布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯玉米秸稈品質(zhì)影響研究

劉 輝，李金鑫，鹿 瑤，徐海燕，谷 巍

（山東寶來利來生物工程股份有限公司 山東省動(dòng)物微生態(tài)制劑省級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 泰安 271000）

目前我國草食家畜粗飼料的主要來源是青貯， 近年玉米秸稈作為反芻動(dòng)物粗飼料成為研究熱點(diǎn)，但玉米秸稈中粗纖維含量高，體積大，質(zhì)地粗硬，可直接利用率低，適口性差，飼喂前需進(jìn)行前處理，降低粗纖維含量，提高消化率，改善適口性。青貯是玉米秸稈處理的較常見方法之一。然而作為青貯的秸稈原料中含有較高的纖維素， 且纖維素不能被乳酸菌直接利用或被反芻動(dòng)物充分消化， 造成粗飼料可利用營養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物消化率提升空間較小，降低了青貯秸稈的利用率。

大量研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌和纖維素酶的使用，可以較好地改善青貯秸稈飼料品質(zhì)，提高營養(yǎng)價(jià)值。Sheperd 等［1］研究發(fā)現(xiàn)在紫花苜蓿青貯制作時(shí)添加纖維素酶和乳酸菌， 可降低酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量，碳水化合物含量持續(xù)增加，促進(jìn)乳酸發(fā)酵并提升了青貯發(fā)酵品質(zhì)。 Cai 等［2］研究結(jié)果表明在羊草和苜蓿青貯中同時(shí)添加乳酸菌和纖維素酶，可促進(jìn)發(fā)酵，提升發(fā)酵品質(zhì)，抑制腐敗菌產(chǎn)氣，并提高干物質(zhì)消化率。 席興軍等［3］在青貯玉米秸稈中添加纖維素酶和乳酸菌， 青貯中氨態(tài)氮下降28%， 丁酸下降100%， 酸性洗滌纖維降低20%，顯著提升了青貯玉米秸稈的營養(yǎng)價(jià)值。 趙政等［4］對(duì)早秈稻秸稈青貯添加乳酸菌和纖維素酶，發(fā)現(xiàn)酸性洗滌纖維和中性洗滌纖維含量降低，而粗蛋白含量增加。 萬里強(qiáng)等［5］使用乳酸菌和纖維素酶青貯苜蓿，結(jié)果表明氨態(tài)氮明顯下降，乳酸含量增加，青貯效果綜合評(píng)分高達(dá)93 分。

在青貯制作或取飼時(shí)，由于密封不嚴(yán)，青貯飼料與氧氣接觸，霉菌和酵母菌等腐敗菌繁殖，造成青貯有氧腐敗，營養(yǎng)成分大量流失或毒素積累，造成青貯飼料浪費(fèi)，甚至引起動(dòng)物中毒，降低生產(chǎn)性能， 因此， 提高青貯飼料有氧穩(wěn)定性尤為重要。Weinberg 等［6］發(fā)現(xiàn)布氏乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)生具有抑菌作用的乙酸， 可有效抑制青貯開窖后酵母菌、真菌、 絲狀菌等腐敗菌的活動(dòng)， 提高青貯有氧穩(wěn)定性。 Danner 等［7］對(duì)影響青貯有氧穩(wěn)定性的多種化學(xué)物質(zhì)評(píng)價(jià)結(jié)果表明， 青貯發(fā)酵產(chǎn)物中僅乙酸可穩(wěn)定提高青貯玉米的有氧穩(wěn)定性，丁酸效果次之，而乳酸、1-丙醇和1，2-丙二醇對(duì)有氧穩(wěn)定性無影響。 Danner 等［7］和Kung 等［8］研究發(fā)現(xiàn)，布氏乳桿菌添加量低于5×105CFU/g 時(shí)，有氧穩(wěn)定性無顯著提高；當(dāng)添加劑量高于5×105CFU/g 時(shí)，隨著添加劑量的增加， 對(duì)玉米青貯品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的提高效果優(yōu)于小顆粒谷物飼料和禾本科牧草。Rabjit等［9］證明接種劑量為106CFU/g 布氏乳桿菌組青貯飼料有氧穩(wěn)定性明顯優(yōu)于丙酸和苯甲酸添加組，但當(dāng)接種量為105CFU/g 時(shí)，效果較丙酸和苯甲酸鹽組差。

目前， 國內(nèi)外對(duì)青貯添加劑提升青貯粗飼料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性比較關(guān)注， 學(xué)者們對(duì)同型發(fā)酵乳酸菌、 異型發(fā)酵乳酸菌及同型發(fā)酵乳酸菌和纖維素酶聯(lián)合使用對(duì)青貯有氧穩(wěn)定性和發(fā)酵品質(zhì)的影響研究較多，但對(duì)布氏乳桿菌（異型發(fā)酵乳酸菌）和纖維素酶聯(lián)合使用效果評(píng)價(jià)研究較少，該試驗(yàn)?zāi)康氖茄芯坎际先闂U菌和纖維素酶對(duì)玉米秸稈青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)及有氧穩(wěn)定性的影響， 為布氏乳桿菌和纖維素酶復(fù)合制劑在玉米秸稈青貯粗飼料中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

布氏乳桿菌菌粉由山東寶來利來生物工程股份有限公司提供， 粉狀活菌制劑， 活菌數(shù)為5.0×1010CFU/g。

纖維素酶為泰安信得利生物工程有限公司生產(chǎn)粉狀酶制劑，酶活為100 000 U/g。

青貯原料：山東省濱州市濱城區(qū)西薛家村種植玉米（品種為登海678），玉米籽粒在2/3 乳線期收割，取玉米秸稈，切至2～3 cm 段，作為青貯料制作原料，原料營養(yǎng)成分及微生物情況見表1 和表2。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)置空白對(duì)照組（CK 組，添加等量無菌水）、布氏乳桿菌接種組（LB 組，接種量為1.0×106CFU/g FM）、纖維素酶添加組（ENZ 組，添加量100 U/g FM）、復(fù)合添加組（LB+ENZ 組，布氏乳桿菌接種量為1.0×106CFU/g FM，纖維素酶添加量100 U/g FM）。

1.3 青貯制作

將刈割揉搓好的青貯料制作原料按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，稱重分裝，試驗(yàn)共計(jì)4 組，每組3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)4 kg/袋。 接種方法是將每組所需菌粉和纖維素酶溶解至100 mL 無菌水中，邊用噴壺均勻噴灑邊翻動(dòng)青貯料，接種混合完畢后裝袋，用氣泵抽除袋內(nèi)空氣，拉伸纏繞膜多層包裹，堆放在避光陰涼處進(jìn)行發(fā)酵。

1.4 測定項(xiàng)目及方法

1.4.1 干物質(zhì)含量 取100 g 青貯樣， 置于65 ℃烘箱中48 h，至恒重，冷卻稱重，采用如下公式計(jì)算干物質(zhì)含量［10］。

1.4.2 pH 值測定 根據(jù)青貯飼料質(zhì)量評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)制備青貯飼料樣品制備提取液， 用精密酸度計(jì)測pH 值［11］。

1.4.3 發(fā)酵產(chǎn)物測定 粗蛋白（CP）含量用凱氏定氮法進(jìn)行測定［12］。 水溶性碳水化合物（WSC）含量采用蒽酮比色法測定。 粗脂肪含量采用索氏提取法測定。 氨態(tài)氮（NH3-N）、粗纖維（CF）、中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量利用范氏法測定［13］。 青貯飼料中有機(jī)酸提?。?4］：取5 g 待測樣品于離心管中， 加入30 mL 超純水， 并加入H2SO4酸化使pH 值＜2，蓋緊蓋子，于4 ℃條件下浸提24 h，離心取上清液，用液相色譜法測定乳酸、乙酸含量［12］。 取10 g 青貯樣品加入含有90 mL 滅菌生理鹽水的有塞三角瓶，置于220 r/min、30 ℃搖床30 min，利用梯度稀釋法測定乳酸菌、酵母菌活菌數(shù)。

1.4.4 有氧穩(wěn)定性測定 青貯玉米秸稈發(fā)酵至45 d 時(shí)，每個(gè)重復(fù)組隨機(jī)取出500g 樣品置于20 cm×30 cm 封口聚乙烯塑料袋內(nèi)，用無菌牙簽扎數(shù)個(gè)小孔，再套上寬松不封口聚乙烯袋，防止水分損失和交叉污染，置于陰暗處，環(huán)境溫度控制在25 ℃，將溫度記錄儀插入青貯樣品中心，每小時(shí)記錄1 次，青貯樣品溫度超過室溫2 ℃為止， 即為青貯有氧穩(wěn)定性時(shí)間［15］。

1.4.5 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)先用Excel 軟件進(jìn)行初步處理，然后采用SPSS 19.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)青貯玉米秸稈的感官指標(biāo)及pH值影響

不同處理組45 d 青貯玉米秸稈感官綜合評(píng)價(jià)結(jié)果如表3 所示，LB 組、ENZ 組、LB+ENZ 組青貯玉米秸稈的感官綜合評(píng)分分別比對(duì)照組高20.31%、14.06%和25.00%；LB 組和LB+ENZ 組pH 值較CK 組和ENZ 組高，CK 組和ENZ 組基本無差異。

2.2 發(fā)酵45 d 時(shí)青貯玉米秸稈中微生物含量

發(fā)酵45 d 后取樣測定各處理組乳酸菌、酵母菌及細(xì)菌總數(shù)，測定結(jié)果見表4。 45 d 時(shí)，除LB 組乳酸菌總數(shù)略低于初始值， 其他各試驗(yàn)組的乳酸菌含量均高于初始值外，CK 組、ENZ 組、LB+ENZ組乳酸菌數(shù)均增加1 個(gè)數(shù)量級(jí)； 各組酵母菌數(shù)量均較初始值低，LB 組和LB+ENZ 組降幅最大，分別降至2.23×103、7.10×102CFU/g FM；CK 組、LB 組和ENZ 組細(xì)菌總數(shù)略有上升， 變化不明顯，但LB+ENZ 組細(xì)菌總數(shù)增至3.50×107CFU/g FM。

表1 玉米秸稈各營養(yǎng)成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)

表2 微生物數(shù)量和pH 值檢測結(jié)果 單位：CFU/g

表3 不同組45 d 青貯玉米秸稈pH 值及感官指標(biāo)綜合評(píng)分

2.3 布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯玉米秸稈有機(jī)酸和氨態(tài)氮的影響

不同處理組青貯玉米秸稈發(fā)酵45 d 時(shí)有機(jī)酸和氨態(tài)氮（NH3-N）含量測定結(jié)果如表5 所示。LB+ENZ 組乳酸含量為2.88%，顯著（P<0.05）低于CK 組、LB 組和ENZ 組，LB 組低于ENZ 組， 且差異顯著（P<0.05），但CK 組、LB 組和ENZ 組差異不顯著（P>0.05）。 LB+ENZ 組乙酸含量達(dá)4.48%，顯著 （P<0.05） 高于其他3 個(gè)處理組，LB 組顯著（P<0.05）高于CK 組和ENZ 組，但CK 組和ENZ組無顯著差異（P>0.05）。 CK 組乳酸/乙酸值最高（3.43），LB+ENZ 組乳酸/乙酸值最低（0.65），除CK組與ENZ 組差異不顯著（P>0.05）外，其他處理組間差異均顯著（P<0.05）。 CK 組、ENZ 組丙酸含量分別為0.55%、0.32%，LB 組和LB+ENZ 組均未檢出丙酸。 4 個(gè)處理組均未檢測出丁酸。 CK 組氨態(tài)氮含量最高（4.16 g/kg DM），且與其他3 個(gè)處理組差異顯著（P<0.05），但其他3 組無顯著差異（P>0.05）。

2.4 布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯玉米秸稈營養(yǎng)成分的影響

各處理組青貯玉米秸稈的營養(yǎng)成分如表6 所示。與CK 組相比，LB 組、ENZ 組、LB+ENZ 組青貯玉米秸稈45 d 時(shí)的干物質(zhì)（DM）、粗脂肪（EE）含量均無顯著差異（P>0.05），LB 組干物質(zhì)（DM）含量最低（25.58%）， 較CK 組降低了4.23%，LB+ENZ組粗脂肪（EE）含量最低（1.56%），較CK 組降低了7.14%，且各處理組的干物質(zhì)（DM）、粗脂肪（EE）含量均低于CK 組， 且以LB+ENZ 組降低幅度最大。 LB 組粗蛋白（CP）含量低于CK 組（P>0.05），LB 組和CK 組均顯著 （P<0.05） 低于ENZ 組和LB+ENZ 組，ENZ 組和LB+ENZ 組差異不顯著（P>0.05）。 LB 組中性洗滌纖維（NDF）含量為70.12%，顯著 （P<0.05） 高于其他3 個(gè)處理組，ENZ 組和LB+ENZ 組含量低于CK 組，但均無顯著差異（P>0.05）。 LB+ENZ 組酸性洗滌纖維（ADF）含量最低，顯著（P<0.05）低于CK 組和LB 組，與ENZ 組差異不顯著（P>0.05）。 與CK 組相比，LB 組、ENZ 組和LB+ENZ 組水溶性碳水化合物（WSC）含量均顯著（P<0.05） 增加， 其中LB+ENZ 組含量最高，達(dá)6.72%。

表4 發(fā)酵45 d 青貯飼料中的微生物數(shù)量 單位：CFU/g FM

表5 發(fā)酵45 d 青貯玉米秸稈發(fā)酵產(chǎn)物

表6 布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯玉米秸稈營養(yǎng)成分的影響 單位：%

圖1 不同處理組青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性

2.5 布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性的影響

布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)發(fā)酵青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性的影響評(píng)價(jià)結(jié)果如圖1 所示，CK 組、LB 組、ENZ 組、LB+ENZ 組青貯玉米秸稈的有氧穩(wěn) 定 性 時(shí) 長 分 別 為89、312、167、367 h，LB+ENZ組、LB 組、ENZ 組青貯玉米秸稈有氧穩(wěn)定性時(shí)間較CK 組分別提高了312.36%、250.56%、87.64%，且各組間差異均顯著（P<0.05）。

3 討論

我國畜牧業(yè)發(fā)展勢頭迅猛， 發(fā)展過程中存在諸多問題，其中之一是草食家畜粗飼料短缺。我國玉米秸稈資源豐富，易于制作青貯，是家畜較好的飼料來源。為了保存青貯玉米秸稈飼料營養(yǎng)，改善適口性，提高開窖取飼后的有氧穩(wěn)定性，青貯添加劑必不可少。 隨著對(duì)青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性的不斷深入研究， 布氏乳桿菌和纖維素酶對(duì)青貯發(fā)酵效果和有氧穩(wěn)定性的效果評(píng)估成為青貯添加劑研究的熱點(diǎn)之一。 趙政等［16］研究發(fā)現(xiàn)在青貯玉米秸稈中添加0.3%纖維素酶， 可將腐敗率控制在1.4%以下，減少氨態(tài)氮含量，降低中性洗滌纖維（NDF）、酸 性 洗 滌 纖 維（ADF）和 酸 性 木 質(zhì) 素（ADL）含量。 興麗等［17］研究表明，纖維素酶處理組中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維含量分別下降5.28%和6.09%， 乳酸菌+纖維素酶處理組酸性洗滌纖維含量下降4.49%， 酸性木質(zhì)素含量下降8.51%。 Kleinschmit 等［18］研究發(fā)現(xiàn)，空白對(duì)照組青貯玉米有氧暴露后25 h 開始發(fā)霉變質(zhì)， 而添加105CFU/g 以上布氏乳桿菌組青貯玉米到503 h 才發(fā)霉變質(zhì)， 可見布氏乳桿菌可明顯提升青貯玉米的有氧穩(wěn)定性。美國奶牛和牧草中心研究發(fā)現(xiàn)，添加布氏乳桿菌組玉米青貯飼料有氧穩(wěn)定性比對(duì)照組提高100～811 h，可見布氏乳桿菌對(duì)青貯飼料有氧穩(wěn)定性有較大影響［19］。 呂文龍等［15］研究發(fā)現(xiàn)布氏乳桿菌可提高青貯玉米秸稈pH 值和乙酸含量，降低乳酸含量及乳酸/乙酸值，提高青貯玉米秸稈的有氧穩(wěn)定性。

對(duì)不同處理組青貯玉米秸稈發(fā)酵45 d 后進(jìn)行感官評(píng)價(jià)、有機(jī)酸含量、微生物含量、水溶性碳水化合物（WSC）含量、營養(yǎng)指標(biāo)及有氧穩(wěn)定性等檢測， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加布氏乳桿菌和纖維素酶可提高青貯玉米秸稈感官評(píng)分， 這與其他學(xué)者報(bào)道結(jié)果相似［20-22］。 青貯過程是復(fù)雜的微生物代謝變化過程，根據(jù)青貯基本原理，在青貯原料中添加布氏乳桿菌使其成為優(yōu)勢菌群， 在厭氧條件下分解游離碳水化合物為有機(jī)酸， 纖維素酶通過酶解玉米秸稈中的纖維素， 促進(jìn)中性洗滌纖維和酸性洗滌纖維降解， 提高青貯玉米秸稈中的游離碳水化合物含量，為乳酸菌酵解提供更多的糖類。同型發(fā)酵乳酸菌則是通過將水溶性糖主要分解為乳酸，提高乳酸生成量及乳酸/乙酸值， 使青貯飼料的pH值迅速下降；而布氏乳桿菌屬于異型發(fā)酵乳酸菌，能將水溶性糖和乳酸分解產(chǎn)生乙酸、二氧化碳等，降低乳酸含量，產(chǎn)生更多的乙酸，快速降低乳酸/乙酸值，LB 組和LB+ENZ 組均添加了布氏乳桿菌，使布氏乳桿菌快速成為優(yōu)勢菌群，將青貯秸稈中自然附帶菌所產(chǎn)乳酸分解轉(zhuǎn)化為乙酸，使LB 組和LB+ENZ 組的pH 值較其他組略高（乳酸pKa=4.14，乙酸pKa=4.75，22.5 ℃）。 而高含量的乙酸可更好地抑制酵母菌及有害微生物的繁殖代謝，但是對(duì)于耐酸性能較好的布氏乳桿菌影響不大，可快速成為青貯中的優(yōu)勢菌群， 通過代謝進(jìn)一步積累青貯中的有機(jī)酸，可在短期內(nèi)使青貯的pH 值下降至4.2 以下， 縮短青貯從儲(chǔ)存到進(jìn)入穩(wěn)定發(fā)酵期的時(shí)間， 減少了發(fā)酵期間有害微生物繁殖代謝對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)的消耗及不良代謝產(chǎn)物的積累（丙酸、丁酸、氨氣、霉菌毒素等），最大程度保存玉米秸稈中的各營養(yǎng)成分，提高青貯玉米秸稈的感官品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。

4 結(jié)論

該研究表明， 在青貯玉米秸稈中添加布氏乳桿菌和纖維素酶可明顯降低中性洗滌纖維（NDF）和酸性洗滌纖維（ADF）含量、乳酸/乙酸值、氨態(tài)氮（NH3-N）和酵母菌活菌數(shù)，增加乙酸含量和水溶性碳水化合物，延長有氧穩(wěn)定性時(shí)間，提高青貯玉米秸稈的感官品質(zhì)、發(fā)酵品質(zhì)和有氧穩(wěn)定性。