馬早期流產(chǎn)相關(guān)功能基因挖掘的研究

吳海青，劉 威，馬躍軍，蘇少鋒，薩初拉，付紹印，高文淵，李玉榮

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草原工作站，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018）

流產(chǎn)是造成馬繁殖率降低的重要原因。 據(jù)報道，舍飼馬流產(chǎn)率約為10%，群牧馬流產(chǎn)率更高，可達(dá)30%［1］。 馬匹流產(chǎn)中早期流產(chǎn)占比最大，達(dá)到88%。 在相同飼養(yǎng)環(huán)境下，馬群中總是存在少數(shù)配種后45 d 以內(nèi)通過直腸檢查胚胎正常發(fā)育，但在2～4 個月后出現(xiàn)流產(chǎn)的現(xiàn)象， 該現(xiàn)象也造成馬匹發(fā)情觀察延誤，導(dǎo)致馬匹空懷［2］。 早期流產(chǎn)的影響因素較多，包括營養(yǎng)水平、繁殖疾病、細(xì)菌病毒感染、激素水平變化、胚胎著床等［3］。 對馬而言，營養(yǎng)水平、 繁殖疾病和細(xì)菌病毒感染等外源因素引起的流產(chǎn)，可以通過提高飼養(yǎng)管理水平、藥物治療和環(huán)境消毒等措施避免。但激素分泌、胚胎著床等內(nèi)源性因素與相關(guān)基因的表達(dá)密切聯(lián)系， 是較難解決的， 通常這部分馬匹在調(diào)整馬群結(jié)構(gòu)過程中被逐步淘汰。

胚胎著床的分子機(jī)理較為復(fù)雜。 參與胚胎著床的相關(guān)因子包括細(xì)胞黏附分子、鈣黏分子、免疫球蛋白超家族細(xì)胞因子、表皮生長因子、細(xì)胞集落刺激因子等［4］。 參與胚胎著床的信號通路有Wnt信 號 通 路［5-6］、整 合 素 信 號 通 路［4］、MAPK 信 號 通路［7］、晝 夜 節(jié) 律 信 號 通 路［8］、鈣 離 子 信 號 通 路［9］、Notch 信 號 通 路［10］等。 王 ?。?1］研 究 發(fā) 現(xiàn)E4BP4、RGS2、ISP2、MNSFβ、EMO-1、EMO-2 等基因與小鼠胚胎著床顯著相關(guān)。 促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH） 除了促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟，還對胚胎著床有重要作用。研究表明，GnRH 受體 （gonadotropin-releasing hormone receptor，GnRHR）被GnRH 激活后，會提高滋養(yǎng)層細(xì)胞分泌絨毛膜促性腺激素的水平， 從而促進(jìn)胚胎著床；GnRH 也可以顯著提高雌激素的分泌水平，同時提升黃體分泌孕酮的水平，從而促進(jìn)胚胎發(fā)育［12］。

早期流產(chǎn)是制約馬產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。 目前關(guān)于馬匹早期流產(chǎn)或胚胎著床的相關(guān)基因鮮有報道。 該研究通過對發(fā)生早期流產(chǎn)的母馬和正常分娩的母馬進(jìn)行基因組測序分析， 以期挖掘與早期流產(chǎn)或胚胎著床相關(guān)的SNP 及功能基因， 為揭示引起馬匹早期流產(chǎn)的原因提供生物信息學(xué)方面的參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)用馬選擇與分組

2018 年6 月，在內(nèi)蒙古可汗御馬苑有限公司進(jìn)口馬純繁群中選擇配種后45 d 能夠檢查到胚胎， 但2～4 個月后發(fā)生流產(chǎn)的母馬10 匹 （流產(chǎn)組），以及能正常分娩的母馬10 匹（分娩組）。兩組馬匹的飼養(yǎng)管理?xiàng)l件一致。 所有母馬年齡5～14歲，均為參配母馬，無繁殖疾病，品種為走馬和純血馬。 試驗(yàn)用馬的基本信息見表1。

1.2 全基因組提取及測序

1.3 全基因組重測序數(shù)據(jù)處理

利用FastaQC（version 0.10.1）對數(shù)據(jù)質(zhì)量進(jìn)行評估，質(zhì)控過濾后的測序reads 通過BWA 軟件比對到馬參考基因組（ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-91/fasta/equus_caballus/dna/Equus_caballus.EquCab2.dna_sm.toplevel.fa.gz）， 應(yīng)用SAMtools 軟件對比對結(jié)果進(jìn)行排序； 然后用Picard 標(biāo)記重復(fù)序列，使用GATK 和SAMtools 軟件，分別將比對后得到的bam 文件在含有插入或缺失突變的區(qū)間進(jìn)行區(qū)域內(nèi)重新比對， 最后獲得所有試驗(yàn)個體的單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)（SNP）和短插入缺失（INDEL）數(shù)據(jù)集。 利用var 命令分別鑒定Germline SNV 和INDEL， 利用Manta 算法鑒別Germline SV， 利用Control-Freec 算法鑒別Germline CNV。

表1 試驗(yàn)用馬的基本信息

1.4 選擇信號檢測

以不同的性狀進(jìn)行分組， 在全基因組范圍內(nèi)進(jìn)行選擇性消除分析。 在常染色體上使用100 kb大小的窗口進(jìn)行掃描， 對每個窗口計算Fst 值；同時， 以相同大小的滑動窗口對2 個群體進(jìn)行堿基多態(tài)性π 值的計算， 檢測受選擇的區(qū)域。 將通過Fst 值和π 值分析得到的區(qū)域進(jìn)行聯(lián)合分析。

1.5 選樣區(qū)域的候選基因注釋、GO 分析和通路分析

對鑒別出的被選擇區(qū)域進(jìn)行注釋， 找出區(qū)域內(nèi)的基因。進(jìn)一步對基因進(jìn)行功能注釋，得到基因?qū)?yīng)的GO term 及信號通路富集。

2 結(jié)果與分析

2.1 全基因組重測序

試驗(yàn)用馬經(jīng)基因組重測序共獲得501 Gb 的有效數(shù)據(jù)， 以及3.64×109個reads，96%以上的reads 100%對應(yīng)到參考基因組上；每匹馬基因組的平均序列覆蓋率為97%，GC 含量平均占比47.2%；單核苷酸多態(tài)性（SNPs）為每匹馬4.2×106個（見表2）。

2.2 選擇性消除與候選基因篩選

通過流產(chǎn)組和分娩組SNP 比對Fst 分析，共有1 381 個SNP 位點(diǎn)（見圖1）。 π 分析共有1 614個SNP 位點(diǎn)（見圖2）。 聯(lián)合分析得到203 個SNP位點(diǎn)，過濾掉突變基因間區(qū)域、非編碼區(qū)域、內(nèi)含子和同義SNV 后得到82 個SNP 位點(diǎn)，定位于69個基因上（見圖3）。 通過GO term、信號通路富集分析及參閱文獻(xiàn)，篩選出其中的12 個基因?yàn)轳R早期流產(chǎn)和胚胎著床的重要候選基因，包括TGIF1、RORB、RICTOR、Pts、MAML3、LHCGR、GNRH1、Erc1、EIPR1、DHRS4、PRKACB 和BCO1（見表3）。

3 討論

馬匹早期流產(chǎn)多數(shù)是由于胚胎不能著床或發(fā)育停滯引起的。 著床是胎生哺乳動物的胚泡和母體子宮壁結(jié)合， 從而建立母子間結(jié)構(gòu)上的聯(lián)系以實(shí)現(xiàn)物質(zhì)交換的過程。著床的條件包括：透明帶消失；胚泡細(xì)胞滋養(yǎng)細(xì)胞分化出合體滋養(yǎng)細(xì)胞；胚泡和子宮內(nèi)膜同步發(fā)育且功能協(xié)調(diào)； 有足夠水平的孕酮，子宮有一個極短的敏感期允許受精卵著床。這些過程需要激素的精準(zhǔn)調(diào)控， 以及相應(yīng)信號通路的調(diào)節(jié)， 以保證胚泡和子宮內(nèi)膜同步發(fā)育以及胎兒著床繼續(xù)發(fā)育。

表2 試驗(yàn)用馬基因組重測序數(shù)據(jù)

圖1 流產(chǎn)組和分娩組比對Fst 分析

圖2 流產(chǎn)組和分娩組比對π 分析

GnRH 是由下丘腦分泌的一種生殖激素，是由10 個氨基酸組成的肽段。 GnRH 在哺乳動物中有3 個亞型：GnRH1、GnRH2 和GnRH3。 GnRH1的主要作用是刺激絨毛膜促性腺激素的釋放。GnRH 通過結(jié)合腦垂體上的GnRHR，促進(jìn)黃體生成素和卵泡刺激素的分泌， 隨后刺激性腺分泌相關(guān)的甾類激素。GnRHR 是有7 個跨膜域的G 蛋白偶聯(lián)受體。 越來越多的研究證實(shí)，GnRHR 不僅在腦垂體表達(dá)，在雌性生殖器官中也有表達(dá)，如子宮肌層、子宮內(nèi)膜、卵巢、胎盤、乳腺等［13］。 李穎等［12］報道，GnRH/GnRHR 系統(tǒng)參與胚胎著床和早期發(fā)育，具有調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜、胎盤、卵巢功能以及支持黃體等作用。 子宮中雌激素和孕激素受體的表達(dá)受到晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)。 孕酮與子宮內(nèi)膜孕激素受體作用促使內(nèi)膜細(xì)胞分化至分泌期， 利于胚胎的著床。 RORB 基因是RORs 基因家族的成員，該家族的轉(zhuǎn)錄具有節(jié)律性，可以控制晝夜節(jié)律基因Bmal的表達(dá)， 小鼠缺失RORB 基因?qū)е律镧姽?jié)律異常。 晝夜節(jié)律相關(guān)基因直接或間接影響GnRH 的陣發(fā)性分泌， 從而調(diào)節(jié)下丘腦—垂體—卵巢軸的內(nèi)分泌功能［14］。 由此可知，RORB 基因突變會影響內(nèi)分泌軸功能，在胚胎著床調(diào)節(jié)中具有重要作用。因此， 該研究中篩選出的RORB 和GNRH1 基因可能是胚胎著床的重要候選基因。

圖3 流產(chǎn)組和分娩組比對Fst 和π 聯(lián)合分析

表3 馬早期流產(chǎn)候選基因

胚胎著床需要通過多條信號通路促進(jìn)胚胎發(fā)育以及改善子宮內(nèi)膜容受性來實(shí)現(xiàn)。 哺乳動物的雷帕霉素靶蛋白 （mammalian target of rapamycin，mTOR） 是一種進(jìn)化上非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶， 屬于磷脂酰肌醇激酶相關(guān)激酶（phosphatidylinositol kinase-related kinases，PIKKs）家族成員。 mTOR 結(jié)構(gòu)復(fù)雜，有2 種形式的復(fù)合物，即mTORC1 和mTORC2。 mTORC1 含有底物募集的特異性正向調(diào)節(jié)因子raptor，mTORC2 含有特異性亞基rictor［15］。 文乙先等［16］研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜條件性敲除rictor 后，由于容受性降低導(dǎo)致胚胎的植入率明顯下降。有研究表明，小鼠植入期子宮內(nèi)膜組織的mTOR 呈現(xiàn)高表達(dá)，且具有時空特異性，孕鼠圍植入期注射mTOR 抑制劑可導(dǎo)致胚胎丟失。研究人員對懷孕母豬子宮內(nèi)膜mTOR 的下游效應(yīng)物表達(dá)的測定結(jié)果顯示，真核起始因子4E 蛋白表達(dá)水平在胚胎植入期（PD13）升高，在胎盤形成期（PD24） 子宮內(nèi)膜與胎盤接觸部位表達(dá)水平降低。多項(xiàng)動物研究結(jié)果提示，mTOR 信號通路在胚胎植入期的子宮組織表達(dá)水平升高， 并對維持成功植入以及胚胎早期發(fā)育至關(guān)重要［17］。

轉(zhuǎn)化生長因子-β （transforming growth factorβ，TGF-β）是一類在結(jié)構(gòu)上相對保守的生長因子，是細(xì)胞增殖、分化，細(xì)胞外基質(zhì)合成和細(xì)胞凋亡的主要調(diào)節(jié)因子之一，參與胚胎著床過程。TGF-β 信號通路參與子宮內(nèi)膜容受性的形成和黏附反應(yīng)，有助于滋養(yǎng)層侵入［18］。裴琛琳等［19］研究表明TGFβ 與轉(zhuǎn)化生長影響因子 （transforming growth interacting factor，TGIF）的異常表達(dá)可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。 MAML3 參與Notch 信號通路，通過細(xì)胞與細(xì)胞的接觸而激活， 可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)多種生命進(jìn)程，如增殖、分化、凋亡、侵襲、黏附等［20］。Notch 家族成員表達(dá)于子宮內(nèi)膜、 胚泡和胎盤中，參與著床和胎盤形成，Notch 的表達(dá)異常與胎盤形成障礙和子癇前期的發(fā)生有關(guān)［21］。 趙明智等［10］研究發(fā)現(xiàn)， 原因不明的復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)患者的Notch1 信號通路和Foxp3 表達(dá)下調(diào)可能阻礙CD4+T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為CD4+CD25+T 細(xì)胞，進(jìn)而誘發(fā)免疫排斥， 誘導(dǎo)流產(chǎn)。 蛋白激酶A 催化亞單位β（PRKACB） 參與多條信號通路， 包括Wnt、Ras、MAPK、Hedgehog、鈣離子、cAMP、間隙鏈接、緊密連接、卵巢甾類激素形成、胰島素、催產(chǎn)素、GnRH、甲狀腺素、雌激素等，極有可能與胚胎著床密切相關(guān)。Wnt 信號通路參與子宮接受態(tài)建立、囊胚激活、胚胎著床以及子宮基質(zhì)蛻膜化，對胚胎的植入起著至關(guān)重要的作用［22］。安文仲［23］研究發(fā)現(xiàn)MAPK 信號通路通過調(diào)控細(xì)胞骨架控制胚胎滋養(yǎng)層分化及囊胚成腔。 ELKS/RAB6 -interacting/CAST family member 1（Erc1）參與NF-κB 信號通路。 NF-κB 信號通路參與胚胎著床、子宮內(nèi)膜侵入［24］。翟洪波［25］研究發(fā)現(xiàn)，TLR2、TLR4/NF-κB 信號通路很可能是引發(fā)不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)的一個關(guān)鍵途徑。

黃體化激素/絨膜促性腺素受體 （lutropinchoriogonadotropic hormone receptor，LHCGR）參與催乳素信號通路、 卵巢甾類激素形成和鈣離子信號通路［26］。Bachelot［27］研究發(fā)現(xiàn)，卵巢LHCGR 表達(dá)減少、黃體形成和黃體酮分泌不足，可導(dǎo)致胚胎植入失敗。同時，催乳素受體的缺乏可以導(dǎo)致處于排卵期的雌性小鼠不孕。 妊娠相關(guān)的催乳素家族成員包括垂體分泌的催乳素， 子宮蛻膜分泌的蛻膜催乳素， 以及胎盤分泌的催乳素樣蛋白和催乳素相關(guān)蛋白。 典型的催乳素家族成員通過催乳素受體起作用。 非典型的催乳素家族成員作為生長因子、神經(jīng)遞質(zhì)或免疫調(diào)節(jié)因子，以自分泌或旁分泌方式起作用。在哺乳動物妊娠過程中，催乳素家族成員發(fā)揮重要功能，它們參與母體對妊娠的適應(yīng)，促進(jìn)泌乳，維持黃體，促進(jìn)胚胎著床和血管發(fā)生，促進(jìn)細(xì)胞生長和分化，并在免疫調(diào)節(jié)中起作用［28］。

6-丙酮酰四氫蝶呤合成酶 （6-pyruvoyl tetrahydropterin synthase，Pts） 基因參與葉酸生物合成過程［29］。流行病學(xué)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，葉酸缺乏會增加胎盤早剝的風(fēng)險［30］。趙艷華等［31］研究發(fā)現(xiàn)，在由葉酸缺乏引起的孕鼠子宮內(nèi)膜蛻膜化進(jìn)程異常過程中，mTOR 信號通路發(fā)揮重要的調(diào)控作用。 VA及其活性代謝產(chǎn)物作為人類一種必需的營養(yǎng)物質(zhì)，參與體內(nèi)許多生理過程，包括視力、生殖、生長、細(xì)胞分化、免疫功能以及胚胎發(fā)育等。 自然存在或合成的具有與VA 類似結(jié)構(gòu)的化合物稱為VA 類物。 在正常的胚胎發(fā)育過程中維持恰當(dāng)?shù)腣A 水平很重要，在孕期VA 缺乏或過多地應(yīng)用均可導(dǎo)致胚胎發(fā)育異常［32］。

綜上所述， 該研究發(fā)現(xiàn)的候選基因直接或間接參與胚胎著床，主要通過激素調(diào)節(jié)、胚胎侵入、維生素合成代謝等三方面發(fā)揮作用。 在今后的研究中，有望通過進(jìn)一步的基因功能驗(yàn)證試驗(yàn)，揭示所選基因與早期流產(chǎn)相關(guān)， 從而為研究制定馬匹早期流產(chǎn)的預(yù)防和治療策略， 以及繁殖新技術(shù)的開發(fā)提供參考。