青海玉樹地區(qū)藏族與漢族健康兒童細胞因子和免疫球蛋白及補體C3、C4水平對比分析

范亞莉，洪軍，殷青寧，周林平，巨巧云，馬紹青，王積川

青海省婦女兒童醫(yī)院急診科，青海 西寧 810007

細胞因子是由活化免疫細胞合成分泌的具有調節(jié)細胞功能作用的多肽分子，與免疫細胞表面受體結合，參與細胞及體液免疫[1]，主要包括淋巴因子、干擾素(IFN)、白細胞介素(IL)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子和集落刺激因子等[2]。細胞因子在疾病中發(fā)揮重要調節(jié)作用，它們不僅作用于免疫系統(tǒng)和造血系統(tǒng)，還作用于神經、內分泌系統(tǒng)，對細胞的增殖分化和效應功能有重要的調節(jié)作用[3]。免疫球蛋白也是介導體液免疫的重要效應分子[4]。C3、C4通過多個補體激活途徑參與機體的免疫應答，參與抗感染的早期防御[5]。目前針對我國高海拔地區(qū)(＞3 000 m)藏族健康兒童的細胞因子及免疫球蛋白水平評估尚未見報道。因此，本研究以青海玉樹地區(qū)藏族和漢族健康兒童為研究對象，應用流式細胞儀微球芯片(cytometricbeadarray，CBA)技術和免疫比濁法對其靜脈血清中細胞因子水平和免疫球蛋白及補體水平進行檢測和分析，探討其水平變化并比較不同民族、不同性別和不同年齡之間的差異，以期為制定適用于不同年齡段兒童細胞因子檢測的正常參考值提供科學依據。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2018年12月至2019年12月在青海省婦女兒童醫(yī)院體檢中心進行健康體檢且世居在海拔＞3 000 m的青海玉樹地區(qū)的藏族兒童600例和漢族621例。藏族兒童中男性367例，女性233例；平均年齡(8.0±3.4)歲，按照年齡分組分為學齡前組(3～6歲)440例和少年組(7～14歲)160例。漢族兒童中男性337例，女性284例；平均年齡(8.6±3.0)歲，按照年齡分組分為學齡前組(3～6歲)237例和少年組(7～14歲)384例，兩組兒童的性別和年齡比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，具有可比性。納入人群必須符合以下條件：(1)外周血細胞計數、肝腎功能、X線檢查無異常；(2)無心、腦血管疾病；(3)無先天性免疫缺陷性疾病和自身免疫性疾?。?4)無3周內發(fā)生感染性疾病及急性時相反應；(5)無HBV、HCB、HIV和梅毒等慢性感染性疾病；(6)近期未使用過影響免疫系統(tǒng)的藥物者。本研究經青海省婦女兒童醫(yī)院醫(yī)學倫理學委員會審核通過(2017院倫審研第1號)，本人及家屬均知情同意。

1.2 檢測方法

1.2.1 樣本采集 于無菌條件下采集空腹12 h以上外周血3 mL，置入分離膠儲血管中，每分鐘3 000 r的速度進行離心10 min，分離血清，待測。

1.2.2 儀器與試劑 雙激光四色多參數流式細胞儀(美國BD FACS-cantoⅡ型流式細胞儀)。Th1/Th2細胞因子分析試劑盒(杭州塞基生物)。SIEMENSADVIA-2400全自動生化分析儀，診斷試劑盒(九強)。

1.2.3 流式細胞術檢測細胞因子 (1)基質B的準備：將5 mL實驗緩沖液加入到凍干粉基質B中，靜置至少15 min待凍干粉溶解，渦旋使其充分混勻。(2)標準品的制備：向標準品凍干粉中加入250 μL實驗緩沖液，室溫下靜置10 min，將其標記為C7；準備六只空管，分別標記為C6、C5、C4、C3、C2、C1，每管中加入25 μL梯度稀釋好的標準品，C0中只加入實驗緩沖液。(3)加樣步驟：標準曲線與樣本同步進行，所有試劑在使用前應當穩(wěn)定到室溫。向標準品管中加入25 μL基質B和25 μL標準品；向樣品管中加入25 μL實驗緩沖液和25 μL樣品，向所用管中加入25 μL混合微球和25 μL檢測抗體，用錫箔紙包被管子，室溫避光震蕩孵育2 h后每管中加入25 μL SA-PE，用錫箔紙包被管子，室溫避光震蕩30 min，250×g離心5 min，用移液槍將上清吸掉，再向每管中加入200 μL 1×洗滌緩沖液，250×g離心5 min，用移液槍將上清吸掉，最后向每管中加入150～300 μL洗滌緩沖液，重懸上機檢測。應用BD Cellquest軟件獲取，獲取標準品曲線，將標準品濃度和對應的熒光強度做定量標準曲線，進而根據樣本檢測的熒光強度得到檢測濃度。

1.2.4 血清免疫球蛋白檢測 儀器采用SIEMENS ADVIA-2400全自動生化分析儀，試劑盒由九強診斷產品公司提供，采用免疫比濁法檢測血清中的免疫球蛋白IgG、IgM、IgA水平。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0軟件進行數據處理。正態(tài)分布計量資料以均數±標準差(x-±s)表示，兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。非正態(tài)分布計量資料以中位數(四分位數間距)[M(P25，P75)]表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗，多組間比較采用Kruskal-WallisH檢驗。計數資料以例數及百分比(%)表示。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同民族和年齡兒童間的細胞因子水平比較 藏族兒童學齡前組和少年組之間比較，除IL-10以外，其余細胞因子比較差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。漢族學齡前與少年組之間IL-2、IL-6和IFN-γ水平比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。藏族學齡前組與漢族學齡前組的 IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z分別為-7.526、-10.969、-7.698、-1.840、-11.028和-16.325，P均＜0.05)。藏族少年組與漢族少年組的IL-4、IL-6、TNF-α、IFN-γ水平比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z分別為-2.165、-1.966、-3.074和-2.549，P均＜0.05)，見表1。

2.2 不同民族和性別兒童間的細胞因子水平比較 藏族男性與女性之間比較，只有IFN-γ差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。漢族男性與女性之間比較，各檢測項目比較差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。藏族男性和漢族男性之間比較，藏族女性和漢族女性之間比較，除IL-10以外，其余細胞因子比較差異均有統(tǒng)計學意義(Z分別為-4.558、-7.412、-7.698、-9.367、-14.109和-4.726、-6.791、-4.679、-7.800、-13.085；P均＜0.05)，且藏族細胞因子水平明顯低于漢族，見表2。

表1 藏族與漢族健康兒童細胞因子水平比較[pg/mL，M(P2.5，P97.5)]

表2 藏族與漢族不同性別健康兒童的細胞因子水平比較[pg/mL，M(P2.5，P97.5)]

2.3 不同民族和年齡兒童的免疫球蛋白及補體C3、C4水平比較 藏族兒童學齡前組和少年組之間比較，只有IgA、IgM差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；漢族健康兒童學齡前組和少年組之間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。藏族學齡前組與漢族學齡前組兒童間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均無統(tǒng)計學意義(Z分別為-1.133、-0.705、-0.467、-0.229、-1.276，P均＞0.05)。藏族少年組與漢族少年組兒童間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較差異均具有統(tǒng)計學意義(Z分別為-8.988、-6.892、-9.229、-11.380和-7.432，P均 ＜0.05)，見表3。

2.4不同民族和性別兒童間的免疫球蛋白及補體C3、C4水平比較 藏族男性與女性之間的IgG和IgM水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。漢族男性與女性間的IgA和IgM水平比較差異有統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。藏族兒童男性與漢族男性之間以及藏族兒童女性與漢族女性之間的IgG、IgA、IgM和C3、C4水平比較，差異均有統(tǒng)計學意義(Z分別為-4.769、-5.440、-5.272、-3.219、-2.789和-7.726、-6.957、-5.430、-4.510、-3.841，P均＜0.05)，見表4。

表3 藏族與漢族不同年齡兒童的免疫球蛋白補體C3、C4水平比較[g/L,MP2,5,P97,5]

表4 藏族與漢族不同性別兒童免疫球蛋白及補體C3、C4水平比較[g/L，M(P2.5，P97.5)]

3 討論

近年來細胞因子成為免疫學研究領域的熱點[6]，檢測細胞因子可監(jiān)測重癥患者是否發(fā)生“細胞因子風暴”，“細胞因子風暴”是流感后肺炎發(fā)生的重要因素，在此次新型冠狀病毒肺炎(COVID-19)疫情中，患者病情急劇惡化與體內爆發(fā)的“細胞因子風暴”密切相關，主要表現為IL-2、IL-6、IL-10和TNF-α的升高[7]；還可分清機體炎癥及免疫狀態(tài)，利于精準治療，比如促炎因子IL-6、TNF-α和IFN-γ的升高提示炎癥反應強烈，應當以抗炎為主，抗炎因子IL-4和IL-10升高提示免疫抑制狀態(tài)，應當以提升免疫為主[8]；還可指導臨床激素及抗炎藥的應用以及急性感染的早期診斷[9]；IL-6水平與肝炎嚴重程度存在正相關，提示細胞因子水平對病毒感染的進展起到關鍵作用[10]；膿毒血癥患兒出現炎癥時，血清IL-6和IL-10同時顯著升高[11]。細胞因子還與腫瘤的惡性程度呈正相關，監(jiān)測細胞因子譜變化有助于腫瘤患者療效觀察[12]；CAR-T治療中細胞因子可作為CRS(細胞因子釋放綜合征)的伴隨診斷[13]；IL-6和IL-10可由腫瘤細胞自身分泌，使淋巴瘤、骨髓瘤及前列腺癌等腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，高表達IL-6和IL-10的彌漫性大B細胞淋巴瘤患者容易復發(fā)耐藥，預后不良[14-15]。細胞因子作為調節(jié)免疫應答的重要介質在免疫排斥反應的起始階段即可出現明顯變化，研究表明，在排斥反應過程中常伴有Th1型細胞因子表達增高和Th2型細胞因子不表達或低表達，而在免疫耐受時則相反[16]。此外，在不同的自身免疫性疾病中，Th1/Th2平衡失調的表現也各不相同。

高原低氧環(huán)境可引起機體免疫功能下降，導致免疫功能紊亂，誘導炎性介質產生，增加機體的炎癥反應易感性，比如帶狀皰疹病毒、免疫異常性皮膚病及腦損傷局部炎性反應等[17]，因此，了解高原低壓低氧環(huán)境下機體各細胞因子的表達水平有非常重要的意義。本研究結果表明：民族和年齡是造成細胞因子指標差異的關鍵因素，除IL-10外，藏族兒童各細胞因子隨年齡增長表達水平均增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)；而漢族有具有不同的年齡變化趨勢，漢族兒童IL-2和IFN-γ隨著年齡增長表達水平下降，其余增高，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，這與劉怡等[18]研究結果一致。蘭萱等[19]分析了100名鄭州地區(qū)健康漢族成年人的細胞因子，表明低海拔正常人群中血清細胞因子水平不受性別及年齡影響，結論與本研究不同，這可能與研究對象的年齡、人數、生活環(huán)境、飲食習慣和海拔高度不同有關。本研究結果還顯示，除IL-10外，不論整體比較還是男性和女性分別比較，藏族各細胞因子表達水平均低于漢族，說明民族也是造成細胞因子指標差異的重要因素。藏族健康兒童僅有IFN-γ男性略高于女性，其余指標均無性別差異，漢族所有指標均沒有性別差異，這表明性別可能不是細胞因子影響因素，這還需要進一步研究。

本研究結果還顯示，藏族兒童IgA、IgM隨年齡增長表達水平增高，其余差異無統(tǒng)計學意義；而漢族漢族兒童免疫球蛋白及補體C3、C4隨著年齡增長表達水平均增高，說明高原漢族兒童隨著年齡增長，對暴露的抗原刺激變得更敏感，免疫系統(tǒng)逐漸發(fā)育成熟而導致分布不同，而高原藏族兒童僅有IgA、IgM水平符合這一規(guī)律，具體原因還有待繼續(xù)研究；不同民族之間比較，藏族和漢族學齡前組差異無統(tǒng)計學意義，而少年組差異有統(tǒng)計學意義，說明隨著年齡增長，不同民族造成免疫系統(tǒng)發(fā)育的差異才開始顯示出來，且藏族健康兒童免疫球蛋白及補體C3、C4水平整體高于漢族，這點與細胞因子檢測結果相反，表明藏族兒童免疫反應能力較漢族兒童更強，可能與藏族居住青藏高原歷史較長，對高原低氧環(huán)境有較強的耐受力和有不同于漢族的低氧適應機制。本研究通過分析不同年齡段藏族和漢族健康兒童細胞因子、免疫球蛋白及補體C3、C4的表達水平，以求將此技術應用于臨床來探討細胞因子在各種兒童疾病中所發(fā)生的改變，更有效地為臨床提供診斷依據。