子癇前期孕婦血清維生素D水平與維生素D受體基因多態(tài)性的相關(guān)性

李祥雯 李 晶 朱啟英

子癇前期(preeclampsia, PE)是特發(fā)于人類的以孕期血壓升高、并導(dǎo)致一系列母胎并發(fā)癥為特征的妊娠期特有疾病。在全球范圍內(nèi)的發(fā)生率約占孕婦總數(shù)的5%～10%[1]。在我國，隨著二胎政策的全面放開，PE的發(fā)生率也逐漸升高。PE的發(fā)生、發(fā)展涉及多種因素，近年來流行病學(xué)研究及臨床研究均提示孕期血清維生素D(vitamin D，VD)水平低下是PE的相關(guān)因素[2～4]。VD受體(VDR)是類固醇激素/甲狀腺激素受體超家族的成員，人類幾乎所有的組織和細(xì)胞中都發(fā)現(xiàn)存在 VDR，強(qiáng)調(diào)VDR可廣泛調(diào)節(jié)全身組織和細(xì)胞的功能[5]。VDR由一個(gè)巨大的基因(> 100kb)編碼，每一種基因變體如果出現(xiàn)在至少1%的人群中，就稱為多態(tài)性[6]。VDR基因具有4個(gè)精確描述的雙等位基因多態(tài)性，即BsmI (A>G)、ApaI (A>C)、FokI (C>T)和TaqI (T>C)。VDR等位基因變異和受體的不同表達(dá)在許多健康問題中起著關(guān)鍵作用，如乳腺癌或自身免疫性疾病[7,8]。但VDR及其等位基因變異，特別是不同維生素D水平下在子癇前期發(fā)生上的作用尚未明確。為此筆者醫(yī)院進(jìn)行了一項(xiàng)對照研究，報(bào)告如下。

資料與方法

1.臨床資料：納入標(biāo)準(zhǔn)：①孕周20～28周；②均規(guī)律產(chǎn)檢；③均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)妊娠期高血壓疾病學(xué)組制定的《妊娠期高血壓疾病診治指南(2015)》中關(guān)于子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；④臨床資料完整；⑤均為單胎妊娠。排除標(biāo)準(zhǔn)：①存在器質(zhì)性疾病、免疫系統(tǒng)疾病、血液病等基礎(chǔ)疾病者；②多胎妊娠；③妊娠期甲狀腺功能減退或甲狀腺功能亢進(jìn)者；④合并慢性高血壓、心臟病、腎病、糖尿病及肝病病史，輸血、免疫治療史的孕婦。共納入2018年2月～2019年4月新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的子癇前期孕婦100例，設(shè)為PE組；另選取同期健康規(guī)律產(chǎn)檢孕婦100例，設(shè)為對照組。

2.收集指標(biāo)：通過病歷回顧孕早期兩組孕婦的基本臨床資料，包括年齡、孕周、BMI、收縮壓、舒張壓，肝功能指標(biāo)[谷草轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(AST)、直接膽紅素(Db)、間接膽紅素(Tb)、白蛋白(Alb)]、血清甘油三酯(TG)和膽固醇(TC)及1,25(OH)2D3、鈣離子水平。

3.VDR基因多態(tài)性檢測：采集所有受試者的外周血5ml，采用Bioteke DNA提取試劑盒[中國江蘇無錫百泰克生物技術(shù)有限公司，批準(zhǔn)文號：滬食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2014第1400585號]提取DNA，分光光度儀測定DNA的濃度及純度，并置于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。維生素D受體基因BsmI、FokI、TaqI、ApaI的單核苷酸多態(tài)性采用 TaqMan 系統(tǒng)和 ABI7900HT RT-PCR 儀器(美國Life Technologies公司)進(jìn)行測量。采用Apaman探針實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)檢4個(gè)位點(diǎn)的基因型，引物由美國Applied Bio 生物科技公司設(shè)計(jì)研發(fā)，Apa位點(diǎn)的上游引物序列為5′-ACCCATAATAAGAAATAGTTTTA-3′，下游引物序列為5′-TGTGACCTAGTTTAC-3′；FokI位點(diǎn)的上游引物序列為5′-AGCTGGCCCTGGCACTGACTCTGCTCT-3′，下游引物序列為5′-ATGGAAACACCTTGCTTCTTCTCCCTC-3′。TaqI位點(diǎn)的上游引物序列為5′-CAGAGCATGGACAGGGAGCAAG-3′，下游引物序列為5′-GGATGTACGTCTGCAGTGTG-3′；BmsI位點(diǎn)的上游引物序列為5′-CAACCAAGACTACAAGTACCGCGTCATGA-3′，下游引物序列為5′-AACCAGCGGGAAGAGGTCAAGGG-3′。PCR采用25μl反應(yīng)體系，擴(kuò)增條件為95℃預(yù)變性3min，95℃15s，60℃1min，共45個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增結(jié)束后采用Bio-Rad C FX manager 3.0 軟件進(jìn)行基因型分析。

結(jié) 果

1.PE和對照組孕婦一般資料比較：PE組孕婦血清1,25(OH)2D3、血鈣及白蛋白水平低于對照組，甘油三酯水平高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表1。

表1 兩組孕婦一般資料比較

2.兩組孕婦VDR基因多態(tài)性比較:兩組孕婦VDR基因4個(gè)位點(diǎn)的基因型、等位基因頻率比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表2。

表2 兩組孕婦VDR基因多態(tài)性比較

3.兩組中低1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態(tài)性比較：PE組VDR基因位點(diǎn)中BsmI GG基因型、G等位基因頻率及ForI CC基因型、C等位基因頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，詳見表3。

表3 兩組低1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態(tài)性比較

3.兩組正常1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態(tài)性比較:PE組與對照組各VDR基因位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率情況比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，詳見表4。

表4 兩組正常1,25(OH)2D3水平的孕婦間VDR基因多態(tài)性比較

討 論

PE通常表現(xiàn)為孕20周以后出現(xiàn)的血壓升高，但研究顯示，PE的發(fā)生起始基礎(chǔ)是早孕期胚胎著床和胎盤形成不良，引起胎盤局部缺血缺氧、炎癥和免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失衡，釋放各種因子，引起全身小血管痙攣[10]。多項(xiàng)研究顯示,孕期血清維生素水平低下是PE的高危因素，孕早期維生素D缺乏可增加早發(fā)型PE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。臨床研究顯示，約40%～62%的女性在孕早期血清內(nèi)存在維生素D缺乏，這就可能增加PE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[11]。維生素D能夠廣泛調(diào)節(jié)全身組織和細(xì)胞功能，除了直接調(diào)節(jié)鈣磷骨代謝外，對于免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)也具有一定的作用。維生素D參與上述調(diào)節(jié)需要細(xì)胞膜上的VDR參與，VDR廣泛存在于全身各組織細(xì)胞中，妊娠期子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞和妊娠早期蛻膜細(xì)胞等多種生物組織細(xì)胞中均有VDR的表達(dá)。還有研究表明，VDR及VDR信號途徑在胎盤中具有重要作用，子癇前期患者胎盤組織中VDR表達(dá)水平低可能與子癇前期發(fā)生有關(guān)[12]。VDR調(diào)節(jié)異?？赡苁堑退?,25(OH)2D3參與PE形成的關(guān)鍵原因，也是機(jī)制研究的一個(gè)切入點(diǎn)；但目前國內(nèi)外尚未見有1,25(OH)2D3降低PE發(fā)生的機(jī)制研究。維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)是由VDR基因編碼，VDR基因位于12號染色體長臂1區(qū)3帶，全長75kb，由9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子組成，包含有多個(gè)單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)， VDR基因多態(tài)性是指每種基因多態(tài)性位點(diǎn)出現(xiàn)在至少1%的人群中就稱為該基因的多態(tài)性[13]。常見的VDR多態(tài)性位點(diǎn)為rsl544410、rs7975232、rs731236以及rs2228570雙等位基因位點(diǎn)，而這些等位基因的變異進(jìn)而導(dǎo)致其受體呈現(xiàn)不同表達(dá)，對于許多疾病的發(fā)展起著重要作用，但在妊娠期的作用特別是對于子癇前期發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的機(jī)制尚不明確[14]。

本研究的維生素D水平與國內(nèi)其他學(xué)者研究的新疆地區(qū)的維生素D水平相類似，均低于中東部地區(qū)人群[15]。另外VDR受體多態(tài)性也與國內(nèi)關(guān)于新疆地區(qū)人群中VDR的研究類似[16]。新疆地區(qū)孕婦的子癇前期發(fā)生率也高于中東部地區(qū)，可能與人種和新疆地區(qū)居民的飲食結(jié)構(gòu)有關(guān)[17]。

在本研究中，PE組孕婦血清1,25(OH)2D3、血鈣及白蛋白水平低于對照組，甘油三酯水平高于對照組，分析認(rèn)為，子癇前期孕婦體內(nèi)存在多種物質(zhì)代謝紊亂，特別是脂代謝紊亂和胰島素代謝異常，國外文獻(xiàn)也報(bào)道了相同的結(jié)論[18]。維生素D在體內(nèi)的活性形式為1,25(OH)2D3，通過與VDR結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)，包括調(diào)節(jié)鈣磷骨代謝和相關(guān)蛋白的合成等。國內(nèi)有研究者利用前瞻性隊(duì)列分析顯示，超過2/3的重度子癇前期患者處于維生素D缺乏或不足的狀況，其血清1,25(OH)2D3水平于妊娠第6～10周就明顯低于正常妊娠者[19]。在妊娠期VD通過與VDR結(jié)合參與胚胎著床、調(diào)節(jié)妊娠相關(guān)蛋白合成、調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成及鈣的輸送，對于維持正常妊娠和胎兒生長發(fā)育發(fā)揮著重要作用。

進(jìn)一步分析VDR基因的多態(tài)性，25(OH)2D3水平低的PE組VDR基因位點(diǎn)中BsmI GG基因型、G等位基因頻率及ForI CC基因型、C等位基因頻率高于對照組；但1,25(OH)2D3水平正常的PE組和對照組之間各基因位點(diǎn)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示VDR基因多態(tài)性影響血清維生素D水平的高低，也影響PE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。分析上述現(xiàn)象，VDR基因多態(tài)性可能會(huì)影響VDR基因的表達(dá)和功能，并可能影響1,25(OH)2D3與VDR的結(jié)合。有研究指出，BsmI位點(diǎn)的多態(tài)性會(huì)影響鈣的吸收及VDR在小腸上皮細(xì)胞的表達(dá)，進(jìn)一步影響VD的吸收[20]。

正常水平的血清維生素D可以通過抑制RAS來預(yù)防高血壓。同樣，維生素D可以通過抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖來影響血壓，維生素D含量過低可能會(huì)增強(qiáng)腎素分泌，與血管平滑肌細(xì)胞增殖有關(guān)的機(jī)制可能是子癇前期的發(fā)病一個(gè)潛在因素。已發(fā)現(xiàn)FokI和BsmI的常見VDR多態(tài)性與妊娠外高血壓風(fēng)險(xiǎn)之間有很強(qiáng)的聯(lián)系，另外，有關(guān)于克羅恩病和VDR基因多態(tài)性關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)orI位點(diǎn)的基因突變能夠影響克羅恩病的嚴(yán)重程度，VD與相應(yīng)的受體結(jié)合增強(qiáng)了局部的炎性反應(yīng)有關(guān)[21]。而1,25(OH)2D3低下的PE患者ForI位點(diǎn)CC基因型、C等位基因頻率較高，這些突變基因型的VDR受體在于VD結(jié)合后有可能增加胎盤及子宮內(nèi)血管壁的炎癥，增加了PE的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

綜上所述，子癇前期孕婦體內(nèi)1,25(OH)2D3水平較低，這種低水平的狀態(tài)可能與維生素D受體基因位點(diǎn)BsmI和ForI多態(tài)性有關(guān)；低1,25(OH)2D3水平且BsmI位點(diǎn)GG基因型及ForI位點(diǎn)CC基因型比例較高的孕婦易發(fā)生子癇前期。