5水平冰凍混合人血清尿酸候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研制

江雅平，徐國兵，劉 歐

（1.北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京 100034；2.北京大學(xué)腫瘤醫(yī)院檢驗科，北京 100142；3.清華大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科，北京 100016）

血清中尿酸（uric acid，UA）含量的測定可為痛風(fēng)、腎臟疾病、心腦血管疾病[1]、糖尿病[2]、高血壓[3]、代謝綜合征[4]等多種疾病的診斷、治療和預(yù)后評估提供重要依據(jù)。因此，UA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確可靠對于臨床極其重要?；ネㄐ院玫臉?biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是驗證常規(guī)檢測系統(tǒng)準(zhǔn)確性的理想物質(zhì)。UA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有UA純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 913a、GBW 09202和血清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)SRM 909b、909c。純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于參考方法的定值，血清基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)一般用于參考方法正確度的考察。SRM 913a、909b、909c和GBW 09202都為凍干粉末，這些物質(zhì)在常規(guī)檢測系統(tǒng)之間往往不具互通性，因此不能用于常規(guī)檢測系統(tǒng)的準(zhǔn)確性評定。目前，尚沒有源于人體樣本或無基質(zhì)效應(yīng)的UA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，與待測人體樣本具有相同基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可用于UA常規(guī)檢測系統(tǒng)精度及正確度的評價。另外，國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)價格昂貴、購買和運輸受限，給我國UA測定的量值溯源帶來很大困難。本研究根據(jù)《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》[5]（簡稱ISO Guide 35）的要求，采用公認(rèn)無基質(zhì)效應(yīng)的新鮮冰凍人血清，研制了5個濃度的UA候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并對其進行了定值、均勻性、穩(wěn)定性、互通性考察，同時對定值結(jié)果進行了不確定度評價。

1 材料和方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

收集乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、人類免疫缺陷病毒為陰性，無肉眼可見脂血、溶血和黃疸的5個UA濃度混合健康人血清，分別命名為C1、C2、C3、C4、C5，確保所研制的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的生物安全性符合要求。血清經(jīng)離心、粗濾后，用0.22 μm的硝酸纖維素膜過濾，充分混勻后分裝于1.8 mL凍存管中，0.5 mL/支，每個濃度1 000支，-70 ℃保存?；旌戏盅b全過程在無菌超凈臺進行。

1.2 主要儀器與試劑

硝酸纖維素膜（德國Sartorius公司）、帶蓋漏斗過濾器（美國Pall公司）、SHB-A型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城公司）、連續(xù)分配器（德國Brand公司）、凍存管（丹麥Nunc公司）。

1.3 方法

1.3.1 均勻性評價 按ISO Guide 35[5]要求，隨機抽取-70 ℃保存的C1～C5各10支（分別標(biāo)號為1、2、3、4、5、6、7、8、9、10），每支重復(fù)測定3次，采用DXC 800全自動生化分析儀（美國Beckman-Coulter公司）由同一操作者在盡可能短的時間內(nèi)完成測量。測量順序：第1次，1-3-5-7-9-2-4-6-8-10；第2次，10-9-8-7-6-5-4-3-2-1；第3次，2-4-6-8-10-1-3-5-7-9。對檢測結(jié)果進行單因素方差分析，若P＞0.05，說明樣本間是均勻的。計算瓶間變異，瓶間均勻性的標(biāo)準(zhǔn)不確定度（ubb）計算公式為：

式中MSamong為組間均方，MSwithin為組內(nèi)均方，n為測定次數(shù)。樣品測定前，對DXC 800全自動生化分析儀進行校準(zhǔn)后測定質(zhì)控品，質(zhì)控結(jié)果合格后再進行樣品測定。

1.3.2 穩(wěn)定性評價 隨機抽取一定量C1～C5，分別于室溫、4 ℃和-20 ℃放置，采用DXC 800全自動生化分析儀檢測，觀察其穩(wěn)定性。室溫和4 ℃放置的標(biāo)本，分別于第1、2、3、6、7、9、11、14和15天測量UA。-20 ℃放置的標(biāo)本分別于第1、6、12、19、27、42、65、93和115天測量UA。-70 ℃放置的標(biāo)本，每個濃度每月隨機抽取1管測量UA。每管檢測2次，取均值。參照ISO Guide 35[5]要求，求出各溫度條件下各水平UA濃度與時間關(guān)系的直線回歸方程，對方程進行線性回歸方差分析以評估穩(wěn)定性。若P＞0.05，說明斜率的變化無統(tǒng)計學(xué)意義，UA結(jié)果不隨時間產(chǎn)生趨勢性變化，即所制備的冰凍血清物質(zhì)在此段時間內(nèi)是穩(wěn)定的。穩(wěn)定性對不確定度的評價包括長期不穩(wěn)定性的不確定度（ults）和短期不穩(wěn)定性的不確定度（usts）。usts主要考慮樣本通過運輸?shù)竭_使用者處過程中帶來的不穩(wěn)定性，若用干冰運輸，并在短時間內(nèi)到達，此時usts可以忽略，即usts=0。

1.3.3 定值 3家UA候選參考實驗室參與C1～C5的賦值，其中2家[北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科和中生北控科技股份有限公司（簡稱中生北控）]用1993年日本臨床化學(xué)會推薦的以高氯酸去蛋白的反相高效液相色譜紫外檢測法（reversed-phase high performance liquid chromatography with ultraviolet detection，RPHPLC-UV）[6]為C1～C5賦值；另外1家為通過中國合格評定國家認(rèn)可委員會ISO 17025和ISO 15195實驗室認(rèn)可的實驗室[國家衛(wèi)生健康委臨床檢驗中心（簡稱臨檢中心）]，采用同位素稀釋液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法（isotope dilution liquid chromatography tandem mass spectrometry，ID-LC/MS/MS）為C1～C5賦值。北京大學(xué)第一醫(yī)院檢驗科與中生北控都通過測量國際有證參考物質(zhì)SRM 909b和2008年的國際參考實驗室室間比對計劃（Ring Trials for Reference Laboratories，RELA）比對樣本，驗證了參考方法的準(zhǔn)確性，且通過與臨檢中心建立的ID-LC/MS/MS進行比對[7]，以及參加2010年由國際臨床化學(xué)和檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會委托德國臨床化學(xué)協(xié)會組織的參考實驗室間UA RELA比對，進一步驗證了準(zhǔn)確性。每個實驗室對C1～C5每天測量2次（分別在上午、下午進行），連續(xù)測量5 d，剔除離群值后，取全部結(jié)果的平均值為靶值。定值結(jié)果用“靶值±總不確定度（uCRM）”表示。每次定值測量中均測定有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，保證測定結(jié)果的有效性。參照ISO Guide 35[5]，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的總不確定度（uCRM）是通過合成定值測量、均勻性和穩(wěn)定性對特征值不確定度的貢獻來評估的，計算公式為：

定值測量不確定度（uchar）主要為定值測定變異（s），取擴展因子k=2，計算公式為：

1.3.4 反復(fù)凍融 將C1～C5各取5份，-20 ℃保存，取出后室溫條件下解凍2 h，再放回-20 ℃保存2 h；再取C1～C5各4份，室溫解凍2 h，如此反復(fù)，使C1～C5均有反復(fù)凍融1～5次的標(biāo)本。采用DXC 800全自動生化分析儀同時檢測上述標(biāo)本UA。采用線性回歸分析C1～C5反復(fù)凍融1～5次對UA濃度的影響。

1.3.5 互通性 參照美國國家臨床實驗室標(biāo)準(zhǔn)委員會EP14-A2文件[8]，收集39份不同濃度的UA新鮮患者血清（100～856 μmol/L）。每份血清僅由3～5份患者的標(biāo)本混合獲得，0.25 mL/支分裝于20支凍存管。將39份新鮮血清樣本和C1～C5于本實驗室建立的RP-HPLC-UV和15套生化檢測系統(tǒng)（表1）上測定2次UA，取均值，以RP-HPLC-UV法測量值為橫坐標(biāo)，常規(guī)方法測量值為縱坐標(biāo)，采用SPSS 22.0軟件計算15套生化檢測系統(tǒng)（常規(guī)方法）與RP-HPLC-UV方法的相關(guān)方程式、相關(guān)系數(shù)、斜率的95%可信區(qū)間；繪制新鮮患者血清在RP-HPLC-UV和幾種常規(guī)方法間的回歸直線及95%可信區(qū)間，觀察C1～C5的坐標(biāo)點是否位于95%可信區(qū)間內(nèi)。如在，則表明C1～C5在該檢測系統(tǒng)的反應(yīng)性與收集的新鮮患者血清相似，具有互通性。

表1 15套檢測系統(tǒng)的構(gòu)成

2 結(jié)果

2.1 均勻性

C1～C5均勻性檢驗的原始數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，單因素方差分析均顯示P＞0.05，說明C1～C5分裝后是均勻的。瓶間變異均＜1%。見表2。

2.2 穩(wěn)定性

線性回歸分析結(jié)果顯示,C1～C5室溫放置7 d和4 ℃放置9 d，UA濃度是穩(wěn)定的（P＞0.05），-20 ℃ UA濃度至少可穩(wěn)定115 d（P＞0.05）。C1～C5于-70 ℃可保存15個月，時間與濃度的直線回歸方程的斜率與0無差異（P＞0.05），表明濃度穩(wěn)定。見表3。

表2 C1～C5均勻性調(diào)查結(jié)果

表3 C1～C5 -70℃ UA濃度穩(wěn)定性調(diào)查結(jié)果 μmol/L

2.3 定值

C1～C5的靶值±uCRM分別為（70.00±3.12）、（281.67±4.69）、（383.00±6.46）、（431.00±9.95）和（520.00±12.10）μmol/L。見表4。

表4 C1～C5定值結(jié)果 μmol/L

2.4 反復(fù)凍融

線性回歸分析結(jié)果顯示，-20 ℃保存的C1～C5反復(fù)凍融1～5次，對UA濃度均無影響（P＞0.05）。見圖1。

2.5 互通性

39份人血清在15套生化檢測系統(tǒng)與HPLCUV方法間UA測定結(jié)果的相關(guān)性良好，相關(guān)系數(shù)均≥0.999，見表5。C1～C5 UA測定結(jié)果坐標(biāo)點均在回歸直線95%可信區(qū)間內(nèi)，說明制備的C1～C5同人新鮮血清樣本基質(zhì)相似，在這些常規(guī)檢測系統(tǒng)上表現(xiàn)出良好的互通性。以Hitachi 7600系統(tǒng)為例，見圖2。

圖1 -20℃保存的C1～C5反復(fù)凍融1～5次UA濃度變化

表5 15套生化檢測系統(tǒng)與HPLC-UV方法的相關(guān)性和各方法C1～C5的檢測值

圖2 C1～C5在Hitachi 7600上與血清的反應(yīng)性

3 討論

參考系統(tǒng)是醫(yī)學(xué)檢驗標(biāo)準(zhǔn)化的基礎(chǔ)，構(gòu)成參考系統(tǒng)最重要的2個要素是參考方法和參考物質(zhì)。與參考方法相比，參考物質(zhì)的使用更為簡單、快捷，在量值溯源和傳遞過程中起著非常關(guān)鍵的作用?；ネㄐ允侵竻⒖嘉镔|(zhì)在不同分析方法間具有與人體樣本相同的反應(yīng)特性。具有互通性的參考物質(zhì)可以用于常規(guī)方法的校準(zhǔn)。由于基質(zhì)效應(yīng)，純度標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在常規(guī)系統(tǒng)上往往不具有互通性。目前普遍使用的UA參考物質(zhì)為凍干品，凍干品在制備和使用過程中，分裝、凍干及復(fù)溶等會使整個溯源過程產(chǎn)生偏差。本研究制備的5水平UA冰凍混合人血清未使用處理過的材料或0.9%氯化鈉溶液進行稀釋，保證了在標(biāo)準(zhǔn)化過程中所有參考物質(zhì)與天然患者血清無差異，具有相同的基質(zhì)。通過15個月的觀察，UA -70 ℃保存具有良好的穩(wěn)定性，液體血清由于避免了因凍干、復(fù)溶等導(dǎo)致的誤差，因此瓶間變異小，精密度較高，且使用方便。

本研究調(diào)查C1～C5互通性的同時，還調(diào)查了11份商品化的校準(zhǔn)液和質(zhì)控品在常規(guī)系統(tǒng)中的互通性，包括Dade校準(zhǔn)液（3個水平）、Beckman-Coulter校準(zhǔn)液、中生校準(zhǔn)液、Roche cfas.校準(zhǔn)液，朗道質(zhì)控品（2個水平）和伯樂質(zhì)控品（3個水平）。采用與調(diào)查C1～C5互通性相同的方法，繪制RP-HPLC-UV與常規(guī)檢測系統(tǒng)測定39份人血清結(jié)果的回歸直線圖，觀察11份校準(zhǔn)液和質(zhì)控品的坐標(biāo)點是否在39份人血清回歸直線的95%可信區(qū)間內(nèi)。結(jié)果顯示，高值Dade校準(zhǔn)液在Beckman-Coulter、Ortho-Vitros、Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中均不具互通性，Beckman-Coulter校準(zhǔn)液在Beckman-Coulter、Ortho-Vitros、Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中均不具互通性，中生北控和Roche cfas.校準(zhǔn)液互通性最好，在所調(diào)查的常規(guī)檢測系統(tǒng)中均具有互通性，高值朗道質(zhì)控品在Dade、Roche和Hitachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性，高值伯樂質(zhì)控品在Dade、Roche和Hithachi常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性，中值伯樂質(zhì)控品在Dade和Roche常規(guī)檢測系統(tǒng)中不具互通性。低值UA校準(zhǔn)液或質(zhì)控品較高值UA有更好的互通性。本研究制備的UA濃度為70～520 μmol/L的冰凍混合人血清物質(zhì)在所納入的15套生化檢測系統(tǒng)中均有良好的互通性。

本研究應(yīng)用制備的冰凍混合人血清評價了北京部分醫(yī)院Roche、Beckman-Coulter、Ortho、Hitachi 4個品牌共20套檢測系統(tǒng)（每個品牌5套檢測系統(tǒng)）的分析性能，結(jié)果表明，4個品牌的UA常規(guī)檢測系統(tǒng)的精密度、相對偏差以及總誤差均符合生物學(xué)變異的適宜標(biāo)準(zhǔn)（變異系數(shù)＜4.3%，偏移＜4.8%，總誤差＜11.9%）[9]，與MILLER等[10]的研究結(jié)果一致，提示UA常規(guī)檢測系統(tǒng)具有良好的分析性能和一致性。

理想條件下，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性和穩(wěn)定性應(yīng)采用參考方法進行評價，但參考方法運行困難，無法隨時開展，故本研究選用精密度較好的Beckman-Coulter DXC 800全自動生化分析儀測量UA。綜上，本研究成功制備了5個濃度的UA冰凍血清標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，其均勻性和穩(wěn)定性良好，定值可靠，在常規(guī)檢測系統(tǒng)上具有互通性，可作為UA候選二級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)用于UA常規(guī)檢測系統(tǒng)精密度及正確度的評價，也可作為商品化校準(zhǔn)物及質(zhì)控物定值溯源的標(biāo)準(zhǔn)，進一步促進我國UA檢驗的標(biāo)準(zhǔn)化工作。