膜性腎病與非編碼RNA

車秀清 米 焱 王彩麗

膜性腎病(membranous nephropathy，MN)是一種腎臟特異性的自身免疫性疾病，是成人腎病綜合征常見的病理類型之一，約1/3的MN患者會(huì)進(jìn)展為終末期腎病(end-stage renal disease，ESRD)。目前，MN的確診仍依靠腎穿刺活組織檢查(簡(jiǎn)稱活檢)，以監(jiān)測(cè)病情變化和治療效果，但因其為有創(chuàng)檢查，不便反復(fù)進(jìn)行，因此仍需要不斷積極探索MN的發(fā)病機(jī)制和新型生物標(biāo)志物，非編碼RNA(non-coding RNA, ncRNA)研究的不斷深入為闡明MN的發(fā)生機(jī)制提供了思路，也為MN的診斷和治療帶來(lái)了希望。

1 MN的發(fā)病機(jī)制

MN的病理學(xué)特征表現(xiàn)為腎小球基底膜上皮細(xì)胞下免疫復(fù)合物沉積伴基底膜彌漫增厚。其中大多數(shù)病因不明的MN被稱為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy, IMN)或原發(fā)性膜性腎病(primary membranous nephropathy，PMN)，而由自身免疫性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡等)、感染、腫瘤、代謝性疾病、藥物等引起的MN被稱為繼發(fā)性膜性腎病(secondary membranous nephropathy，SMN)。IMN的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制尚未完全明確，可能有多重因素參與。近年來(lái)，IMN特定抗原的發(fā)現(xiàn)促進(jìn)了IMN的機(jī)制研究和診斷。研究發(fā)現(xiàn)，多種足細(xì)胞膜抗原如M型磷脂酶A2受體(PLA2R)[1-2]、Ⅰ型血小板反應(yīng)蛋白7A域(THSD7A)[3]、中性肽鏈內(nèi)切酶(NEP)[4]與IMN的發(fā)生有關(guān)。血清中超氧化物歧化酶(SOD2)、醛糖還原酶(AR)、α-烯醇化酶(α-ENO)等細(xì)胞內(nèi)抗原也可能是導(dǎo)致IMN發(fā)生的抗原成分[5]。其中PLA2R1抗體(PLA2R1-Ab)水平與疾病活動(dòng)和緩解、藥物治療反應(yīng)[6]、腎移植后疾病復(fù)發(fā)[7]相關(guān)，并且可以預(yù)測(cè)腎臟長(zhǎng)期預(yù)后[8-9]，血清PLA2R1-Ab檢測(cè)已應(yīng)用于IMN的臨床診斷和治療。此外，遺傳易感性[10]、環(huán)境因素[11]、補(bǔ)體激活[12]等也與IMN的發(fā)生有關(guān)。

2 ncRNA的分類

人類基因組中只有約1.5%可以編碼為蛋白質(zhì)，絕大部分轉(zhuǎn)錄為ncRNA，ncRNA是一類不能編碼蛋白質(zhì)而在轉(zhuǎn)錄前或轉(zhuǎn)錄水平發(fā)揮生物學(xué)功能的RNA，包括核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)、轉(zhuǎn)運(yùn)RNA(transfer RNA，tRNA)、小核RNA(small nuclear RNA,snRNA)、小核仁RNA(small nucleolar RNA，snoRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)、微RNA(microRNA，miRNA)和小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)等。

隨著基因測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的發(fā)展，ncRNA的種類不斷被完善，其生物學(xué)功能也逐漸受到重視，成為近年來(lái)生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)，其中對(duì)miRNA的研究較為豐富。許多研究結(jié)果表明，ncRNA在細(xì)胞生命活動(dòng)中發(fā)揮著重要作用，并且ncRNA表達(dá)失調(diào)與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程有關(guān)，也可能參與了多種腎病的病理生理過程。探究ncRNA與MN的關(guān)系有利于闡明MN的發(fā)病機(jī)制，為治療MN提供新的治療靶點(diǎn)。ncRNA在血液、尿液中穩(wěn)定存在，可無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，并且在不同腎臟疾病中的表達(dá)有相對(duì)特異性，因此有望成為診斷IMN的新的無(wú)創(chuàng)生物學(xué)標(biāo)志物，并有助于監(jiān)測(cè)IMN病情發(fā)展，以及評(píng)估療效和預(yù)后。

3 MN與ncRNA

3.1 MN與miRNA miRNA是一類廣泛存在于真核生物中的內(nèi)源性非編碼小分子單鏈RNA，通常由21～25個(gè)核苷酸組成，具有高度保守性，其本身不具有開放閱讀框架，通過參與轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控影響機(jī)體的病理生理過程，與細(xì)胞發(fā)育、分化、增殖、凋亡，以及免疫調(diào)節(jié)、腫瘤發(fā)生等有關(guān)[13]。

miRNA在人體的各個(gè)組織和器官中廣泛表達(dá)，一個(gè)miRNA可調(diào)控多個(gè)靶基因，每個(gè)靶基因可受多個(gè)miRNA調(diào)控，從而構(gòu)成了復(fù)雜的miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。大多數(shù)miRNA表達(dá)具有組織特異性和發(fā)育階段特異性，不同組織中miRNA的表達(dá)譜和表達(dá)量有差異，且在疾病發(fā)生、發(fā)展的不同階段表達(dá)譜也存在差異。由于miRNA在不同腎臟疾病中存在特異性表達(dá)，以及其在不同腎臟疾病中所起的作用不同，調(diào)控miRNA表達(dá)水平成為治療腎臟疾病的潛在方法。

許多研究已經(jīng)證明，MN患者的血液、尿液和腎組織中的miRNA表達(dá)與正常人群存在差異。Chen等[14]利用高通量測(cè)序技術(shù)在全基因組范圍內(nèi)對(duì)MN患者組和正常對(duì)照組外周血淋巴細(xì)胞(PBLC)中miRNA表達(dá)譜進(jìn)行了分析，兩組間共有326個(gè)miRNA的表達(dá)有顯著差異，包括286個(gè)下調(diào)的miRNA和40個(gè)上調(diào)的miRNA。失調(diào)的miRNA可能在MN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用。一項(xiàng)研究[15]發(fā)現(xiàn)，MN患者尿液中的miRNA-193a較正常者表達(dá)明顯上調(diào)，隨著IMN嚴(yán)重程度的增加，尿液中miRNA-193a的表達(dá)也明顯上調(diào)；此外，miRNA-193a的表達(dá)與蛋白尿水平顯著相關(guān)，miRNA-193a過表達(dá)往往也預(yù)示著腎臟存活率低。Zhou等[16]的研究結(jié)果則表明，MN患者外周血和尿miRNA-195-5p、miRNA-192-3p表達(dá)增多，miRNA-328-5p表達(dá)減少，其相應(yīng)的靶基因PPM1A、RAB1A和BRSK1的表達(dá)則呈相反的變化，推測(cè)這3個(gè)基因可能通過炎癥和凋亡相關(guān)通路參與MN，如PPM1A和BRSK1可以通過參與MAPK相關(guān)的信號(hào)途徑，RAB1A可以通過涉及p53信號(hào)途徑(CDK1-RAB1A)與MN相關(guān)聯(lián)，提示這些miRNA及其靶基因作為診斷MN的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

研究[17]發(fā)現(xiàn)，MN患者腎組織的miRNA-186表達(dá)明顯下調(diào)，體外實(shí)驗(yàn)也證明miRNA-186通過Toll樣受體4(TLR4)、P2X7和半胱天冬酶3(caspase-3)參與足細(xì)胞凋亡。 Li等[18]的研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-217通過靶向腫瘤壞死因子超家族成員11(tumor necrosis factor superfamily member 11，TNFSF11)促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而參與MN的發(fā)病機(jī)制。該研究在MN患者的腎臟組織和血漿中均檢測(cè)到miRNA-217的表達(dá)量明顯下調(diào)，同時(shí)腎臟組織中TNFSF11基因和蛋白質(zhì)表達(dá)量明顯上調(diào)；此外，通過體外轉(zhuǎn)染miRNA-217干擾載體到足細(xì)胞，使miRNA-217表達(dá)下調(diào)，同時(shí)TNFSF11基因表達(dá)量明顯上調(diào)，證實(shí)了TNFSF11是miRNA-217的靶基因，進(jìn)一步證明了miRNA-217誘導(dǎo)足細(xì)胞發(fā)生凋亡。這些研究結(jié)果提示，miRNA可通過促進(jìn)足細(xì)胞的凋亡導(dǎo)致MN的發(fā)生。

3.2 MN與lncRNA lncRNA是一類長(zhǎng)度>200個(gè)核苷酸的RNA，由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄而來(lái)，不具有編碼蛋白質(zhì)的能力。lncRNA亦可通過不同的作用機(jī)制在基因表達(dá)的各個(gè)階段發(fā)揮重要作用，其調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)染色質(zhì)的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄，在細(xì)胞質(zhì)中調(diào)節(jié) mRNA的穩(wěn)定性、翻譯和翻譯后修飾(PTM)[19]。lncRNA在表觀遺傳、轉(zhuǎn)錄，以及轉(zhuǎn)錄后水平等多層面調(diào)控基因的表達(dá)，與細(xì)胞分化和組織發(fā)育、染色體劑量補(bǔ)償、染色質(zhì)重構(gòu)、基因組印記等有關(guān)，參與動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、心肌梗死等心血管疾病和多種腫瘤疾病[20]。

近年來(lái)，lncRNA與腎臟疾病的研究逐漸增多，lncRNA被報(bào)道與多種腎小球疾病相關(guān)，如糖尿病腎病、局灶性節(jié)段性腎小球硬化、狼瘡腎炎等，并參與了急性腎損傷、CKD、常染色體顯性遺傳多囊腎病、腎結(jié)石、尿酸性腎病等多種小管間質(zhì)疾病[21]。

目前，關(guān)于MN與lncRNA的研究較少，被發(fā)現(xiàn)表達(dá)異常的lncRNA主要為X(染色體)失活特異性轉(zhuǎn)錄物 (X-inactive specific tran，XIST)。XIST是由X-失活中心(Xic)基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的一種與X染色體失活有關(guān)的lncRNA。Huang等[22]發(fā)現(xiàn)lncRNAXIST和NEAT1在MN小鼠模型的腎小管上皮細(xì)胞和腎小球細(xì)胞中表達(dá)均顯著上調(diào)，并且與MN的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。脂多糖(lipopolysides, LPS)誘導(dǎo)小鼠腎臟足細(xì)胞損傷后，足細(xì)胞中XIST水平穩(wěn)定升高，但NEAT1水平未升高。進(jìn)一步檢測(cè)MN小鼠和腎小球腎炎患者(包括MN)的尿液，發(fā)現(xiàn)XIST水平明顯升高，并且尿XIST濃度與MN的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，XIST的調(diào)控可能受到翻譯后修飾的控制，因?yàn)镸N小鼠腎臟中組蛋白27氨基酸三甲基化(H3K27me3)水平顯著下調(diào)，染色質(zhì)免疫沉淀實(shí)驗(yàn)也顯示XIST啟動(dòng)子區(qū)H3K27me3水平下降，提示當(dāng)MN被誘導(dǎo)時(shí)，XIST啟動(dòng)子H3K27me3的水平降低導(dǎo)致XIST水平升高。因此，尿液中XIST是MN的潛在生物標(biāo)志物。

足細(xì)胞凋亡是MN發(fā)生的關(guān)鍵過程，血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)可誘導(dǎo)足細(xì)胞的凋亡。Jin等[23]發(fā)現(xiàn)，AngⅡ通過上調(diào)TLR4表達(dá)促進(jìn)MN足細(xì)胞凋亡，同時(shí)再次驗(yàn)證了在MN腎組織中XIST表達(dá)明顯上調(diào)，而XIST表達(dá)下調(diào)可逆轉(zhuǎn)AngⅡ誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，同時(shí)MN腎組織中miRNA-217的表達(dá)顯著下降，TLR4水平升高，由此推測(cè)XIST可能是通過miRNA-217負(fù)性調(diào)節(jié)足細(xì)胞中TLR4的表達(dá)。該實(shí)驗(yàn)也證明了下調(diào)XIST表達(dá)可激活miRNA-217/TLR4通路改善足細(xì)胞凋亡，從而改善MN，為MN的治療提供了有效的靶點(diǎn)。

3.3 MN與circRNA circRNA是一類特殊的閉合環(huán)狀的內(nèi)源性ncRNA，與線性RNA不同，circRNA沒有典型的5’帽子結(jié)構(gòu)和3’polyA尾，故不被核酸外切酶所識(shí)別，且其為共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的穩(wěn)定性。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，被發(fā)現(xiàn)的circRNA的種類逐漸增多，其與多種疾病的關(guān)聯(lián)也逐漸引起人們的關(guān)注，目前已發(fā)現(xiàn)circRNA在神經(jīng)系統(tǒng)疾病[24]、心血管疾病[25]、骨關(guān)節(jié)炎[26]、糖尿病[27]、自身免疫性疾病[28]，以及各種腫瘤疾病中異常表達(dá)。

關(guān)于circRNA與腎臟疾病的研究較少，circRNA主要作為miRNA的分子海綿發(fā)揮調(diào)控作用。Luan等[29]發(fā)現(xiàn)，與正常組相比，狼瘡性腎炎(lupus nephritis，LN)患者腎臟中circHLA-C水平較正常組顯著升高，miRNA-150顯著下降，并且circHLA-C與miRNA-150呈負(fù)相關(guān)趨勢(shì)；此外，在circHLA-C和miRNA-150之間顯示了一種完全匹配的結(jié)合序列的種子，推測(cè)circHLA-C可能是通過調(diào)控miRNA-150表達(dá)在LN發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。Hu等[30]在糖尿病模型小鼠和暴露于高糖環(huán)境的小鼠系膜細(xì)胞中均檢測(cè)到circRNA_15698表達(dá)上調(diào)，同時(shí)證實(shí)circRNA_15698通過充當(dāng)miRNA-185的分子海綿，調(diào)節(jié)TGF-β1蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)相關(guān)的蛋白質(zhì)合成。

MN與circRNA的相關(guān)報(bào)道較少。最近一項(xiàng)研究[31]發(fā)現(xiàn)，MN患者外周血中circRNA表達(dá)與正常人存在差異，其中circ_101319表達(dá)明顯上調(diào)，其可能通過調(diào)控miRNA參與了MN相關(guān)通路，并且在預(yù)測(cè)MN方面具有良好的靈敏度和強(qiáng)度，有望成為新的MN診斷標(biāo)志物，為靶向基因治療提供新的工具。另外，Ma等[32]的研究證實(shí)，與健康對(duì)照組相比，IMN患者血清和尿液外泌體中circRNA均存在差異表達(dá)，IMN患者血清外泌體中circRNA的種類減少，以內(nèi)含子區(qū)來(lái)源為主。其中89個(gè)circRNA的表達(dá)有顯著差異，這些circRNA也大多來(lái)源于內(nèi)含子基因區(qū)域，包括上調(diào)基因49個(gè)，下調(diào)基因40個(gè)，相應(yīng)基因主要有SNORA25、SNORA51、SNORA31、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA；然而，尿液外泌體中的circRNA種類增加，主要表現(xiàn)為外顯子區(qū)域來(lái)源，60個(gè)circRNA的表達(dá)具有顯著差異，主要屬于內(nèi)含子基因區(qū)域，其中54個(gè)表達(dá)上調(diào)，6個(gè)表達(dá)下調(diào)。近55%為內(nèi)含子來(lái)源，30%為外顯子來(lái)源，15%為基因間區(qū)，相應(yīng)基因主要為SNORA51、SNORA31、SNORA70、SNORA75、SNORD112和其他snoRNA，這些表達(dá)異常的circRNA可能參與了IMN的發(fā)病機(jī)制。

4 總結(jié)與展望

總之，ncRNA在MN患者的尿液、血液和腎臟中的異常表達(dá)提示其與MN的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，又因其表達(dá)穩(wěn)定，為無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，可以作為預(yù)測(cè)MN的新型生物標(biāo)志物。對(duì)ncRNA的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控也有可能成為治療MN的新方法。然而，ncRNA參與MN的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡明，相信隨著對(duì)ncRNA的研究逐漸深入，ncRNA將成為診斷與治療MN的有效工具而造?；颊摺?/p>