酶催化法制備烷基葡糖苷的研究進(jìn)展

王曉季，張學(xué)松，陶娟

（江西科技師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西南昌330013）

烷基葡糖苷是一類可生物降解的非離子型表面活性劑，具有表面張力低、去污性好、配伍性好等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于化妝品、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域。此外烷基葡糖苷還可用于蛋白的溶解、重組及結(jié)晶，因其可快速分解且易于從蛋白提取液中去除，已成為洗滌劑的首選。

傳統(tǒng)的苷化法均為化學(xué)過程，通常需對葡萄糖單元中1 位以外的羥基進(jìn)行復(fù)雜的保護(hù)和去保護(hù)反應(yīng)才能獲得目標(biāo)產(chǎn)物。此外，化學(xué)法合成烷基葡糖苷的反應(yīng)條件比較苛刻，通常需要高溫、高壓或強(qiáng)酸作催化劑，并且得到的產(chǎn)物為α 型和β 型烷基葡糖苷的混合物，并含部分木糖苷。

隨著可持續(xù)發(fā)展觀念被全球的普遍認(rèn)可，人們越來越重視酶參與的催化反應(yīng)。因其對環(huán)境更友好，成本效益更高，更具可持續(xù)性，因此采用酶作催化劑將成為今后烷基葡糖苷生產(chǎn)的發(fā)展趨勢。由于酶催化反應(yīng)可在溫和的條件下一步獲得單一目標(biāo)產(chǎn)物，同時催化劑酶源于可再生資源，因而過程更環(huán)保，成本更低廉。但酶催化法也面臨著很多問題，首先酶的價格昂貴；對有機(jī)溶劑耐受性較差容易失活；另外，只有烷基碳鏈長度大于8 個碳的烷基葡糖苷才具有表面活性，而辛醇或更長碳鏈的脂肪醇參與糖醇反應(yīng)時，兩者的反應(yīng)可及度較低阻礙了烷基葡糖苷的有效合成，難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。目前國內(nèi)外采用酶法制備烷基葡糖苷的研究報(bào)道比較少，本文主要對近年來酶催化法的研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，重點(diǎn)介紹了固定化酶技術(shù)在烷基葡糖苷制備中的應(yīng)用。

1 酶催化作用機(jī)理

酶催化法制備烷基葡糖苷的糖苷酶大多采用了β-葡萄糖苷酶，其結(jié)構(gòu)中起催化作用的是兩個谷氨酸殘基，分別為糖苷化反應(yīng)中的質(zhì)子供體和親核基團(tuán)（反應(yīng)機(jī)理見圖1）。首先一個谷氨酸殘基Glu PD 脫去羧基上的質(zhì)子，并轉(zhuǎn)移到底物糖苷鍵-OR1 的氧原子上，促使-OR1 的離去；同時另一個谷氨酸殘基Glu Nu 作為親核基團(tuán)進(jìn)攻同側(cè)的異頭碳形成共價鍵，得到糖基-酶中間體；之后醇作為親核試劑進(jìn)攻上述糖基-酶的異頭碳，形成烷基糖苷產(chǎn)物，并使酶回復(fù)成初始的質(zhì)子化態(tài)[1]。

圖1 β-葡萄糖苷酶催化作用機(jī)理

2 酶催化反應(yīng)類型

酶催化法制備烷基葡糖苷主要有兩種反應(yīng)類型：

當(dāng)?shù)孜餅閱翁菚r，醇作為親核試劑，與糖直接縮合生成烷基葡糖苷，該反應(yīng)類型是由熱力學(xué)控制的逆水解反應(yīng)，Gly-OH+R2OH→Gly-OR2+H2O，因此可通過增加反應(yīng)物濃度、升高反應(yīng)溫度等熱力學(xué)方法促使反應(yīng)向產(chǎn)物生成方向進(jìn)行。

當(dāng)?shù)孜餅榛钚蕴腔w時，比如4-硝基苯基-D-吡喃葡糖苷（pNPG）、纖維素二糖、或短鏈糖苷等，糖基通過酶催化轉(zhuǎn)移到長鏈醇上，發(fā)生轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，Gly-OR1+R2OH→Gly-OR2+R1OH，同時生成的烷基糖苷也會發(fā)生水解反應(yīng)，Gly-OR2+H2O→Gly-OH+R2OH。該反應(yīng)類型受動力學(xué)控制，烷基糖苷的收率取決于糖基供體的轉(zhuǎn)化速率與烷基糖苷的水解速率之間的平衡。

兩種反應(yīng)類型相比，逆水解法生產(chǎn)工藝相對簡單，但糖醇的直接縮合反應(yīng)較難進(jìn)行；轉(zhuǎn)糖基化法的反應(yīng)速率較快，然而當(dāng)采用糖苷作糖基供體時，需要通過化學(xué)法使其獲得具有轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)的活性。兩種酶催化反應(yīng)類型中，糖苷酶的催化活性仍是制約烷基葡糖苷收率提高的瓶頸。

3 游離酶在烷基糖苷制備中的應(yīng)用進(jìn)展

采用游離酶催化制備烷基葡糖苷的研究重點(diǎn)為工藝條件的優(yōu)化。首先不同來源的糖苷酶催化性能也有所不同，Yang 等從不同水果和蔬菜種子中提取出β-葡萄糖苷酶用于烷基葡糖苷的合成，研究發(fā)現(xiàn)李子β-葡萄糖苷酶的活性和穩(wěn)定性均優(yōu)于蘋果或桃子種子中的糖苷酶，通過逆水解反應(yīng)可制備得到78%、59%、53%和14%的乙基、丙基、丁基和辛基烷基葡糖苷。Zou 等在嗜熱網(wǎng)球菌Dictyoglomus thermophilum 中克隆出一種新的β-葡萄糖苷酶(DtGH)，該酶在水溶液中具有極佳的熱穩(wěn)定性，70℃下培養(yǎng)7d 仍能保持70%～80%的催化活性，以該DtGH 為催化劑采用逆水解法制備辛基葡糖苷時，將反應(yīng)溫度由50℃提高到70℃時，葡萄糖的轉(zhuǎn)化率提高了27%，同時反應(yīng)時間由7d 縮短到了3d。Winter 等首次采用纖維二糖磷酸化酶(CP)催化制備辛基葡糖苷可獲得55%的收率，相比采用杏仁β 葡萄糖苷酶作催化劑僅4%的收率有了顯著提高。

酶催化制備烷基葡糖苷的過程中水的活性(aw)是限制反應(yīng)進(jìn)行的一個重要因素，一方面aw對維持酶的活性非常必要，比如β-葡萄糖苷酶必需的aw 為0.6，另一方面高的aw 會促進(jìn)產(chǎn)物的水解，因此選擇合適的aw 值可提高的烷基葡糖苷收率。Mladenoska 采用杏仁β-葡萄糖苷酶催化制備辛基葡糖苷的研究中重點(diǎn)考察了aw 對轉(zhuǎn)化率的影響。該反應(yīng)中水既是糖基受體，又是反應(yīng)溶媒，研究發(fā)現(xiàn)反應(yīng)速率隨aw 增大而增加，當(dāng)aw為0.94 時反應(yīng)速率達(dá)最大值，最終產(chǎn)物收率也最高。在相同aw 條件下，轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)優(yōu)于逆水解反應(yīng)。

酶催化反應(yīng)中添加一定量的助溶劑，不僅有助于提高糖基供體的溶解度，同時還可維持一定的aw 從而有利于烷基糖苷的生成。助溶劑的選擇需對酶的活性沒有抑制作用。Ducret 等在制備辛基葡糖苷的過程中選擇N，N-二甲基甲酰胺(DMF) 作為助溶劑添加到單相辛醇反應(yīng)體系中，結(jié)果表明產(chǎn)物收率跟DMF 的添加量有很大關(guān)系，當(dāng)DMF 含量為10%時辛基葡糖苷的收率達(dá)到最高值50%，但進(jìn)一步提高DMF 的含量時產(chǎn)物收率反而逐漸降低，這是由于過量的DMF 會抑制酶的活性。Phongprathet 等以泰國漢尼松BC9 β-葡萄糖苷酶為催化劑制備己基葡糖苷時，添加15%(v/v)二甲基亞砜(DMSO)作助溶劑，反應(yīng)24h 的收率可從6%提高到66%，特別是反應(yīng)4h 時己基葡糖苷的收率已達(dá)62%。

逆水解反應(yīng)是受熱力學(xué)控制，理論上提高葡萄糖的濃度有利于反應(yīng)向烷基葡糖苷的生成方向進(jìn)行，但Ducret 等研究發(fā)現(xiàn)，高的葡萄糖濃度對來源于微生物的β-葡萄糖苷酶有抑制作用，從生物進(jìn)化角度來分析，葡萄糖是微生物生長必需的碳源，但周圍環(huán)境存在過量葡萄糖反而會被競爭菌株所利用，因此該微生物來源的糖苷酶參與烷基葡糖苷制備的過程中不能選擇過高的葡萄糖濃度。

目前關(guān)于采用酶催化法制備烷基葡糖苷的報(bào)道中，糖基供體大多是可溶性的化合物，比如葡萄糖、pNPG、短鏈烷基葡糖苷等，Tao 等直接采用不溶性的纖維素為底物，與甲醇經(jīng)纖維素酶催化得到了甲基葡糖苷，當(dāng)甲醇含量為22%時，產(chǎn)物收率最高可達(dá)40%。該研究發(fā)現(xiàn)纖維素首先降解成纖維二糖，之后纖維二糖作為糖基供體與甲醇發(fā)生轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)生成甲基葡糖苷。

4 固定化酶在烷基葡糖苷制備中的應(yīng)用進(jìn)展

與游離酶相比，固定化酶具有穩(wěn)定性高，易分離回收，可重復(fù)使用等優(yōu)點(diǎn)，越來越多地應(yīng)用于糖苷化反應(yīng)的研究中，根據(jù)酶的固定化方式可分為以下幾種。

4.1 吸附法

吸附法是酶通過物理或離子交換作用吸附在吸附劑表面而使酶固定，該方法操作簡單、條件溫和、不會引起酶變性或失活，且載體廉價易得。Gargouri 等采用吸附法將β-葡萄糖苷酶吸附到不同載體上制成固定化酶，并對負(fù)載量及催化活性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明β-葡萄糖苷酶固定在DEAE-瓊脂糖上的負(fù)載量最高可達(dá)91%，并可保留83.2%的活性，將該固定化酶用于糖苷的轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)，可得22mM 的異戊基木糖苷和14mM異戊基木二糖苷。但該固定化酶并不能制備烷基葡糖苷。Lundemo 等采用吸附法制得了固定化糖苷酶，重點(diǎn)研究了后處理方式對酶在微水環(huán)境中催化活性的影響。研究發(fā)現(xiàn)將糖苷酶吸附到疏水載體Accurel MP-1000，并通過丙醇純化制得的固定化酶，在較低的aw 中催化合成己基葡糖苷時，轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)速率明顯優(yōu)于產(chǎn)物的水解速率，進(jìn)而有利于己基葡糖苷收率的提高；同時與游離酶相比，初始反應(yīng)速度提高了17～70 倍。但最終酶催化反應(yīng)收率相比經(jīng)典的化學(xué)法仍有很大的改進(jìn)空間[2]。

4.2 交聯(lián)法

交聯(lián)法是利用功能試劑與酶進(jìn)行交聯(lián)反應(yīng)，形成共價鍵連接的固定化酶，常用的交聯(lián)劑是戊二醛。Winter 等采用交聯(lián)法對纖維二糖磷酸化酶(CP)進(jìn)行固定制得交聯(lián)酶聚體(CLEAs)，相比游離酶，CLEAs 的穩(wěn)定性顯著提高，其在50℃的活性半衰期可由34h 增加到11d，另外采用辛醇分子印跡技術(shù)的CLEAs 催化辛基葡糖苷的效率可提高一倍，并且能連續(xù)三次循環(huán)使用，是一種理想的酶法制備烷基葡糖苷的酶催化劑。

4.3 載體結(jié)合法

采用載體結(jié)合法固定化酶時，最常用的是共價結(jié)合，即酶蛋白的非必需基團(tuán)通過共價鍵與不溶性載體形成不可逆的連接，該固定化酶結(jié)合地非常牢固，即使高濃度溶液也不會導(dǎo)致酶的脫落，具有良好的穩(wěn)定性及重復(fù)使用性。但固定化過程中反應(yīng)條件比較苛刻，容易引起酶蛋白高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變而使酶失活。張烜等采用硅酸鹽黏土材質(zhì)的納米凹凸棒為載體，制備的固定化β-葡萄糖苷酶，在微水環(huán)境中催化葡萄糖和辛醇逆水解反應(yīng)生成辛基葡糖苷，相比游離酶，固定化酶對有機(jī)溶劑的耐受性顯著提高，反應(yīng)達(dá)到平衡的時間也可縮短48h，最終可達(dá)20.4%的葡萄糖轉(zhuǎn)化率。Wang 等將苦杏仁中提取的β-葡萄糖苷酶，固定在多胺微球上(PA-M)，用以提高酶的熱穩(wěn)定性及對有機(jī)溶劑的耐受性，結(jié)果顯示固定化酶在80℃下培養(yǎng)48h 后仍保持原酶活性的40%，而游離酶則完全失活。在添加10%的丁基醇作為助溶劑制備辛基葡糖苷時，產(chǎn)物收率提高了1.7 倍。另外該研究發(fā)現(xiàn)分批加料的方式可獲得最高59.6%的產(chǎn)物收率，這是由于分批加入葡萄糖可控制葡萄糖的濃度，進(jìn)而降低葡萄糖對酶活性的抑制作用[3]。

4.4 包埋法

包埋法首先將聚合物的單體與酶混合，再借助進(jìn)劑的作用進(jìn)行聚合，最終酶被包埋在聚合物中以達(dá)到固定化的目的。由于包埋法一般不需要與酶蛋白的氨基酸殘基進(jìn)行結(jié)合反應(yīng)，很少改變酶的空間構(gòu)象，酶活的回收率較高。周亞軍等采用包埋法中的微球截留固定化技術(shù)，以海藻酸鈉為壁材、戊二醛為交聯(lián)劑、氯化鈣為凝聚劑，將β-葡萄糖苷酶包埋制備成微膠囊固定化酶，與游離酶相比，固定化酶在葡萄糖和正丁醇的逆水解反應(yīng)中具有顯著的酶活力，同時該固定化酶可重復(fù)使用3 次。

4.5 酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)

表面展示技術(shù)一種新的重組DNA 技術(shù)，可使表達(dá)的蛋白或多肽以融合蛋白形式展示在細(xì)胞表面，保持相對獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性。酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)因其較完善的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和分泌機(jī)制、安全無毒等獨(dú)特的優(yōu)越性受到越來越多的關(guān)注。該技術(shù)首先將靶蛋白基因與特定的載體基因序列融合后導(dǎo)入酵母細(xì)胞，利用酵母細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到膜表面的機(jī)制，使得靶蛋白固定化表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，從而制得全細(xì)胞催化劑。Wallecha 等將耐熱酵母Pichia etchellsii 中發(fā)現(xiàn)的兩種β-葡萄糖苷酶BglⅠ和BglⅡ，以母體細(xì)胞Pichia etchellsii 為載體，經(jīng)纖維二糖誘導(dǎo)制備得到全細(xì)胞催化劑(BGLⅠ和BGLⅡ)，在pH4～9 范圍內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。該研究首次采用全細(xì)胞催化劑合成了長鏈烷基葡糖苷，比如辛基葡糖苷(收率約為12%)、癸基葡糖苷等。Rather 等采用Pichia etchellsii 全細(xì)胞結(jié)合的β-葡萄糖苷酶在微水環(huán)境下催化pNPG 與辛醇反應(yīng)制備辛基葡糖苷，采用優(yōu)化的初始水活度、糖基供體的濃度及酶的用量，最終產(chǎn)物的收率接近70%。2012 年Rather 課題組采用上述全細(xì)胞酶催化劑，以甲基葡糖苷為糖基供體進(jìn)行轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)制備長鏈烷基葡糖苷，其中辛基葡糖苷，癸基葡糖苷及十二烷基葡糖苷的收率分別為53%、27%和13%。Ito 等采用酵母細(xì)胞展示技術(shù)制備了六種釀酒酵母展示的棘孢曲霉β-葡萄糖苷酶1 的全細(xì)胞催化劑，其中GRI-117-UK 為宿主菌時，酶的活性最高(簡稱GUK:BGL1)， 可催化pNPG 與1-己醇得到27.3%的己基葡糖苷。Guo 等將木薯β-葡萄糖苷酶展示在畢赤酵母GS115 細(xì)胞表面，制備全細(xì)胞催化劑，并以pNPG 為底物通過轉(zhuǎn)糖基化反應(yīng)制備了辛基葡糖苷，最高可達(dá)52%的收率[4]。

5 展望

酶催化制備烷基葡糖苷的反應(yīng)中，酶的催化活性對反應(yīng)速率及產(chǎn)物收率起到了至關(guān)重要的作用。由于環(huán)境變化對酶活性有很大的影響，因此改良酶的穩(wěn)定性是研究的關(guān)鍵。固定化酶對于提高酶的穩(wěn)定性、重復(fù)利用性方面有著顯著優(yōu)勢，但也存在著一些不足。比如，傳統(tǒng)的固定化方法使得酶的活力有所損失，固定化酶與底物的親和力較游離酶也顯著降低。今后的研究重點(diǎn)將是選擇性能優(yōu)異的載體材料，并開發(fā)新的固定化酶技術(shù)，使得酶得以固定并保持較高的酶活性，同時為糖醇的催化反應(yīng)提供反應(yīng)空間，從而實(shí)現(xiàn)綠色高效制備烷基葡糖苷。