大鼠肉瘤基因同源物及其相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶信號(hào)通路在呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷中的作用

陳 勇 孫 靜 郭 蓮 胡小蘭 郎海麗 王 忠 胡衍輝 徐國(guó)海

目前，機(jī)械通氣已成為治療呼吸衰竭、各種器官衰竭，以及用于全身麻醉(簡(jiǎn)稱全麻)手術(shù)等過程的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。有研究[1]結(jié)果表明，呼吸機(jī)使用不當(dāng)可能對(duì)正常肺組織造成損傷或加重肺組織損傷，即呼吸機(jī)相關(guān)性肺損傷(ventilator induced lung injury，VILI)，其主要病理特征為炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、透明膜形成、血管通透性增加和肺水腫，可導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生氣壓傷、容積傷、萎陷傷和生物傷等。近年來的研究[2-3]結(jié)果表明，機(jī)械通氣誘發(fā)機(jī)體炎癥細(xì)胞激活和炎癥介質(zhì)表達(dá)是導(dǎo)致肺損傷發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制。大鼠肉瘤基因同源物(Rho)是一種小分子鳥苷酸結(jié)合蛋白，具有鳥苷三磷酸(GTP)酶活性，廣泛分布于哺乳動(dòng)物的組織細(xì)胞中。有研究[4]結(jié)果表明，Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶(Rock)在炎癥反應(yīng)中具有相當(dāng)重要的作用，Rock抑制劑可抑制多形核白細(xì)胞滲出和炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的產(chǎn)生，從而減輕炎癥反應(yīng)，但其能否減輕VILI目前尚不清楚。本研究通過評(píng)價(jià)Rho/Rock信號(hào)通路在VILI中的作用，以及法舒地爾對(duì)VILI的保護(hù)作用，旨在為臨床治療VILI提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2019年1—5月在南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院行擇期全麻下機(jī)械通氣時(shí)間≥4 h的普通外科手術(shù)患者60例，男33例、女27例；年齡范圍20～60歲，年齡為(46±8)歲；ASA分級(jí)Ⅰ或Ⅱ級(jí)。采用隨機(jī)數(shù)字表法將患者分為法舒地爾組和0.9%氯化鈉組(對(duì)照組)，每組30例。排除標(biāo)準(zhǔn)：機(jī)械通氣時(shí)間<4 h，嚴(yán)重顱腦損傷，惡性腫瘤，嚴(yán)重心、肺、肝、腎功能異常，阿片類藥物過敏史和濫用史，血流動(dòng)力學(xué)不穩(wěn)定，正在參與其他臨床試驗(yàn)。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為2017第32號(hào))，患者及其家屬均簽署知情同意書。

1.2 方法 所有患者術(shù)前均未給予任何藥物。入手術(shù)室后連接心電監(jiān)護(hù)儀，于局部麻醉下行橈動(dòng)脈穿刺。靜脈注射咪達(dá)唑侖0.05 mg/kg、芬太尼3.5 μg/kg、依托咪酯0.3 mg/kg、順阿曲庫(kù)銨0.15 mg/kg行麻醉誘導(dǎo)，氣管插管后行機(jī)械通氣。法舒地爾組于麻醉誘導(dǎo)后給予法舒地爾(天津紅日藥業(yè)股份有限公司)30 mg(以100 mL 0.9%氯化鈉溶液稀釋)靜脈注射，于15 min內(nèi)注射完畢；對(duì)照組給予等容量0.9%氯化鈉溶液靜脈注射。機(jī)械通氣的參數(shù)設(shè)置：FiO2100%，氣道平臺(tái)壓(pplat)<35 cmH2O(1 cmH2O=0.098 kPa)，PEEP 5～20 cmH2O，通氣頻率8～12次/min，潮氣量8～10 mL/kg，吸呼比為1∶2，維持呼氣末二氧化碳分壓35～45 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)。給予異丙酚0.2～0.4 mg/(kg·min)、瑞芬太尼0.1～0.2 μg/(kg·min)、順阿曲庫(kù)銨2～3 μg/(kg·min)靜脈注射維持麻醉，維持腦電雙頻指數(shù)(BIS)為40～60。監(jiān)測(cè)血壓、心率、經(jīng)皮動(dòng)脈血氧飽和度(SpO2)和心電圖。手術(shù)結(jié)束待患者自主呼吸恢復(fù)后，給予新斯的明和阿托品拮抗肌肉松弛藥，拔除氣管導(dǎo)管后送至麻醉恢復(fù)室(PACU)，給予面罩吸氧，給予患者靜脈自控鎮(zhèn)痛(PCIA)。PCIA配置：舒芬太尼2 μg/kg+0.9%氯化鈉溶液至100 mL，負(fù)荷劑量2 mL，持續(xù)輸注量2 mL/h，患者自控鎮(zhèn)痛(PCA)量1 mL，鎖定時(shí)間15 min。

1.3 血管活性藥物使用 術(shù)中酌情使用阿托品、多巴胺、去氧腎上腺素等血管活性藥物調(diào)控心率和血壓。若術(shù)中患者心率<50次/min時(shí)，靜脈注射阿托品；血壓<基礎(chǔ)值的30%時(shí)，靜脈注射去氧腎上腺素或多巴胺。

1.4 觀察指標(biāo) 比較兩組患者的一般情況。記錄兩組患者手術(shù)過程中呼吸機(jī)參數(shù)(潮氣量、峰流速、呼吸頻率、PEEP)。分別于麻醉誘導(dǎo)前和麻醉蘇醒后進(jìn)行急性生理學(xué)與慢性健康狀況評(píng)價(jià)Ⅱ(APACHE Ⅱ)評(píng)分。分別于機(jī)械通氣前后采集患者的外周靜脈血和動(dòng)脈血樣本，測(cè)定血清Rock水平并行血?dú)夥治?血?dú)夥治鲋笜?biāo)為paO2、氧合指數(shù)、呼吸指數(shù))。分別于機(jī)械通氣前后收集患者的支氣管肺泡灌洗液(BALF)，采用ELISA法測(cè)定BALF中髓過氧化物酶(MPO)、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平。記錄兩組患者術(shù)后7 d肺部并發(fā)癥(肺部感染、肺不張、支氣管痙攣和呼吸衰竭)的發(fā)生情況。

1.5 并發(fā)癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)[5]肺部感染(至少滿足以下1條)：高熱，頻繁咳嗽、咳痰，肺部聽診異常，胸部X線攝片提示新出現(xiàn)的肺部滲出或者原有的滲出增多，血常規(guī)檢查白細(xì)胞計(jì)數(shù)>12×109/L。肺不張：氧合差且患側(cè)肺部聽診呼吸音低，或者胸部X線攝片提示肺組織透亮度降低伴縱隔、肺門和患側(cè)橫膈向不張區(qū)域移動(dòng)，健側(cè)肺代償性的過度通氣。支氣管痙攣：呼吸困難，肺部聽診有廣泛的哮鳴音，需藥物治療才能緩解。呼吸衰竭：術(shù)后吸空氣時(shí)paO2<60 mmHg，或者氧合指數(shù)<300 mmHg，或者SpO2<90%且需吸氧治療。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況比較 兩組患者間年齡、性別構(gòu)成、體重、ASA分級(jí)構(gòu)成和手術(shù)時(shí)間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表1。

表1 兩組患者一般情況的比較 (N=30)

2.2 手術(shù)過程中呼吸機(jī)參數(shù)比較 兩組間患者手術(shù)過程中潮氣量、峰流速、呼吸頻率和PEEP的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。見表2。

表2 兩組患者手術(shù)過程中呼吸機(jī)參數(shù)的比較

2.3 麻醉誘導(dǎo)前和麻醉蘇醒后APACHE Ⅱ評(píng)分比較 對(duì)照組麻醉誘導(dǎo)前和麻醉蘇醒后APACHE Ⅱ評(píng)分分別為(10.5±3.7)、(6.5±2.3)分，法舒地爾組分別為(10.9±3.4)、(8.3±2.6)分。兩組間麻醉誘導(dǎo)前APACHE Ⅱ評(píng)分的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),法舒地爾組麻醉蘇醒后APACHE Ⅱ評(píng)分顯著高于對(duì)照組麻醉蘇醒后(P<0.05)。

2.4 機(jī)械通氣前后血清Rock水平和血?dú)夥治鲋笜?biāo)比較 兩組間機(jī)械通氣前血清Rock水平和氧合指數(shù)、呼吸指數(shù)、paO2的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。法舒地爾組機(jī)械通氣后氧合指數(shù)顯著高于對(duì)照組機(jī)械通氣后(P<0.05)，血清Rock水平和呼吸指數(shù)均顯著低于對(duì)照組機(jī)械通氣后(P值均<0.05)；兩組間機(jī)械通氣后paO2的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

表3 兩組患者機(jī)械通氣前后血清Rock水平和血?dú)夥治鲋笜?biāo)的比較

2.5 機(jī)械通氣前后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平比較 兩組間機(jī)械通氣前BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)。法舒地爾組患者機(jī)械通氣后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平均顯著低于對(duì)照組機(jī)械通氣后(P值均<0.05)。見表4。

表4 兩組患者機(jī)械通氣前后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平的比較

2.6 術(shù)后7 d肺部并發(fā)癥情況比較 術(shù)后7 d，法舒地爾組肺部并發(fā)癥發(fā)生率為3.3%(1/30)，僅1例患者發(fā)生肺部感染；對(duì)照組肺部并發(fā)癥發(fā)生率為16.7%(5/30)，其中肺部感染3例、支氣管痙攣2例；兩組患者均未發(fā)生肺不張和呼吸衰竭。法舒地爾組術(shù)后7 d肺部并發(fā)癥發(fā)生率顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。

3 討 論

VILI是指由機(jī)械通氣引起的各種肺部改變的總稱，臨床上將其分為氣壓傷、容積傷、萎陷傷、生物傷4種類型。VILI的發(fā)生是由多種因素共同作用的結(jié)果，既有機(jī)械力對(duì)肺組織細(xì)胞的直接損傷，也有激活的炎癥細(xì)胞和炎癥介質(zhì)介導(dǎo)的肺局部炎癥反應(yīng)(即生物傷)，其在分子水平促進(jìn)大量炎癥因子釋放，通過炎癥反應(yīng)的級(jí)聯(lián)放大，造成組織損傷[6]。研究[7]發(fā)現(xiàn)，在大鼠機(jī)械通氣肺損傷模型中，TNF-α水平明顯升高，誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞生成IL-8的能力增強(qiáng)，而IL-8可加重肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和肺水腫，進(jìn)而誘發(fā)中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放IL-6和IL-1等炎癥因子，進(jìn)一步加重組織損傷。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)，行機(jī)械通氣的患者VILI發(fā)生率高達(dá)15%[8]。因此，探討VILI的主要致病因素，研究其有效治療藥物是臨床亟待解決的問題。

法舒地爾作為首個(gè)抑制肌球蛋白輕鏈磷酸化的新型血管擴(kuò)張劑，主要通過抑制Rock發(fā)揮藥理作用，其能夠抑制鈣敏化效應(yīng)，降低內(nèi)皮細(xì)胞的張力，擴(kuò)張血管，防止缺血-再灌注損傷的發(fā)生，從而改善腦組織微循環(huán)，減少心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)也可拮抗炎癥細(xì)胞因子，改善血液動(dòng)力學(xué)，目前已被廣泛用于治療冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙和腦血管病[9]。Rho/Rock信號(hào)通路與多種基因的表達(dá)有關(guān)，Rho GTP酶能被多種炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子活化，繼而激活Rho/Rock信號(hào)通路，這些炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子是引起多種炎癥損傷和纖維組織增生性疾病發(fā)生的重要基礎(chǔ)物質(zhì)。因此，抑制Rho/Rock信號(hào)通路可減少炎癥反應(yīng)發(fā)生。相關(guān)的動(dòng)物研究[10-11]結(jié)果表明，法舒地爾作為Rock抑制劑可減輕肺組織炎癥損傷和肺水腫，降低MPO、TNF-α、IL-6水平，從而改善疾病的預(yù)后。

本研究采用隨機(jī)數(shù)字表法對(duì)患者進(jìn)行分組，兩組間患者的一般情況和手術(shù)過程中呼吸機(jī)參數(shù)的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從而排除了呼吸機(jī)參數(shù)設(shè)置對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生的影響。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，VILI發(fā)生率隨著機(jī)械通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而增高；Toll樣受體是參與天然免疫的一類重要蛋白質(zhì)分子，是機(jī)體抵抗感染性疾病的第一道屏障，其表達(dá)量隨著機(jī)械通氣時(shí)間的延長(zhǎng)而增高，機(jī)械通氣240 min時(shí)Toll樣受體表達(dá)量顯著高于機(jī)械通氣60 min時(shí)[12]。因此，本研究選擇擇期行全麻手術(shù)且機(jī)械通氣時(shí)間≥4 h的患者，參考文獻(xiàn)[13]的方法，法舒地爾組于麻醉誘導(dǎo)后以法舒地爾30 mg經(jīng)100 mL 0.9%氯化鈉溶液稀釋后靜脈注射，于15 min內(nèi)注射完畢；結(jié)果顯示，法舒地爾組患者機(jī)械通氣后血清Rock水平顯著低于對(duì)照組機(jī)械通氣后，表明機(jī)械通氣后法舒地爾可抑制血清中Rock的表達(dá)。

BALF中炎癥因子MPO、TNF-α、IL-6水平與大葉性肺炎、重癥肺炎等疾病的嚴(yán)重程度密切相關(guān)，炎癥因子水平越高，病情越嚴(yán)重；此外，根據(jù)炎癥因子水平變化可判斷疾病的預(yù)后[14]。VILI患者BALF中MPO、TNF-α和IL-6水平均顯著升高，MPO是中性粒細(xì)胞的特征酶，其活性反映了中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度；TNF-α和IL-6是由血管內(nèi)皮合成和釋放的，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)啟動(dòng)的主要促炎因子，TNF-α具有抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用，并參與機(jī)體炎癥等多種病變發(fā)生、發(fā)展的過程，可誘發(fā)自身和其他細(xì)胞因子釋放而損傷機(jī)體；IL-6是由肺組織內(nèi)不同細(xì)胞，如肺泡巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等受到牽拉刺激時(shí)激活產(chǎn)生，其水平急劇升高(即炎癥因子大量激活)為炎癥急性期的表現(xiàn)，其與肺損傷和肺部并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，法舒地爾組患者機(jī)械通氣后BALF中MPO、TNF-α、IL-6、RhoA和Rock2水平均顯著低于對(duì)照組機(jī)械通氣后，表明法舒地爾作為Rock抑制劑，可減少血清中促炎癥因子釋放，以及炎癥因子浸潤(rùn)肺泡上皮細(xì)胞和毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞，從而起到減輕VILI的作用。本研究結(jié)果顯示，法舒地爾組機(jī)械通氣后氧合指數(shù)顯著高于對(duì)照組通氣后，呼吸指數(shù)顯著低于對(duì)照組機(jī)械通氣后；麻醉蘇醒后APACHE Ⅱ評(píng)分顯著高于對(duì)照組麻醉蘇醒后，術(shù)后7 d肺部并發(fā)癥發(fā)生率顯著低于對(duì)照組。上述結(jié)果表明，法舒地爾作為Rock抑制劑可減輕VILI，減少術(shù)后肺部并發(fā)癥的發(fā)生，該作用機(jī)制可能與其抑制Rho/Rock信號(hào)通路后減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上所述，Rock抑制劑法舒地爾可減輕患者機(jī)械通氣時(shí)VILI，減少術(shù)后肺部并發(fā)癥的發(fā)生，該作用機(jī)制可能與其抑制Rho/Rock信號(hào)通路后減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。