磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的性能評估及成年女性AMH參考區(qū)間的建立

岳朝艷，段朝暉，章 迪，韋 婕，羅曉紅，張倩嵐，伍 勇，應(yīng)春妹

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，上海 200011；2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510120；3.中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院，湖南 長沙 410205 ）

抗苗勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）是轉(zhuǎn)化生長因子β超家族的一員，由2個(gè)相對分子質(zhì)量為72 000的二聚體單體組成，通過二硫鍵連接。女性AMH由卵泡顆粒細(xì)胞合成，是調(diào)節(jié)卵泡成熟的關(guān)鍵激素。AMH反映了卵巢竇狀卵泡和竇前卵泡的數(shù)量，也有助于評估卵巢功能[1]。目前，檢測AMH的方法主要為酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和化學(xué)發(fā)光法。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)結(jié)果易受多種因素影響[2-4]，隨著檢測需求的增多，自動化免疫學(xué)方法可能更適用臨床。本研究依據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）發(fā)布的EP系列文件對國產(chǎn)磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的性能進(jìn)行驗(yàn)證和評估，并建立我國成年女性AMH的參考區(qū)間。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年1—12月女性健康體檢者1 089名，其中349名來自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院、464名來自中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院、276名來自中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院。180例用于相關(guān)性分析的樣本包括104名健康女性、21例卵巢早衰患者、55例多囊卵巢綜合征患者。健康女性來自復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院體檢中心，卵巢早衰和多囊卵巢綜合征均為復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院生殖內(nèi)分泌門診確診患者。健康女性納入標(biāo)準(zhǔn)：女性；年齡20～60歲；無自身免疫性疾病或炎癥性疾?。唤?個(gè)月內(nèi)無激素治療史，如雌激素、孕激素或口服避孕藥物；無卵巢切除手術(shù)史；無多囊卵巢綜合征；體質(zhì)量指數(shù)（body mass index，BMI）＜26.9 kg/m2。

1.2 方法

1.2.1 儀器和試劑 iFlash 3000化學(xué)發(fā)光免疫分析儀（深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司）及配套AMH試劑（磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法）。cobas e601全自動電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀及配套AMH試劑（電化學(xué)發(fā)光法）。

1.2.2 樣本采集 采用分離膠/促凝劑采血管采集所有對象靜脈血5 mL，靜置30 min，1 000×g離心15 min。所有樣本均在采集后2 h內(nèi)處理完畢，-80 ℃保存，統(tǒng)一檢測。所有樣本均僅解凍1次。

1.2.3 性能評估 性能評價(jià)項(xiàng)目包括空白限、檢測限、定量限、精密度（重復(fù)性、批間精密度和總不精密度）及與電化學(xué)發(fā)光法的比對。所有性能評估實(shí)驗(yàn)均在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科完成?？瞻紫?、檢測限和定量限根據(jù)CLSI EP17-A2文件[5]的要求確定。精密度根據(jù)CLSI EP5-A3文件[6]的要求確定。在CLSI EP6-A文件[7]要求的基礎(chǔ)上，采用多項(xiàng)回歸分析進(jìn)行線性范圍驗(yàn)證，線性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果為一階方程式判定為線性，檢測樣本的最低值和最高值之間為線性區(qū)間。

1.2.4 方法學(xué)比對和偏移評估 以電化學(xué)發(fā)光法為參比方法，磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法為實(shí)驗(yàn)方法。采用2種方法同時(shí)檢測104名健康女性、21例卵巢早衰患者、55例多囊卵巢綜合征患者的血清AMH水平。2種方法的相關(guān)性采用線性回歸方程Y=bX+a評估。偏移評估：將給定的醫(yī)學(xué)決定水平（Xc）代入線性回歸方程，計(jì)算實(shí)驗(yàn)方法（Y）與參比方法（X）之間的系統(tǒng)誤差（systematic error，SE）和相對偏移（SE%），SE=Yc-Xc，SE%=SE/Xc×100%。方法學(xué)評估的SE%低于室間質(zhì)量評價(jià)允許誤差范圍，則認(rèn)為不同檢測系統(tǒng)間的測定結(jié)果具有可比性。

1.2.5 不同樣本類型的比較 分別采用不同的采血管[無抗凝劑真空管、分離膠促凝劑管、肝素鋰抗凝管、檸檬酸鈉抗凝管、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA）抗凝管]采集11名健康體檢者全血，進(jìn)行配對比較，計(jì)算不同抗凝管樣本與無抗凝劑真空管樣本之間的Passing-Bablok回歸方程及平均偏差。試驗(yàn)均在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.2.6 血清樣本在不同保存時(shí)間和保存溫度下的穩(wěn)定性 收集11名健康體檢者的血清樣本，立即采用磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH，以此作為基線水平，AMH范圍為0.68～18.48 ng/mL。然后將每份血清等分為17份，分別保存于室溫（20～25℃）、4 ℃、-20 ℃和-80 ℃，每天檢測1份樣本，共檢測7 d。計(jì)算不同時(shí)間、不同保存溫度的樣本的檢測結(jié)果與基線水平的平均百分差值。試驗(yàn)均在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科完成。

1.2.7 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法成年女性AMH參考區(qū)間的建立 將1 089名健康體檢女性按年齡分組（20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、40～44歲、45～49歲和≥50歲），采用磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測血清AMH水平。檢測分別在復(fù)旦大學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院檢驗(yàn)科、中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院檢驗(yàn)科和中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院檢驗(yàn)科完成，檢測系統(tǒng)校準(zhǔn)合格，室內(nèi)質(zhì)控在控。選擇AMH檢測結(jié)果的第2.5百分位數(shù)（P2.5）～第97.5百分位數(shù)（P97.5）作為參考區(qū)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用GraphPad Prism 5.0軟件和MedCalc 11.4軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示，2個(gè)組之間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，Z值＜Z*值表示不需分組。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測性能的驗(yàn)證

磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的空白限為0.001 ng/mL，檢出限為0.02 ng/mL，定量限為0.08 ng/mL。低值樣本的重復(fù)性為1.3%、批間精密度為2.2%、總不精密度為3.2%。高值樣本的重復(fù)性為1.6%、批間精密度為2.1%、總不精密度為3.1%、線性范圍為0.02～27.22 ng/mL。2種方法的檢測性能見表1。

表1 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法和電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的性能

2.2 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光法的相關(guān)性

磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光法的線性回歸方程為Y=0.998 8X+0.179 5（r=0.975 3，P＜0.05），2種方法的相關(guān)性良好。

2.3 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的偏移評估

以電化學(xué)發(fā)光法為參比方法，磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH低值（1 ng/mL）的相對偏移為17.8%，絕對偏差為0.178 3 ng/mL，可滿足臨床需求。其他濃度的相對偏移和絕對偏差均在允許范圍內(nèi)。2種方法的一致性較好。見表2。

表2 磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法與電化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的偏移評估

2.4 不同抗凝管樣本與無促凝劑真空管樣本的比較

不同抗凝管樣本與無促凝劑真空管樣本比較，檢測結(jié)果均呈線性相關(guān)。因此，血清和血漿均可作為磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的樣本。見表3。

表3 不同抗凝管樣本與無促凝劑真空管樣本的比較

2.5 不同保存時(shí)間和保存溫度的穩(wěn)定性比較

血清樣本在室溫（20～25 ℃）條件下可穩(wěn)定3 d，在4、-20、-80 ℃條件下可穩(wěn)定7 d，見圖1。

圖1 AMH檢測的穩(wěn)定性

2.6 成年女性AMH參考區(qū)間及變化趨勢

成年女性AMH參考區(qū)間的建立基于多中心研究，本研究覆蓋了3個(gè)不同的地區(qū)，結(jié)果顯示，3個(gè)地區(qū)AMH水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表4。

表4 各地區(qū)AMH水平比較 M（P25～P75）

按年齡分組后顯示，50歲以上的婦女AMH水平很低，因此歸為1個(gè)年齡組。以檢測結(jié)果的P2.5～P97.5作為參考范圍。20～24歲、25～29歲、30～34歲、35～39歲、40～44歲、45～49歲和≥50歲的成年女性的AMH參考區(qū)間分別為1.20～10.21、1.14～9.17、0.55～8.18、0.25～7.02、0.07～4.59、0.01～2.11、＜0.39 ng/mL，見表5。回歸模型顯示血清AMH水平隨年齡的增長而下降，見圖2。

表5 成年女性血清AMH的參考區(qū)間 ng/mL

圖2 AMH隨年齡變化的趨勢

3 討論

血清AMH水平可以準(zhǔn)確反映竇狀卵泡的儲備，是評估卵巢儲備功能的可靠指標(biāo)。AMH與經(jīng)陰道超聲評估的竇狀卵泡數(shù)有強(qiáng)相關(guān)性，AMH和竇狀卵泡數(shù)與存在于卵巢組織中的原始卵泡數(shù)量之間也有良好的相關(guān)性[8-9]。AMH水平能夠反映卵細(xì)胞以及卵泡池隨著年齡增加不斷下降的趨勢，因此可用于判斷卵巢老化程度及更年期預(yù)測[10-11]。在卵巢儲備功能降低、早發(fā)性卵巢功能不全和卵巢早衰出現(xiàn)癥狀之前，AMH是目前最早、最準(zhǔn)確的血清學(xué)診斷指標(biāo)之一[12]。AMH在卵巢功能不全時(shí)顯著降低，提示卵泡池過早耗盡。AMH除了預(yù)測生殖壽命之外，還可用于優(yōu)化生育治療，在進(jìn)行體外受精聯(lián)合胚胎移植術(shù)時(shí)可用AMH來預(yù)測結(jié)果，其中最重要的是預(yù)測卵巢反應(yīng)情況，有助于判定卵巢超刺激的個(gè)體化方案。AMH還有助于評估早期診斷卵巢功能失調(diào)，特別是多囊卵巢綜合征，為臨床決策提供合理參考。雖然AMH在臨床上應(yīng)用廣泛，但目前國內(nèi)尚無統(tǒng)一的血清AMH參考區(qū)間。根據(jù)ISO15189：2003（E）標(biāo)準(zhǔn)的要求，實(shí)驗(yàn)室必須為臨床提供本地區(qū)檢驗(yàn)項(xiàng)目可靠的參考區(qū)間，以便為臨床上區(qū)分健康與患病、診斷、預(yù)防及治療提供高質(zhì)量的保證。

本研究使用的AMH檢測試劑（磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法）使用了2個(gè)小鼠單克隆抗體，分別針對AMH分子上的pro-和mature-區(qū)域。樣本中的AMH、抗AMH包覆的順磁性微粒與吖啶標(biāo)記的抗AMH共軛反應(yīng)形成“三明治”復(fù)合物，同時(shí)檢測AMH的非共價(jià)復(fù)合物形式和未切割的pro-AMH；該方法使用的抗體只特異性地與人源性的AMH結(jié)合，避免了其他種屬的干擾，可以有效提高檢測的敏感性和特異性[13-14]。

準(zhǔn)確的AMH參考區(qū)間是其臨床應(yīng)用的必要條件。美國貝克曼庫爾特公司和瑞士羅氏公司的AMH檢測系統(tǒng)可以溯源至AMH GEN Ⅱ酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）。雖然美國貝克曼庫爾特公司的化學(xué)發(fā)光法與瑞士羅氏公司的電化學(xué)發(fā)光法具有可比性，但這2種方法的檢測結(jié)果與ELISA的檢測結(jié)果有一定差異。美國貝克曼庫爾特公司新的化學(xué)發(fā)光法使用了與AMH GEN ⅡELISA方法類似的校正材料，其AMH檢測結(jié)果仍比AMH GEN Ⅱ ELISA平均低22%[15]。然而，DEMIRDJIAN等[11]的研究結(jié)果顯示，美國貝克曼庫爾特公司的化學(xué)發(fā)光法AMH檢測結(jié)果與AMH GEN Ⅱ ELISA具有可比性[16]。這些互相矛盾的結(jié)論可能是由于ELISA的準(zhǔn)確性和重復(fù)性較低所致。雖然AMH GEN Ⅱ ELISA已被廣泛應(yīng)用，但使用相同單克隆抗體的試劑盒相對不穩(wěn)定。為此，美國貝克曼庫爾特公司發(fā)布了一份“現(xiàn)場安全通知”（FSN-20434-3），內(nèi)容涉及在將樣本添加到反應(yīng)板之前與稀釋液預(yù)混合，該程序可消除補(bǔ)體干擾。

血液中AMH由pro-AMH和AMHNC 2個(gè)部分組成，前者為非活性的未裂解前體，后者為酶裂解、受體活性形式。AMH GEN Ⅱ ELISA可同時(shí)檢測出重組pro-AMH和AMHNC[16]。瑞士羅氏公司和美國貝克曼庫爾特公司的AMH檢測抗體使用了2種小鼠單克隆抗體，第1種是生物素標(biāo)記的AMH特異性小鼠單克隆抗體（Mab F2B/12H；IgG2a亞類），第2種是磺基釕標(biāo)記的AMH小鼠檢測單克隆抗體（Mab F2B/7A；IgG2b亞類）。這2種單克隆抗體都來自美國貝克曼庫爾特公司?？贵w優(yōu)先與AMH mature-區(qū)域（Mab F2B/12H）和AMH pro-區(qū)域（Mab F2B/7A）結(jié)合[16-18]。AMH標(biāo)準(zhǔn)品的缺乏是導(dǎo)致AMH檢測結(jié)果出現(xiàn)差異的重要因素，因此目前迫切需要對AMH標(biāo)準(zhǔn)品達(dá)成一致，以便對AMH的檢測系統(tǒng)進(jìn)行校準(zhǔn)，避免檢測報(bào)告與結(jié)果解釋的混亂。美國貝克曼庫爾特公司的化學(xué)發(fā)光法和瑞士羅氏公司的電化學(xué)發(fā)光法AMH檢測結(jié)果可以溯源至AMH GEN Ⅱ ELISA。本研究使用的磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法可溯源至羅氏的化學(xué)發(fā)光法Elecsys AMH[19]。

綜上所述，磁微粒吖啶酯化學(xué)發(fā)光法檢測AMH的性能參數(shù)（空白限、檢出限、定量限、精密度、線性范圍）均符合驗(yàn)證要求，與電化學(xué)發(fā)光法有較高的相關(guān)性，且血清樣本在不同儲存時(shí)間和不同貯藏溫度下檢測AMH均有較好的穩(wěn)定性，可提供可靠的檢驗(yàn)結(jié)果。另外，本研究還初步建立了成年女性AMH的參考區(qū)間，可為臨床正確解釋AMH水平提供更可靠的參考，為AMH項(xiàng)目在臨床上的廣泛開展提供科學(xué)依據(jù)。