枸櫞種質(zhì)對柑橘潰瘍病的抗性鑒定*

朱志媚，譚李梅，徐 靜，符紅艷，胡 哲，龔 蕾，楊貴兵，王 萍，馬先鋒，鄧子牛

（1 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，長沙410128）（2 國家柑橘改良中心長沙分中心）（3 郴州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所）

柑橘潰瘍病是阻礙柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的世界性檢疫病害，是由柑橘黃單胞桿菌柑橘亞種（Xanth-omonas citrisubsp.citri，Xcc）引起的[1]。選育抗病品種是防治潰瘍病的有效途徑，科學(xué)家在過去幾十年一直在尋找抗?jié)儾〉母涕倨贩N，但發(fā)現(xiàn)幾乎所有柑橘屬的栽培種接種Xcc 后均表現(xiàn)感病癥狀。對不同柑橘品種的抗?jié)儾∧芰Ψ治霭l(fā)現(xiàn)，橙類、柚類、檸檬等商用品種表現(xiàn)為不同程度的感病[2]，只有金柑屬的種質(zhì)表現(xiàn)為抗?jié)儾3-5]，故此前的抗?jié)儾∮N多用金柑屬品種作抗性材料進行研究[6-7]。但金柑屬和柑橘屬2 個不同屬的遺傳差異較大，用金柑類抗性資源與柑橘屬品種雜交，很難獲得農(nóng)藝性狀符合柑橘商品化生產(chǎn)需求的抗性品種，因此柑橘屬品種的抗?jié)儾⊙芯窟M展緩慢。

為尋找柑橘屬的抗性資源，豐富的野生柑橘種質(zhì)提供了可能性。野生柑橘種質(zhì)具有較強抗性，一般在田間不表現(xiàn)潰瘍病癥狀，接種潰瘍病菌后多會表現(xiàn)癥狀，但因其長期處在野生狀態(tài)，與栽培品種雜交很難獲得品質(zhì)優(yōu)良的抗病品種。經(jīng)過10 余年的篩選，Deng 等[8]鑒定出柑橘屬獨特的抗?jié)儾》N質(zhì)枸櫞C-05（Citrus medicaL.），為防治柑橘潰瘍病研究提供了重要的柑橘屬種質(zhì)。

枸櫞又名香櫞，與柚（C.grandisOsbeck）和寬皮柑橘（C.reticulataBlanco）被認為是柑橘屬種類品種起源的原始種[9-10]。枸櫞被認為起源于印度東北部及其鄰近地區(qū)[11]，但是，后來陸續(xù)發(fā)現(xiàn)我國也是枸櫞的起源中心之一，先后在我國報道枸櫞種質(zhì)有11 個類型，包括變種、品種和雜種[12]。枸櫞也是最早傳入歐洲的柑橘資源，引入歐洲后又衍生了不同的枸櫞種質(zhì)[11]，因此，長期的演化形成了豐富的遺傳多樣性。但是在柑橘物種的形成過程中，枸櫞一直只作父本[10-13]，可能使得枸櫞保存了原初的抗性。Das[14]指出枸櫞可能是一種抗?jié)儾≠Y源；通過田間活體針刺接種法接種潰瘍病菌，胡青波等[15]發(fā)現(xiàn)其對潰瘍病的抗病性表現(xiàn)差異。長期的人工接種和田間自然接種結(jié)果顯示枸櫞C-05 是柑橘屬獨特的抗?jié)儾》N質(zhì)，為了進一步探明枸櫞C-05 的抗病機理，需要對更多的枸櫞類種質(zhì)進行抗病性評價。本研究收集了14 份枸櫞種質(zhì)，初步比較了它們的葉片形態(tài)學(xué)特征，以顯示枸櫞之間的種質(zhì)多樣性，進而對其進行離體和活體接種潰瘍病菌，全面評價其抗病性，以期獲得更多的抗病種質(zhì)資源，為后續(xù)抗病基因的挖掘和枸櫞抗病機理的探究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以枸櫞C-05 和園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、丹娜香櫞、普通香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、小香櫞、野生香櫞、大香櫞、印度大果、爪哇檸檬14 份枸櫞種質(zhì)為試材（表1），以極感病種質(zhì)‘冰糖橙’為對照。所有參試種質(zhì)均從國家柑橘改良中心長沙分中心、國家柑橘資源圃（重慶）采集接穗，嫁接在枳砧上，在病理溫室培育2 年后用于形態(tài)學(xué)觀察和潰瘍病菌接種鑒定。

表1 參與鑒定的14 份枸櫞種質(zhì)和對照‘冰糖橙’的名稱和來源

1.2 葉片形態(tài)學(xué)的觀察

在枸櫞種質(zhì)的1 年生春梢上采取生長一致、達到最大葉面積時的葉片，每株測定3 片葉，單葉重復(fù)。觀測葉片形狀、有無翼葉，用游標卡尺測量葉片最大長度和最大寬度、葉尖長度（葉片靠葉尖部1/3 處長度）和葉尖寬度（葉片靠葉尖部1/3 長度處的寬度），并計算葉形指數(shù)（葉長/葉寬）、葉尖指數(shù)（葉尖長/葉尖寬）[16-17]。

1.3 柑橘潰瘍病菌的制備

將已保存的潰瘍病菌 XccDL509 菌系[18]從-80 ℃超低溫冰箱取出，然后通過劃線接種于LB固體培養(yǎng)基（含10 g/L 蛋白胨、5 g/L 酵母提取物、10 g/L 氯化鈉、15 g/L 瓊脂），在28 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)72 h 左右，挑取單菌落至20 mL 的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在28 ℃和200 r/min 搖床中振蕩培養(yǎng)18～24 h，將得到的菌液通過分光光度計調(diào)整OD600至1.0[19]。用無菌水重懸菌體，并用平板計數(shù)法計算菌液濃度后[20]，繼續(xù)用無菌水調(diào)節(jié)菌液濃度至103、104、105、106cfu/mL，用于接種。

1.4 離體注射接種

每個種質(zhì)采集3 片生長一致、達到最大葉面積之前的新葉，放入自封袋并做好標記。接種前用酒精棉擦拭葉片正、背面，待酒精揮發(fā)后，將葉片輕輕翻轉(zhuǎn)呈葉背朝上，用1 mL 注射器將重懸潰瘍病菌液注入葉肉組織。每個點注射的量以兩側(cè)脈間的葉肉組織完全浸潤為準（注射量約為10 μL）[19]。每片葉注射5 個點，分別注射103、104、105、106cfu/mL和無菌水，注射后均用吸水紙擦干葉表殘留菌液。葉片注射結(jié)束后，將材料統(tǒng)一放置在墊有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，在葉柄處包裹濕潤棉花，將培養(yǎng)皿置于（28±2）℃、光照強度為2 000～3 000 lx、光周期為16 h/d 的植物培養(yǎng)室中，持續(xù)20 d 觀察其發(fā)病情況。離體接種試驗重復(fù)2 次。

1.5 活體注射接種

每個種質(zhì)在嫁接生長良好的活體植株上，選擇3 片達到最大葉面積前的新葉，直接在葉片上接種潰瘍病菌，活體注射接種與離體注射接種方法一致，注射結(jié)束后，將材料統(tǒng)一放置在溫度為（28±2）℃、空氣相對濕度為60%～80%的病理溫室中持續(xù)觀察30 d，并統(tǒng)一肥水管理?；铙w接種試驗重復(fù)6 次。

1.6 離體與活體接種病情指數(shù)統(tǒng)計及分級

接種后定期觀察病情的發(fā)展進程，離體接種觀察到接種后第20 d，活體接種觀察到接種后第45 d。參考崔華威等[21]的方法，采用Photoshop 和游標卡尺分別統(tǒng)計103、104、105、106cfu/mL 潰瘍病菌接種區(qū)域的典型病斑數(shù)量、病斑大小，并計算病斑面積占接種區(qū)面積的比率，沒有典型病斑的抗性反應(yīng)區(qū)的壞死斑點數(shù)、壞死斑面積及其與接種區(qū)面積比率也進行統(tǒng)計和計算，但不作為典型病斑計入。分別賦予典型病斑數(shù)量、病斑區(qū)與接種區(qū)比率權(quán)重為0.5、0.5，根據(jù)病斑數(shù)量、病斑區(qū)與接種區(qū)比率，對潰瘍病的抗性病癥級別均可分為0、1、2、3、4、5 級。參考李建揮[22]的方法，統(tǒng)計每個濃度的病情指數(shù)、綜合病情指數(shù)，計算平均綜合病情指數(shù)。

病情指數(shù)＝［∑（該級病葉數(shù)×該級代表值）/（調(diào)查葉片數(shù)×發(fā)病最高級代表值）］×100

綜合病情指數(shù)＝（典型病斑數(shù)量的病情指數(shù)×0.5）+（病斑區(qū)與接種區(qū)比率的病情指數(shù)×0.5）

根據(jù)平均綜合病情指數(shù)，將枸櫞種質(zhì)分為以下5 類：極抗（HR），病情指數(shù)＜10；抗?。≧），10≤病情指數(shù)≤30；感?。⊿），30＜病情指數(shù)≤70；極感（HS），病情指數(shù)＞70。

1.7 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)運用SPSS 17.0 軟件進行統(tǒng)計和差異顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸櫞種質(zhì)葉片形態(tài)差異比較

對14 份枸櫞種質(zhì)生長一致、達到最大葉面積的葉片進行形態(tài)學(xué)觀察，供試14 份枸櫞種質(zhì)新葉顏色均為綠色，多數(shù)枸櫞種質(zhì)均無明顯翼葉，只有木里香櫞有較大翼葉，印度大果有較小的翼葉。葉片形狀差異較大（圖版2-A、表2），其中園香櫞、矮果香櫞、丹娜香櫞、長果香櫞、小香櫞、大香櫞、印度大果、爪哇檸檬的葉片形狀較相似，呈卵圓形；枸櫞C-05 與美國香櫞、普通香櫞、南川香櫞、野生香櫞的葉片呈長橢圓形；木里香櫞的葉基部寬，呈近梨形。部分枸櫞種質(zhì)之間的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)存在顯著差異，枸櫞C-05 和大香櫞的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最大，小香櫞、印度大果和爪哇檸檬的最?。ū?）。供試14 份枸櫞種質(zhì)葉片形態(tài)存在差異，表明枸櫞種質(zhì)之間具有多樣性，這種差異也可能決定它們對潰瘍病的抗感性差異。

2.2 枸櫞種質(zhì)離體接種的觀察與抗性綜合評價

枸櫞種質(zhì)在離體接種潰瘍病菌后，定期觀察葉片癥狀至第20 d，在接種103cfu/mL 的潰瘍病菌后，丹娜香櫞、長果香櫞和小香櫞的發(fā)病程度最嚴重，接種反應(yīng)為成片病斑，并在接種柑橘潰瘍病菌區(qū)域出現(xiàn)病斑凸起，病癥級別在4～5 級，病斑區(qū)占接種區(qū)面積的64.80%～84.95%，比感病品種‘冰糖橙’癥狀還嚴重；其次發(fā)病程度較嚴重的是南川香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬，接種區(qū)出現(xiàn)點狀病斑，病斑周圍帶有明顯黃色暈圈，病斑區(qū)占接種區(qū)面積的0.59%～20.75%，病癥級別為1～2 級，與感病品種‘冰糖橙’病癥相似；矮果香櫞接種區(qū)出現(xiàn)葉面內(nèi)陷，接種反應(yīng)為大片壞死；園香櫞、美國枸櫞的接種區(qū)出現(xiàn)成片變色，是細胞壞死的表現(xiàn)；枸櫞C-05、普通枸櫞和印度大果的接種區(qū)病斑褐化，接種反應(yīng)為點狀壞死（圖版2-B，表3）。

表2 14 份枸櫞種質(zhì)葉片形態(tài)特征

表3 枸櫞種質(zhì)離體接種潰瘍病平均綜合病情指數(shù)分析

在104cfu/mL 及更高濃度潰瘍病菌接種區(qū)域觀察發(fā)現(xiàn)，丹娜香櫞、長果香櫞和小香櫞的發(fā)病程度更嚴重；其次是南川香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬，與‘冰糖橙’一樣，病癥加重；園香櫞、美國香櫞、普通枸櫞和印度大果與抗病種質(zhì)枸櫞C-05 相似，表現(xiàn)出組織壞死，壞死部分隨接種濃度增高而加大（圖版2-B，表3）。

綜合比較離體接種各濃度潰瘍病菌的癥狀及其平均綜合病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)，枸櫞C-05、園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞和普通枸櫞的綜合病情指數(shù)為0，為極抗病類；印度大果的平均綜合病情指數(shù)在20～30 范圍內(nèi)，屬于抗病類；木里香櫞和大香櫞的綜合指數(shù)在50～70 范圍內(nèi)，屬于感病類；丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、小香櫞、野生香櫞、爪哇檸檬和‘冰糖橙’的平均綜合病情指數(shù)高于70，表現(xiàn)為極感?。ū?）。

2.3 枸櫞種質(zhì)活體接種的觀察與抗性綜合評價

枸櫞種質(zhì)活體接種潰瘍病菌后，每天觀察葉片的癥狀至接種后第45 d。接種后第9 d（圖版3-C），多數(shù)種質(zhì)在低濃度菌液（103、104cfu/mL）接種區(qū)域開始表現(xiàn)反應(yīng)，高濃度菌液（105、106cfu/mL）接種區(qū)域有較大面積的反應(yīng)區(qū)域，但是還不能清晰地辨別抗病反應(yīng)和感病癥狀；到接種后第15 d（圖版3-D），不同菌液濃度接種后的組織壞死等抗病反應(yīng)和病斑凸起等感病癥狀已經(jīng)比較明顯，初步可以辨別抗病和感病種質(zhì)，但仍然不是很清晰；至接種后第25 d（圖版3-E），抗病反應(yīng)和感病癥狀已經(jīng)穩(wěn)定，后續(xù)的觀察沒有抗病或感病程度的變化，因而以接種后第25 d 的觀察結(jié)果為最終判定，確定不同枸櫞種質(zhì)的抗病、感病程度。

接種后第25 d，接種103cfu/mL 潰瘍病菌后，丹娜香櫞和大香櫞的發(fā)病最快，發(fā)病程度最嚴重，接種反應(yīng)為6 個以上的點狀病斑，并在接種柑橘潰瘍病菌區(qū)域出現(xiàn)火山口狀或點狀病斑凸起，出現(xiàn)病斑破裂，病癥級別在3～4 級，病斑面積占接種區(qū)面積的9.97%～20.70%，比感病品種‘冰糖橙’發(fā)病還嚴重；其次發(fā)病程度較嚴重的是南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞和爪哇檸檬，接種區(qū)出現(xiàn)1～4 個點狀病斑，病斑周圍帶有明顯黃色暈圈，病斑面積占接種區(qū)面積的0.56%～10.70%，病癥級別為2 級，與感病品種‘冰糖橙’的病癥相似；小香櫞出現(xiàn)點狀病斑凸起，病斑面積占接種區(qū)面積的0.96%，病癥級別為1 級；園香櫞、矮果香櫞、美國香櫞和印度大果的接種區(qū)出現(xiàn)病斑褐化，為點狀病斑壞死，與極抗病種質(zhì)枸櫞C-05 相似；普通枸櫞在接種區(qū)無明顯病斑（圖版3-E，表4）。

表4 枸櫞種質(zhì)活體接種潰瘍病平均綜合病情指數(shù)分析

在104cfu/mL 潰瘍病菌及更高濃度潰瘍病菌接種區(qū)域觀察發(fā)現(xiàn)，丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬與‘冰糖橙’一樣，發(fā)病程度更嚴重；其次是小香櫞病癥加重；園香櫞、矮果香櫞、美國香櫞、普通枸櫞和印度大果與極抗病種質(zhì)枸櫞C-05 相似，表現(xiàn)出組織壞死，壞死部分隨接種濃度增高而加大，高濃度接種區(qū)域最終表現(xiàn)褐化失色（圖版3-E，表4）。

綜合比較活體接種各濃度癥狀及其平均綜合病情指數(shù)發(fā)現(xiàn)（表4），園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、普通枸櫞、印度大果的綜合病情指數(shù)均為0，與枸櫞C-05 抗病性接近，屬于極抗病；其他枸櫞種質(zhì)對潰瘍病皆表現(xiàn)為感病或極感病，其中小香櫞的綜合病情指數(shù)介于50～70 之間，屬于感病，丹娜香櫞、南川香櫞、長果香櫞、木里香櫞、野生香櫞、大香櫞、爪哇檸檬的綜合病情指數(shù)都在70 以上，與‘冰糖橙’相似，屬于極感病。

2.4 枸櫞種質(zhì)活體接種的葉片病癥分析

在活體接種潰瘍病菌后第25 d，以104cfu/mL潰瘍病菌接種枸櫞種質(zhì)的癥狀，分析了不同枸櫞表現(xiàn)的癥狀特征，測量了接種區(qū)域的單個獨立病斑的大?。▓D1），結(jié)果顯示，大香櫞和丹娜香櫞病斑最大，火山口狀凸起的典型癥狀的病斑直徑在4.5 mm 以上，病斑融合，有明顯的黃色暈圈；爪哇檸檬、野生香櫞、長果香櫞、南川香櫞與‘冰糖橙’相似，也形成典型的火山口狀凸起，并帶有黃色暈圈，潰瘍病病斑直徑在3.5 mm 以上，并有病斑融合成大病斑塊的現(xiàn)象；小香櫞出現(xiàn)火山口狀凸起病斑，直徑為2.5～3.0 mm，但未發(fā)現(xiàn)明顯的融合現(xiàn)象；木里香櫞病斑直徑為1.7 mm，病斑突起但沒有黃色暈圈；印度大果、矮果香櫞和園香櫞褐化壞死病斑直徑為1.5～2.5 mm，未形成火山口狀潰瘍病癥狀；美國枸櫞和普通枸櫞的壞死病斑直徑在1.5 mm 以下；而枸櫞C-05 在104cfu/mL 接種區(qū)域只表現(xiàn)出壞死的顆粒狀斑點。

圖1 枸櫞種質(zhì)活體接種在25 d 時病斑大小

3 討論與結(jié)論

本研究對不同枸櫞種質(zhì)的離體與活體接種潰瘍病菌的鑒定結(jié)果基本一致，除3 個種質(zhì)在感病和抗病程度上有差異外，沒有實質(zhì)性的差異，說明枸櫞對潰瘍病抗性鑒定結(jié)果是比較穩(wěn)定的。離體鑒定的感病種質(zhì)癥狀比活體鑒定的發(fā)病快，有些感病種質(zhì)的癥狀表現(xiàn)較嚴重，可能是離體環(huán)境濕度與溫度偏高導(dǎo)致感病種質(zhì)癥狀嚴重，但是離體葉片能保存的時間有限，不能作為最終鑒定結(jié)果。活體接種的葉片比離體接種的葉片觀察時間更持久，本研究一直觀察到接種后第45 d，部分感病葉片落葉后才停止觀察，但是在接種第25 d 后癥狀基本穩(wěn)定，沒有出現(xiàn)新的發(fā)病癥狀，在穩(wěn)定的溫濕度條件下，活體接種第25 d 后基本可以判斷種質(zhì)的抗病或感病程度。因此，本研究結(jié)果表明，離體接種結(jié)果可以快速篩選，而活體接種結(jié)果更為準確。

研究柑橘潰瘍病的抗性對柑橘種質(zhì)資源的保存、珍稀品種的保護和今后抗病育種工作具有重要意義。枸櫞C-05 是目前已報道的對柑橘潰瘍病具有穩(wěn)定抗性的柑橘屬特異種質(zhì)資源[8]。前人對枸櫞的研究多用于果皮內(nèi)含物，作為原始種抗病方面研究較少。王亞飛等利用香櫞研究柑橘衰退病[23]；胡青波等[15]在田間試驗發(fā)現(xiàn)6 個枸櫞類品種與感病品種‘冰糖橙’之間均存在差異，故采用針刺涂菌接種法對其進行抗病性鑒定，小香櫞、爪哇檸檬、大香櫞、連南檸檬、廣東香櫞均表現(xiàn)出感病的癥狀，只是癥狀的嚴重程度都不及感病的‘冰糖橙’，且發(fā)病時間明顯比‘冰糖橙’緩慢，與本研究注射接種鑒定結(jié)果一致，小香櫞、大香櫞和爪哇檸檬都表現(xiàn)感病，針刺涂菌接種法比本研究結(jié)果感病程度相對較輕，可能由于針刺涂菌接種法進入葉片的菌量少或者接種濃度不一致，所表現(xiàn)的癥狀表現(xiàn)也不太一致，也有可能田間環(huán)境濕度與溫度變化差異大，感病癥狀表現(xiàn)不明顯。本研究采用注射接種4 個潰瘍病菌濃度進行鑒定，低濃度可以比較清晰地區(qū)別感病和抗病種質(zhì)，但是103cfu/mL 潰瘍病菌引起的病癥反應(yīng)要比104cfu/mL 潰瘍病菌慢；高濃度（105～106cfu/mL）的潰瘍病菌接種，病癥形成快，但通常形成大塊病斑，或大面積壞死，不易比較不同程度的感病或抗病性，因此，以104cfu/mL 的潰瘍病菌作為接種濃度是比較合適的。

葉尖指數(shù)和葉形指數(shù)為重要的形態(tài)學(xué)標記[24]，孫珍珠等[25]發(fā)現(xiàn)不同寬皮柑橘品種的葉片形態(tài)差異顯著。譚李梅等[26]研究發(fā)現(xiàn)，檸檬合子胚與珠心胚葉尖指數(shù)無差異，葉形指數(shù)存在顯著差異，但不能作為區(qū)分合子胚與珠心胚實生苗的葉片形態(tài)學(xué)標記。本研究14 份枸櫞種質(zhì)的葉形指數(shù)和葉尖指數(shù)也存在顯著性差異，小香櫞、印度大果和爪哇檸檬的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最小，葉片較相似，均呈卵圓形，而小香櫞和爪哇檸檬屬于感病種質(zhì)，印度大果屬于抗病種質(zhì)；枸櫞C-05 與美國枸櫞和普通枸櫞葉形較相似，呈長橢圓形，均屬抗病種質(zhì)；枸櫞C-05 和大香櫞的葉形指數(shù)與葉尖指數(shù)最大，枸櫞C-05 極抗病，而大香櫞感病。因此，枸櫞種質(zhì)之間葉形態(tài)具有差異，但與抗病性差異無關(guān)，推測有些枸櫞種質(zhì)葉片較相似可能與其親緣性較近相關(guān)。

前期的研究表明，不同柑橘種類或品種對潰瘍病抗性變化較大[27-28]，并且同一柑橘種類的不同品種的抗病性表現(xiàn)也不一致，對于潰瘍病的抗病性表現(xiàn)相差數(shù)十倍以上[2]，與本研究結(jié)果相似。總之，本研究鑒定出與枸櫞C-05具有類似抗性的園香櫞、矮果香櫞、美國枸櫞、普通枸櫞和印度大果，可為抗病基因的挖掘和抗病育種提供更多的種質(zhì)資源。枸櫞種質(zhì)之間對潰瘍病呈現(xiàn)極大的抗性差異，這種差異與其形態(tài)無關(guān)，說明枸櫞C-05 的抗病性不是枸櫞的非寄主抗性，抗病的幾個枸櫞是具有內(nèi)在的獨特抗病性，這對后續(xù)利用枸櫞C-05 及其他抗病枸櫞種質(zhì)探明抗病機理和抗病育種有重要意義。