漿,以胞漿中出現(xiàn)明顯的棕黃色染色為陽性表達(dá)。

    1.2.4 共培養(yǎng)模型建立 使用0.4 μm孔徑聚碳酸酯膜的Transwell小室,置于24孔板中。提前1 d將人舌鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系(SAS細(xì)胞,購自南京科佰生物科技有限公司)種入下室中,細(xì)胞密度5×104/ml。將取得的A、B、C、D各組淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境樣本放入上室中進(jìn)行共培養(yǎng),作為實(shí)驗(yàn)組。將淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境置于上室中,下室不加入SAS細(xì)胞,僅有培養(yǎng)基作為對照組。均在共培養(yǎng)0 h、24 h、48 h、72 h后,收集微環(huán)境上清液,將上清液置入液氮中迅速冷凍,并保存于-80 ℃超低溫冰箱。共培養(yǎng)模型目的是模擬檢測VEGF的表達(dá)對骨髓、淋巴結(jié)中DTC影響,而E組已形成轉(zhuǎn)移癌,意味著DTC已增殖成瘤,因此未構(gòu)建E組共培養(yǎng)模型。由于每組僅取得1例樣本,未行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.5 液相芯片法檢測VEGF表達(dá) 按照VEGF液相芯片試劑盒(Thermo Invitrogen,美國)操作。取96孔板,每孔加50 μl預(yù)混微球,平放在磁性分離板上2 min后棄上清液,然后每孔加入1.2.4中的骨髓、淋巴結(jié)、共培養(yǎng)樣本及標(biāo)準(zhǔn)品各50 μl,室溫下振蕩反應(yīng)30 min,于4 ℃靜置過夜。棄上清液,每孔加入1×檢測抗體混合液25 μl,室溫震蕩反應(yīng)30 min,最后每孔加入SA-PE 50 μl。將96孔板從磁性分離板上取出,室溫震蕩反應(yīng)30 min,洗板后上機(jī)。采用Bio-Plex 200檢測系統(tǒng)檢測樣本的熒光強(qiáng)度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的熒光強(qiáng)度計(jì)算各樣本細(xì)胞因子濃度。判定方法:采用五參數(shù)非線性回歸的方式擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出濃度值。

    1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)(下四分位數(shù),上四分位數(shù))[M(P25,P75)]表示,組間比較采用秩和檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1各組小鼠舌部HE染色及頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色結(jié)果 HE染色結(jié)果顯示,A組、B組小鼠舌部未見病理改變;C組可見上皮釘突明顯增長,細(xì)胞呈多形性,出現(xiàn)有絲分裂;D組、E組細(xì)胞呈團(tuán)塊樣排列,中心部分可見角化珠。A、B、C、D組頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色呈陰性;E組可見淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶內(nèi)成片分布的Pan-CK陽性染色細(xì)胞,著色深,提示小鼠已發(fā)生口腔癌頜下淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見圖1。

    2.2各組小鼠骨髓中VEGF表達(dá)情況 VEGF免疫組化染色結(jié)果顯示,陽性染色細(xì)胞于胞漿內(nèi)著色,同一張玻片不同視野即可見陽性染色的細(xì)胞表達(dá)情況有明顯差異。骨髓涂片上骨髓細(xì)胞散在且分布稀疏,且由于不同視野下細(xì)胞數(shù)量及陽性表達(dá)細(xì)胞差距較大,因此難以進(jìn)行評估分析。見圖2。

    2.3各組小鼠頜下淋巴結(jié)中VEGF表達(dá)情況 VEGF免疫組化染色結(jié)果顯示,5組淋巴結(jié)均可見VEGF表達(dá),胞漿染色陽性。A組呈聚集分布;B組少許散在的點(diǎn)狀分布;C組陽性染色細(xì)胞較多,開始聚集;D組可見大量陽性染色細(xì)胞聚集;E組陽性染色的細(xì)胞呈大塊片狀聚集。見圖3。

    圖1 各組小鼠舌部HE染色及頜下淋巴結(jié)Pan-CK免疫組化染色所見(×200)

    ?VEGF陽性染色的細(xì)胞數(shù)量少,著色淺;?陽性染色的細(xì)胞數(shù)量多且著色深

    黑色箭頭所指為陽性染色

    2.4各組小鼠骨髓和淋巴結(jié)的VEGF表達(dá)比較 液相芯片法檢測結(jié)果顯示,對于淋巴結(jié)組織,A組VEGF表達(dá)水平顯著高于C組和D組(P<0.05),E組顯著高于C組(P<0.05),其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。對于骨髓組織,A組和B組VEGF表達(dá)水平顯著高于C組、D組和E組(P<0.05),其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。5組小鼠骨髓組織的VEGF表達(dá)水平均顯著高于淋巴結(jié)組織(P<0.05)。見表1。

    表1 各組小鼠骨髓和淋巴結(jié)的VEGF表達(dá)比較[M(P25,P75),pg/ml]

    2.5各組小鼠SAS細(xì)胞在不同時期淋巴結(jié)及骨髓微環(huán)境中各時間點(diǎn)VEGF的表達(dá)情況 共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,在A組、B組和C組時期的淋巴結(jié)和骨髓微環(huán)境中,SAS細(xì)胞在24~72 h時段內(nèi)的VEGF表達(dá)呈上升趨勢。而在D組時期淋巴結(jié)微環(huán)境中,SAS細(xì)胞在24~72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈下降趨勢,但在D組時期骨髓微環(huán)境中,SAS細(xì)胞在24~72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈上升趨勢。見表2。

    表2 各組小鼠SAS細(xì)胞在不同時期淋巴結(jié)及骨髓微環(huán)境中各時間點(diǎn)VEGF的表達(dá)情況(pg/ml)

    3 討論

    3.1Schwonzen等[10]的研究表明,骨髓涂片檢查不能如實(shí)反映骨髓情況。本實(shí)驗(yàn)的骨髓涂片免疫組化結(jié)果也顯示,在不同高倍鏡視野下,陽性染色的細(xì)胞表達(dá)差異較大。且受實(shí)驗(yàn)者操作的影響,不同涂片間的誤差也較大,導(dǎo)致其免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)果不可靠。Aguirre-Ghiso[11]認(rèn)為腫瘤休眠可分為免疫休眠、細(xì)胞休眠以及血管休眠。本課題組的前期研究[12]發(fā)現(xiàn),不同微環(huán)境對腫瘤細(xì)胞有著不同作用,可影響腫瘤細(xì)胞的增殖與休眠,最終被動形成淋巴道轉(zhuǎn)移的靶向性。Kazerounian和Lawler[13]的研究表明,血管休眠機(jī)制是指通過抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖和血管生長的因素,導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞缺氧和營養(yǎng)剝奪而使腫瘤細(xì)胞進(jìn)入休眠狀態(tài)。血管生成是腫瘤生長和進(jìn)展的標(biāo)志,腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移具有血管依賴性。另一方面,本課題組在研究過程中發(fā)現(xiàn)免疫介導(dǎo)的休眠參與了口腔癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移靶向性的形成。在口腔癌發(fā)生、發(fā)展直至轉(zhuǎn)移的過程中,小鼠骨髓內(nèi)CD4+/CD8+T細(xì)胞比值呈上升趨勢;而在淋巴結(jié)內(nèi),轉(zhuǎn)移癌期CD4+/CD8+T細(xì)胞比值下降,免疫失衡,造成機(jī)體識別和殺傷腫瘤細(xì)胞的能力下降。這種骨髓及淋巴結(jié)微環(huán)境中免疫狀態(tài)的差異,是使骨髓內(nèi)DTC保持休眠狀態(tài),而淋巴結(jié)內(nèi)DTC增殖的原因之一。Shiozawa等[14]研究發(fā)現(xiàn)骨髓中的造血干細(xì)胞可以分泌生長停滯特異性蛋白6(growth arrest specific protein 6,GAS6)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein 4,BMP4)、骨形成蛋白7(bone morphogenetic protein 7,BMP7)、轉(zhuǎn)化生長因子β2(transforming growth factor β2,TGFβ2)等,通過細(xì)胞休眠機(jī)制,可抑制骨髓內(nèi)DTC增殖成瘤。

    3.2Murrell等[15]認(rèn)為在微環(huán)境改變時,DTC被“喚醒”,從而在該微環(huán)境被動時發(fā)生了轉(zhuǎn)移。Nishida等[16]的研究表明,腫瘤的發(fā)生、發(fā)展依賴于新生血管的生成,腫瘤細(xì)胞可通過合成和分泌血管生成因子調(diào)節(jié)腫瘤組織的血管生成。VEGF不僅可作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體誘導(dǎo)血管形成,間接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長,而且還可通過作用于腫瘤細(xì)胞上的受體,直接促進(jìn)腫瘤生長。VEGF作為特異內(nèi)皮細(xì)胞的有絲分裂素,是主要的血管生成因子,可增加血管通透性,促進(jìn)腫瘤血管形成。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,經(jīng)成瘤干預(yù)8周小鼠的淋巴結(jié)組織的VEGF的表達(dá)水平先出現(xiàn)降低,但隨著病情的進(jìn)展,VEGF的表達(dá)水平又逐漸上升,并在轉(zhuǎn)移期達(dá)到最高水平。VEGF是腫瘤血管發(fā)生過程中的主要正性調(diào)控因子,通過促血管生成作用,參與腫瘤的發(fā)展過程。且由于淋巴結(jié)內(nèi)免疫失衡,缺乏骨髓內(nèi)存在的造血干細(xì)胞等因素,未能分泌相關(guān)抑制因子,因而未能抑制DTC增殖。VEGF在淋巴結(jié)組織的表達(dá)上升,促進(jìn)血管生成,增加淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)。

    3.3Lech-Maranda等[17]的研究表明VEGF能夠增加血管通透性,導(dǎo)致血漿蛋白和纖維蛋白及液體經(jīng)血管外滲而引起細(xì)胞外基質(zhì)改變,有效促進(jìn)血管和新基質(zhì)形成,為腫瘤侵襲及轉(zhuǎn)移提供基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,A組和B組骨髓組織的VEGF表達(dá)水平顯著高于C組、D組和E組。骨髓組織VEGF的表達(dá)降低可能是免疫功能增強(qiáng)及其他細(xì)胞因子共同作用的結(jié)果。而當(dāng)VEGF在骨髓內(nèi)的表達(dá)下降,血管生成受到抑制,使骨髓內(nèi)DTC處于血管休眠狀態(tài),未能形成骨髓轉(zhuǎn)移。盡管本研究液相芯片的結(jié)果顯示,小鼠骨髓組織的VEGF表達(dá)水平顯著高于淋巴結(jié)組織,但是由于淋巴結(jié)內(nèi)免疫失衡,且缺乏骨髓內(nèi)存在的造血干細(xì)胞,未能分泌相關(guān)抑制因子,故未能形成DTC免疫休眠及細(xì)胞休眠,因而不能抑制DTC增殖,并通過VEGF表達(dá)上升,血管生成增加而成瘤。而骨髓組織可通過免疫、細(xì)胞及血管休眠的協(xié)同作用使DTC處于休眠狀態(tài),抑制增殖成瘤。這與臨床上口腔癌多為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移,很少發(fā)生骨髓轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象相一致。

    3.4由于本課題組的前期研究[18]發(fā)現(xiàn)在中重度異常增生時期,DTC已經(jīng)進(jìn)入骨髓和淋巴結(jié)中,由此推測從該時期始,DTC可能已經(jīng)對組織微環(huán)境造成影響。在腫瘤發(fā)展及轉(zhuǎn)移時期,DTC數(shù)目增多,也是惡性程度不斷上升的細(xì)胞累積過程[19]。本研究中共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示,除D組時期骨髓微環(huán)境中SAS細(xì)胞在24~72 h時段內(nèi)的VEGF的表達(dá)呈下降趨勢外,在其余組別時期的骨髓或淋巴結(jié)微環(huán)境均促進(jìn)了SAS細(xì)胞在24~72 h時段內(nèi)VEGF的表達(dá)??紤]為由于D組時期骨髓組織中其他細(xì)胞因子的影響,抑制了VEGF的分泌,導(dǎo)致其表達(dá)下降,這可能也是口腔癌較少骨髓轉(zhuǎn)移的原因之一,有待進(jìn)一步開展研究驗(yàn)證。由于在轉(zhuǎn)移癌形成之前,微環(huán)境內(nèi)僅有散在分布的DTC,其可能僅影響細(xì)胞周圍微環(huán)境中VEGF的表達(dá),而對于整個淋巴結(jié)或骨髓微環(huán)境影響作用較小。隨著DTC累積增多,當(dāng)其對VEGF的促進(jìn)作用超過了微環(huán)境中其他因素抑制其表達(dá)的能力,VEGF則表達(dá)升高,從而促進(jìn)DTC團(tuán)塊血管生成[20,21]。DTC增殖和VEGF表達(dá)形成了相互促進(jìn)的機(jī)制。本研究結(jié)果顯示,無論是組織檢測還是共培養(yǎng),A組的VEGF表達(dá)均高于B組、C組和D組,這可能是由于4-NQO藥物對小鼠機(jī)體早期影響所造成,當(dāng)機(jī)體適應(yīng)了藥物的影響,VEGF逐漸隨疾病進(jìn)展持續(xù)升高。

    綜上所述,骨髓和淋巴結(jié)組織微環(huán)境可與DTC相互影響,共同作用,這可能是口腔癌淋巴道轉(zhuǎn)移的靶向性的機(jī)制之一。

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