超高效液相色譜法測定人血清中伏立康唑血藥濃度與臨床應用

陳君，黃春新，王敏

海南省人民醫(yī)院&海南醫(yī)學院附屬海南醫(yī)院藥學部，海南 海口 570311

伏立康唑是臨床常用的可口服和靜脈制劑的三唑類抗真菌藥物，對念珠菌屬、曲霉菌屬、足放線菌屬和鐮刀菌屬都有抗菌作用，美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)指南推薦首選伏立康唑用于治療和預防侵襲性真菌感染。伏立康唑主要在肝臟通過細胞色素P450酶系代謝，因其代謝具有飽和性，呈非線性藥代動力學特點，隨著給藥劑量的增加，藥物-時間曲線下面積(AUC)升高的比例遠大于給藥劑量增加的比例，過低濃度臨床上常表現(xiàn)為治療效果不佳或失敗，過高濃度易誘導不良反應的發(fā)生[1]。通過對已有的研究文獻調研分析發(fā)現(xiàn)患者個體化差異對最終臨床療效影響顯著。因此，在一些重癥患者人群中，實時監(jiān)測患者體內伏立康唑血藥濃度的變化十分必要。通過建立超高效液相色譜法(ultra performance liquid chromatography，UPLC)測定人血清中伏立康唑濃度，結合患者個體化差異，協(xié)助臨床優(yōu)化給藥方案，以促進其在臨床治療過程中的合理使用。

1 材料與方法

1.1 儀器 十萬分之一分析天平(德國Sartorius公司)，Waters UPLC H-CLASS超高效液相色譜儀，Waters PDA檢測器，Empower 2數(shù)據(jù)采集處理軟件(Waters Corporation)；WH-2微型旋渦混合儀(上海滬西分析儀器廠有限公司)；MDF-382E超低溫保存箱(三洋科研醫(yī)療設備公司)；R20醫(yī)用高速冷凍離心機(安新縣白洋離心機廠)。

1.2 藥品與試劑 伏立康唑對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號B25090，HPLC純度≥98%)；磷酸二氫鉀(KH2PO4，分析純，西隴化工股份有限公司，批號 1411021)；乙腈(CH3CN，Avantor Performance Materials，批號0000169419，UPLC色譜純)；純化水由Milli-Q Advantage A10純水機(美國Millipore公司)制備?？瞻籽鍋碜越】等巳骸?/p>

1.3 溶液的配置

1.3.1 伏立康唑儲備液1 精密稱取30 mg伏立康唑標準品，乙腈溶解并定容至10 mL容量瓶，即制成3 mg/mL伏立康唑儲備液1，于4℃冰箱中儲存。

1.3.2 伏立康唑儲備液2 精密量取2 mL 3 mg/mL伏立康唑儲備液1至100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋定容至100 mL，即制成60 μg/mL伏立康唑儲備液2，于4℃冰箱中儲存。

1.3.3 血清伏立康唑標準液 精密量取伏立康唑儲備液2 500 μL，加入適量空白血清，配制成血清伏立康唑濃度分別為0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1.0 μg/mL、5.0 μg/mL、10.0 μg/mL和20.0 μg/mL的各標準曲線血清濃度。

1.4 檢測條件 色譜柱：Waters UPLC Acquity BEH C18(3.0 mm×100 mm，1.7 μm)；流動相為乙腈(A)-0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(B)，梯度洗脫：0～5 min，40%～55%A；5～10 min，55%～75%A；10～15 min，75%～90%A；流速0.25 mL/min；柱溫40℃；檢測波長254 nm；進樣量10 μL；Waters PDA檢測器；分析時間15 min。

1.5 血清樣品處理 精密量取500 μL血清樣品置2 mL離心管中，加入1 000 μL乙腈，渦旋混合1 min，離心(4 ℃，14 000 r/min，12 min)，取1 000 μL上清液轉移至2 mL離心管中，取上清液500 μL用0.22 μm濾膜過濾后進樣分析。

1.6 方法學考察

1.6.1 系統(tǒng)適應性及專屬性考察 空白血清、空白血清+伏立康唑、乙腈+伏立康唑和用藥患者的血清樣品各6份，按照“1.5”項下方法處理后，按“1.4”項下方法檢測。

1.6.2 標準曲線的建立 分別取血清伏立康唑各標準曲線濃度500 μL，按“1.5”項下方法處理后按“1.4”項下方法檢測。

1.6.3 準確度試驗 取空白血清，配制含伏立康唑定量下限0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、和20 μg/mL低、中、高4個濃度各6份樣品，按“1.5”項下方法處理后按“1.4”項下方法檢測。乙腈溶液配制伏立康唑 0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL濃度各6份樣品按“1.4”項下方法檢測，平行操作6次。

1.6.4 精密度試驗 (1)日內精密度：取空白血清，配制含伏立康唑定量下限0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL低、中、高4個濃度各6份樣品，按“1.5”項下方法進行處理后按“1.4”項下方法檢測，24 h內平行測定6次，計算日內精密度。(2)日間精密度：取上述定量下限和低、中、高4個濃度各6份樣品，連續(xù)3 d每日測定一次，計算日間精密度。

1.6.5 穩(wěn)定性試驗 取空白血清，配制伏立康唑1 μg/mL、10 μg/mL、20 μg/mL低、中、高3個濃度各6份樣品，按“1.5”項下方法處理后，分別放置于室溫24 h(復溶穩(wěn)定性)、反復凍融3次(凍融穩(wěn)定性)及-20℃冷凍保存4周(長期冷凍穩(wěn)定性)，按“1.4”項下方法檢測，計算RSD。

1.7 臨床樣本的測定 經(jīng)海南省人民醫(yī)院倫理委員會批準，采用該方法為臨床8例使用伏立康唑治療的重癥患者進行血藥濃度測定。取患者血藥濃度達穩(wěn)后，外周靜脈血3 mL，按“1.5”項下方法處理后按“1.4”項下方法檢測，另配制1 μg/mL、10 μg/mL和20 μg/mL低、中、高3個濃度的質控樣本平行測定。

2 結果

2.1 系統(tǒng)適應性及專屬性考察 結果發(fā)現(xiàn)伏立康唑在空白血清、空白血清+伏立康唑、乙腈+伏立康唑、含伏立康唑的患者血清保留時間分別為0 min、6.22 min、6.23 min、6.21 min，各峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于1 000，空白血清和流動相中干擾組分的響應低于分析物定量下限響應的20%，基質效應值(基質效應=往基質溶液里面添加一定量標準品測得的數(shù)值/實際添加數(shù)值的比值)為0.96±0.08，介于0.8～1.0，結果表明色譜分離系統(tǒng)良好，專屬性強，血清中的內源性物質對血清中伏立康唑的干擾不顯著，如圖1所示。

2.2 標準曲線的建立 以伏立康唑峰面積為縱坐標(Y)，伏立康唑濃度為橫坐標(X)，得到線性回歸方程：Y=21556X+368.7，R2=0.999，線性范圍為0.1～20 μg/mL，定量下限為0.1 μg/mL，見圖2。

圖1 伏立康唑檢測方法系統(tǒng)適應性及專屬性考察色譜圖

圖2 伏立康唑檢測方法的標準曲線圖

2.3 準確度試驗 以伏立康唑峰面積與乙腈峰面積的比值表示絕對回收率；用標準曲線法測得伏立康唑濃度與配制濃度比值為方法回收率。按“1.4”項下方法檢測，定量下限的絕對回收率和方法回收率分別為(90.14±2.98)%和(93.35±2.75)%，低、中、高3個濃度的絕對回收率和方法回收率RSD均小于5%，見表1。

2.4 精密度試驗 按“1.4”項下方法檢測，定量下限和低、中、高3個濃度的日內精密度和日間精密度RSD均小于5%，見表2。

表1 伏立康唑檢測方法的準確度試驗結果(±s，n=6)

表1 伏立康唑檢測方法的準確度試驗結果(±s，n=6)

理論質量濃度(μg/mL)絕對回收率(%) 方法回收率(%)0.1 1 10 20計算值90.14±2.98 92.50±2.95 93.88±3.68 93.25±2.65 RSD 3.31 3.19 3.92 2.83計算值93.35±2.75 93.50±3.96 99.90±2.20 97.65±2.10 RSD 2.95 4.23 2.20 2.15

2.5 穩(wěn)定性試驗 考察不同濃度樣品在室溫、反復凍融及長期冷凍條件下的穩(wěn)定性。低、中、高3個濃度的穩(wěn)定性RSD均小于10%，見表3。

2.6 臨床樣品的測定 8例重癥患者監(jiān)測結果顯示，伏立康唑濃度在1.15～8.08 μg/mL之間，不同患者間藥物濃度具有較大差異。濃度高于5.0 μg/mL時患者比較容易出現(xiàn)不良反應，維持劑量需要減少，見表4。

表2 伏立康唑檢測方法的精密度試驗結果(±s，n=6)

表2 伏立康唑檢測方法的精密度試驗結果(±s，n=6)

理論質量濃度(μg/mL)日內精密度日間精密度0.1 1 10 20實測質量濃度(μg/mL)0.09±0.01 0.93±0.04 9.99±0.22 19.53±0.42 RSD(%)3.35 4.23 2.2 2.15實測質量濃度(μg/mL)0.09±0.00 0.96±0.04 10.05±0.21 19.73±0.34 RSD(%)3.95 3.94 2.13 1.74

表3 伏立康唑檢測方法的穩(wěn)定性試驗結果(±s，n=6)

表3 伏立康唑檢測方法的穩(wěn)定性試驗結果(±s，n=6)

理論濃度(μg/mL)復溶穩(wěn)定性 凍融穩(wěn)定性1 10 20實測濃度(μg/mL)0.97±0.03 10.21±0.28 19.91±0.81 RSD(%)3.34 2.71 4.05實測濃度(μg/mL)0.93±0.06 10.30±0.52 20.94±0.59 RSD(%)6.48 5.03 2.81長期冷凍穩(wěn)定性實測濃度(μg/mL)1.04±0.09 10.29±0.19 20.93±0.94 RSD(%)9.23 1.84 4.48

表4 8例重癥患者伏立康唑血藥濃度監(jiān)測結果及治療情況

3 討論

伏立康唑血藥濃度的色譜檢測方法主要集中在液相色譜-質譜分析法(LC-MS)、高效液相色譜(HPLC)、UPLC[2]。本研究建立的UPLC法，每個樣本僅需15 min的分析時間，能及時為臨床出具報告；成本較LC-MS低，重現(xiàn)性也好，定量下限能達到0.1 μg/mL，較適合用于臨床檢驗。

在研究過程中，血清樣品處理方法采取了蛋白沉淀法，發(fā)現(xiàn)乙腈沉淀蛋白后雜峰較少，伏立康唑目標峰形較好，回收率較高。同時還對血清和乙腈的不同體積比(1：2、1：3、1：4)進行了考察，發(fā)現(xiàn)2倍體積的乙腈去蛋白沉淀效果最好。流動相中磷酸鹽濃度配成0.01 mol/L，并采取梯度洗脫：0～5 min，40%～55%乙腈；5～10 min，55%～75%乙腈；10～15 min，75%～90%乙腈，發(fā)現(xiàn)并未使目標峰形變差，考慮對色譜柱的保護，本研究采取了0.01 mol/L的磷酸鹽作為緩沖液。用本研究中的測定方法檢測了8例重癥患者的血樣，結果顯示，患者伏立康唑濃度在1.15～8.08 μg/mL之間。高于5.0 μg/mL的4例患者中有2例患者出現(xiàn)了不良反應的癥狀，具體表現(xiàn)為：第1例患者第5天谷濃度為6.38 μg/mL，并在晚上出現(xiàn)興奮、心率加快癥狀，經(jīng)排除其他因素，考慮由伏立康唑濃度高引起，第6天濃度8.17 μg/mL，給予停藥一次處理，同時給予右美托咪定200 μg對癥治療一次，并將維持劑量調整為0.2 g，qd，ivgtt。第7天濃度7.43 μg/mL，此后患者無興奮、心跳加快等不良反應。第7例患者第30天谷濃度為5.04 μg/mL，出現(xiàn)精神異常、胡言亂語癥狀，給予停藥處理一次，因病情好轉，院外換用卡泊芬凈給藥。

在《伏立康唑個體化用藥指南》中推薦伏立康唑治療濃度范圍為0.5～5.0 μg/mL，首日給予負荷劑量，首次監(jiān)測時間為給藥后第3天；未給予負荷劑量，文獻報道一般第4～7天達穩(wěn)態(tài)，但指南中未推薦首次監(jiān)測時機，同時提示谷濃度與精神、神經(jīng)、視覺等安全性指標關聯(lián)性仍還不明確。文獻報道，伏立康唑不良反應發(fā)生率為29.26%～35.7%，包括視覺異常、肝酶升高、頭痛、焦慮、心動過速等癥狀，多數(shù)輕至中度，調整劑量或停藥可恢復[3-5]。本研究中雖有2例患者因濃度高出現(xiàn)不良反應癥狀，但樣本數(shù)太少，還需更多臨床數(shù)據(jù)來證實其相關性。抗真菌治療是需要長期服用抗真菌藥物的，這2例患者出現(xiàn)不良反應的時間一個在治療的第6天，一個在治療的第33天，分析可能是患者的不同治療階段生理病理變化引起伏立康唑濃度波動。因此對于長期服用伏立康唑患者，每周或每個月定期監(jiān)測血藥濃度非常有必要，如出現(xiàn)劑量調整、嚴重腹瀉、疾病進展加快、增加血濾或侵入性治療、臨床療效不佳或出現(xiàn)不良反應時，應及時復查濃度，對提高臨床治療效果和預防相關不良反應的發(fā)生極為重要。

深部真菌感染多數(shù)較為嚴重，加之伏立康唑代謝動力學特征，在相同給藥方案下，伏立康唑血藥濃度在0.2～12 μg/mL內均有分布[6-7]，嚴重影響著治療的療效，因此，需要更加精準的個體化治療。本研究測定伏立康唑血藥濃度的方法，具有靈敏度高、操作簡便快速、成本低等優(yōu)點，可為臨床真菌感染的精準治療提供一些指導和參考。