膽汁酸譜在肺炎和肺癌鑒別診斷中的應(yīng)用價值

徐潤灝，鄒 琛，張 潔，李 敏，張舒林

（1.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，上海 200025；2.上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院檢驗科，上海 200001）

肺癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，占惡性腫瘤死亡人數(shù)的25%[1]。血清學(xué)檢查相對于其他檢查手段，具有簡單、快速、無痛、微創(chuàng)等特點，適用于肺癌的初篩及輔助診斷。膽汁酸按結(jié)構(gòu)可分為游離膽汁酸和結(jié)合膽汁酸，按來源又可分為初級膽汁酸和次級膽汁酸。初級膽汁酸是肝細(xì)胞以膽固醇為原料直接合成的膽汁酸，包括膽酸（cholic acid，CA）、鵝脫氧膽酸（chenodeoxycholic acid，CDCA）及相應(yīng)的結(jié)合膽汁酸；次級膽汁酸由初級膽汁酸隨膽汁進入腸道，在回腸、結(jié)腸上段由腸道菌、酶催化，脫去羥基轉(zhuǎn)化而成，包括脫氧膽酸（deoxycholicacid，DCA）、石膽酸（lithocholic acid，LCA）、熊脫氧膽酸（ursodeoxycholic acid，UDCA）及相應(yīng)的結(jié)合膽汁酸。根據(jù)以往的認(rèn)知，由于膽汁酸主要存在于腸肝循環(huán)系統(tǒng)中，因此關(guān)于膽汁酸譜的研究多與肝膽疾病、腸道疾病相關(guān)，與肺部疾病相關(guān)的報道極少。近年來，有研究結(jié)果顯示，在一些呼吸系統(tǒng)疾病患者中，其支氣管肺泡灌洗液內(nèi)含有較高水平的膽汁酸[2]，且合并胃食管反流病的概率也相當(dāng)高[3]。還有研究結(jié)果顯示，法尼醇X受體（farnesoid X receptor，F(xiàn)XR）、G蛋白偶聯(lián)受體5（takeda G protein-coupled receptor 5，TGR5）等膽汁酸受體在肺組織中有不同程度地表達[4-5]，這些膽汁酸受體在肺部參與多種信號通路的激活[6-9]，且在肺癌組織中表達上調(diào)[8-9]。為此，本研究擬探討血清膽汁酸譜在肺癌中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018年9月—2019年6月上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院經(jīng)組織病理學(xué)檢查確診為原發(fā)性非小細(xì)胞肺癌的患者108例（肺癌組），其中男75例、女33例，年齡39～84歲；根據(jù)臨床進展分為早中期（Ⅰ～Ⅲ期53例）、晚期（Ⅳ期51例）；根據(jù)病理分期分為鱗癌（34例）、腺癌（74例）；排除已知伴有肝、腸等消化道器官轉(zhuǎn)移的患者。選取經(jīng)檢查排除肺部腫瘤，診斷為肺炎的患者80例（肺炎組），其中男41例、女39例，年齡25～92歲。所有患者均排除肝功能異常、腸道炎癥、膽囊結(jié)石以及腸道切除等病癥，并排除服用過膽汁酸受體激動劑及免疫抑制劑者。另選取上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院體檢中心健康體檢者106名（正常對照組），其中男62名、女44名，年齡41～84歲，入組標(biāo)準(zhǔn)：胃腸道功能未見異常，且排除糖尿病、高血壓、慢性肝膽疾病及肝、腎功能等異常。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 采用含促凝劑的真空采血管采集所有對象空腹靜脈血4 mL，2 h內(nèi)16 000×g離心10 min，分離血清。

1.2.2 膽汁酸譜檢測 采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography tandemmass spectrometry，LC-MS/MS）檢測膽汁酸譜，包括5種游離膽汁酸（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA）及10種結(jié)合膽汁酸[甘氨膽酸（glycocholic acid，GCA）、甘氨鵝脫氧膽酸（glycochenodeoxycholic acid，GCDCA）、甘氨脫氧膽酸（glycodeoxycholic acid，GDCA）、甘氨石膽酸（glycolithocholic acid，GLCA）、甘氨熊脫氧膽酸（glycoursodeoxycholic acid，GUDCA）、?；悄懰幔╰aurocholic acid，TCA）、?；蛆Z脫氧膽酸（taurochenodeoxycholic acid，TCDCA）、?；敲撗跄懰幔╰aurodeoxycholic acid，TDCA）、牛磺石膽酸（taurolithocholic acid，TLCA）、?；切苊撗跄懰幔╰auroursodeoxycholic acid，TUDCA）]，檢測儀器為API3200MD三重四級桿質(zhì)譜儀（美國ABSciex公司）及Shimadzu 20AD液相色譜儀（日本島津公司），試劑購自上海可力梅塔生物醫(yī)藥科技有限公司。

1.2.3 總膽汁酸（total bile acid，TBA）檢測 采用酶循環(huán)法檢測TBA。檢測儀器為7600全自動生化分析儀（日本日立公司），試劑購自四川邁克生物股份有限公司。

1.2.4 腫瘤標(biāo)志物檢測 采用cobas e801全自動電化學(xué)發(fā)光分析儀（瑞士羅氏公司）及配套試劑（電化學(xué)發(fā)光法）檢測糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）125、CA19-9、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角蛋白19片段（cytokeratin 19 fragment，CYFRA 21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件及MedCalc 15.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用K-S檢驗進行正態(tài)性分布檢驗。呈非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗。采用逐步法二元Logistic回歸分析進行相關(guān)性分析并篩選優(yōu)化診斷指標(biāo)，根據(jù)Logistic回歸分析結(jié)果，以訓(xùn)練樣本建立診斷模型；以模型Y為新變量，采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估診斷模型鑒別診斷肺炎與肺癌的效能，以驗證樣本加以驗證。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺炎組、肺癌組及正常對照組之間血清膽汁酸譜的比較

與正常對照組比較，肺炎組血清游離膽汁酸DCA、LCA、UDCA水平及結(jié)合膽汁酸GDCA、GLCA、TDCA、TLCA水平降低（P＜0.01），血清結(jié)合膽汁酸GCDCA、TCDCA水平升高（P＜0.01）；肺癌組血清游離膽汁酸CA、CDCA水平及結(jié)合膽汁酸GCDCA、TCDCA水平升高（P＜0.01），血清結(jié)合膽汁酸TDCA、TLCA水平降低（P＜0.01）。血清TBA水平3組之間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。肺癌組血清游離膽汁酸CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA及結(jié)合膽汁酸GDCA、GLCA高于肺炎組（P＜0.01）。見表1、表2。

2.2 不同類型及不同分期肺癌患者血清膽汁酸譜的比較

早中期肺癌組與晚期肺癌組之間、肺鱗癌組和肺腺癌組之間血清TBA及5種游離膽汁酸、10種結(jié)合膽汁酸差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3～表6。

2.3 肺炎組與肺癌組血清腫瘤標(biāo)志物的比較

肺癌組血清CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于肺炎組（P＜0.01、P＜0.05），2個組之間血清CA125、CA19-9水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表7。

2.4 膽汁酸譜及腫瘤標(biāo)志物鑒別診斷肺炎與肺癌的價值

采用ROC曲線分析肺炎組與肺癌組之間有差異的7種膽汁酸和2種腫瘤標(biāo)志物。結(jié)果顯示，DCA、UDCA、CEA鑒別診斷肺炎與肺癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.781、0.707、0.704，敏感性分別為73.2%、86.1%和62.0%，特異性分別為77.5%、50.0%和72.5%。其他指標(biāo)的AUC均＜0.7。見表8。

表1 肺炎組、肺癌組及正常對照組之間血清TBA及5種游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表2 肺炎組、肺癌組及正常對照組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表3 早中期肺癌組及晚期肺癌組之間血清TBA及游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表4 早中期肺癌組及晚期肺癌組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表5 肺鱗癌組及肺腺癌組之間血清TBA及游離膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表6 肺鱗癌組及肺腺癌組之間血清結(jié)合膽汁酸水平的比較 M（P25～P75）

表7 肺炎組與肺癌組血清5種腫瘤標(biāo)志物水平的比較 M（P25～P75）

表8 7種膽汁酸和2種腫瘤標(biāo)志物鑒別診斷肺炎與肺癌的價值

2.5 肺炎與肺癌鑒別診斷模型的建立

2.5.1 診斷模型建立 隨機抽取樣本量的70%組成訓(xùn)練樣本，其中肺炎患者56例、肺癌患者76例。將2個組之間有差異的9項指標(biāo)（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA、GDCA、GLCA、CEA、CYFRA21-1）納入逐步法二元Logistic回歸分析。結(jié)果顯示，DCA、CDCA、CYFRA-211是鑒別診斷肺炎和肺癌的主要影響因素，見表9。據(jù)此建立診斷模型Y=1/（1+e-LogitP），式中LogitP=0.007×DCA+0.001×CDCA+0.176×CYFRA21-1-2.293，模型系數(shù)綜合檢驗和Hosmer-Lemeshow檢驗結(jié)果顯示，模型擬合度良好（χ2=62.10，P＜0.05；χ2=5.58，P＞0.05）。

2.5.2 診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的效能分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的AUC（95%CI）為0.873（0.804～0.925），最佳臨界值為0.52，敏感性CT）也存在過度診斷、輻射量大等不足[12]。因此，血清學(xué)標(biāo)志物對肺癌和肺炎的輔助鑒別診斷至關(guān)重要。現(xiàn)階段肺癌的血清學(xué)篩查和診斷主要依靠CEA、NSE等腫瘤標(biāo)志物，這些腫瘤標(biāo)志物在區(qū)分肺癌患者與健康人時具有較高的敏感性和特異性[11]，但由于大部分腫瘤標(biāo)志物在肺部炎癥時也會有不同程度地升高，因此在對肺癌和肺炎進行鑒別診斷時往往不能達到令人滿意的效果[13]。

表9 訓(xùn)練樣本9項指標(biāo)逐步法二元logistic回歸分析結(jié)果

膽汁酸是膽汁的重要成分，各類游離膽汁酸是FXR、TGR5等膽汁酸受體的主要配體[14]，游離膽汁酸的改變會進一步導(dǎo)致結(jié)合膽汁酸的改變。本研究結(jié)果顯示，與正常對照組比較，肺癌患者血清膽汁酸譜以初級游離膽汁酸CA、CDCA升高為主要特征，與LIU等[8]的研究結(jié)果基本一致。對膽汁酸受體的最新研究結(jié)果表明，肺癌患者血清游離膽汁酸水平與癌組織中膽汁酸受體的表達呈明顯正相關(guān)，一些游離膽汁酸可活化肺癌細(xì)胞中的膽汁酸受體，使其表達升高，而在高于正常水平的情況下，膽汁酸受體能進一步促進腫瘤的增殖[8]，如FXR能通過激活細(xì)胞周期蛋白-D1促進肺部腫瘤的增殖[9]，TGR5能通過激活兩面神激酶2（janus kinase 2，JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）信號通路刺激肺部腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。因此，高水平的游離膽汁酸可能是推動肺癌進展的原因之一。此外，本研究結(jié)果顯示，肺炎患者血清膽汁酸譜以次級游離膽汁酸DCA、LCA、UDCA降低為主要特征。在動物模型中，膽汁酸受體激動劑已被證實是治療肺部炎癥性纖維化的可能手段[15]，膽汁酸受體TGR5可為89.3%，特異性為75.4%，符合率為82.4%。見圖1。

2.5.3 診斷模型Y的驗證 將剩余樣本（肺炎24例、肺癌32例）作為驗證樣本，代入診斷模型Y進行驗證。共檢出18例肺炎患者和25例肺癌患者，總符合率為76.8%，與ROC曲線分析結(jié)果基本符合。

圖1 診斷模型Y鑒別診斷肺炎與肺癌的ROC曲線

3 討論

目前，臨床病理分期，即TNM分期仍是預(yù)測肺癌患者生存時間最主要的指標(biāo)[1]，而高誤診率是肺癌確診時分期晚、預(yù)后差的主要原因之一。有研究結(jié)果顯示，在我國部分地區(qū)，40歲以下人群中肺癌的誤診率可達50%以上，且主要誤診為肺炎[10]。這是由于肺癌的早期癥狀多為咳嗽、呼吸困難、發(fā)熱等，與肺炎極為相似。胸部X線檢查由于缺乏特異性，常被阻塞性肺炎和肺不張等掩蓋了肺部腫瘤病變的特征[11]。電子計算機斷層掃描（computed tomography，通過抑制核因子-κB（nuclear factor-kappa B，NF-κB）信號通路的激活來達到抑制肺部炎癥的效果[6]，同時FXR還可通過抑制脂多糖促進的肺部某些促炎細(xì)胞因子的分泌，達到抑制炎癥的作用，但此過程中會大量消耗膽汁酸受體[7，16]，這可能是一些游離膽汁酸水平降低的原因。

本研究對肺癌組和肺炎組的膽汁酸譜進行了比較，同時還納入了5種臨床常用的腫瘤標(biāo)志物，對膽汁酸譜和常用腫瘤標(biāo)志物的診斷效能進行綜合評價。結(jié)果顯示，肺癌組與肺炎組之間有5種游離膽汁酸（CA、CDCA、DCA、LCA、UDCA）、2種結(jié)合膽汁酸（GDCA、GLCA）及2種腫瘤標(biāo)志物（CEA、CYFRA21-1）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），單個指標(biāo)中鑒別診斷效能最好的是DCA，AUC為0.781，敏感性為73.2%，特異性為77.5%。將上述9項指標(biāo)納入逐步法二元Logistic回歸分析，聯(lián)合診斷的最優(yōu)組合是CDCA、DCA、CYFRA21-1，其中CDCA是FXR最有效的內(nèi)源性配體[17]；在所有穩(wěn)定參與腸肝循環(huán)的膽汁酸中，DCA是TGR5最強的天然激動劑[18]；CYFRA21-1是對非小細(xì)胞肺癌最敏感的腫瘤標(biāo)志物。3項指標(biāo)組成的診斷模型鑒別診斷肺炎與肺癌的敏感性為89.3%，特異性為75.4%，AUC為0.873，診斷效能明顯優(yōu)于單項指標(biāo)。

本研究結(jié)果顯示，肺炎組、肺癌組與正常對照組之間血清TBA水平差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。這可能是由于膽汁酸的合成、轉(zhuǎn)運和代謝過程復(fù)雜，受多種因素調(diào)節(jié)，在不同疾病狀態(tài)下膽汁酸的組分呈現(xiàn)不同的改變，而總量卻保持不變所致。肺鱗癌組與肺腺癌組之間、早中期肺癌組與晚期肺癌組之間血清膽汁酸譜差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。因此，血清膽汁酸譜無法區(qū)分肺癌的分期和類型。

由于本研究未對小細(xì)胞肺癌與其他良性肺部疾病，如肺結(jié)核等的膽汁酸譜進行分析，也尚未納入鱗狀上皮細(xì)胞癌抗原、胃泌素釋放肽前體等與肺部腫瘤相關(guān)的標(biāo)志物，因此后續(xù)研究將進一步擴展驗證，繼續(xù)揭示膽汁酸譜在肺癌和其他肺部疾病中的作用和意義。

綜上所述，血清膽汁酸譜的變化與肺部疾病的有一定關(guān)系，膽汁酸譜有成為肺癌診斷標(biāo)志物的潛能。但目前關(guān)于肺癌血清膽汁酸譜的研究很少，因此本研究的結(jié)論和診斷模型還需大樣本、多中心研究加以驗證。