ROS/p38MAPK通路對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲能力的影響

謝海娟 龍文清 王毓興 姜 媛 俞紅女

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是消化道常見的惡性腫瘤，在全球范圍內(nèi)，其病死率在惡性腫瘤中位居第2位，約15%～20%的患者初診時已發(fā)生臟器的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1, 2]。目前，盡管CRC在臨床治療方面取得了顯著的進(jìn)步,如放療、化療、手術(shù)切除、生物靶向和免疫療法的綜合治療方法,但是CRC患者的預(yù)后仍不理想,尤其是晚期的CRC由于較高的局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，其5年總生存期(OS)率不到10%，因此進(jìn)一步提高療效仍面臨著巨大挑戰(zhàn)[3]。

腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移是腫瘤患者治療失敗的主要原因，也是腫瘤臨床治療和基礎(chǔ)研究的重點、焦點[4]。侵襲是腫瘤向血管外以及鄰近組織轉(zhuǎn)移的起始階段，也貫穿著癌癥發(fā)展的全過程?；|(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中非常重要的調(diào)控分子，主要通過降解ECM和基膜發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)[5]。MMP-9是MMPs家族中的重要成員，已有報道證實在腦、前列腺、乳腺、結(jié)直腸癌等腫瘤患者中MMP-9的表達(dá)水平與其轉(zhuǎn)移程度及預(yù)后密切相關(guān)[6～9]。已有報道指出，TNF、12-O-十四烷基酚-13-乙酸酯(TPA)等可激活細(xì)胞內(nèi)多種信號通路誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)錄因子如c-fos、核因子-κB(NF-κB)和激活蛋白-1(AP-1)等參與調(diào)控MMP-9的表達(dá)[10]。這些誘導(dǎo)因子中TPA是蛋白激酶C(PKC)的特異性激活劑，在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用[11]?；钚匝?ROS)作為信號分子，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用[12]。已有研究表明，PKC的激活可誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，并進(jìn)一步激活A(yù)P-1和NF-κB信號通路[13, 14]。因此，探究MMP-9及其上游途徑的調(diào)控機(jī)制，將是惡性腫瘤研究和治療的重要方向。

本研究觀察PKC誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞的侵襲作用，探討ROS/p38MAPK通路參與PKC/MMP-9表達(dá)及細(xì)胞侵襲的作用機(jī)制，為治療結(jié)直腸癌侵襲轉(zhuǎn)移提供多靶點理論依據(jù)。

材料與方法

1.材料：人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞株購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫，RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司；TPA、GF109203X、NAC、SB203580購自美國Sigma公司；Bradford蛋白濃度檢測試劑盒、ECL試劑盒購自北京索萊寶公司；anti-p38、anti-p-p38、anti-β-actin購自美國Abcam公司；anti-p65、anti-MMP-9、HRP標(biāo)記IgG購自美國Santa Cruz公司；Transwell侵襲系統(tǒng)購自美國Costar公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)：利用含有10%FBS的RPMI1640完全培養(yǎng)基，在5%CO2的37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞，當(dāng)達(dá)到80%～90%融合度時進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)。

3. Western blot法：根據(jù)實驗?zāi)康倪M(jìn)行100nmol/L TPA處理，或預(yù)處理 PKC抑制劑GF109203X(1μmol/L)、ROS抑制劑NAC(50μmol/L)、p38抑制劑SB203580(20μmol/L)，1h后與100nmol/L TPA共孵育。用總蛋白提取液或核蛋白提取試劑盒提取蛋白，每孔以30μg蛋白上樣，SDS-PAGE電泳進(jìn)行分離蛋白，并PVDF膜轉(zhuǎn)移，5%脫脂牛奶封閉2h，在4℃環(huán)境下孵育一抗過夜，TTBS洗膜，常溫孵育二抗2h，再次洗膜，ECL試劑盒顯影，利用圖像分析儀觀察蛋白表達(dá)水平。

4.活性氧檢測：為了動態(tài)實時觀察細(xì)胞內(nèi)活性氧濃度的變化，利用激光共聚焦顯微鏡檢測。細(xì)胞培養(yǎng)在100g/ml poly-L-lysine 涂層的共聚焦培養(yǎng)皿3h，HBSS緩沖液洗3次，2,7-dichlorofluorescin dictate (DCF-DA)熒光探針孵育1h。根據(jù)實驗?zāi)康耐瑫r預(yù)處理各種抑制劑1h，洗滌3次，在488nm激發(fā)/530nm發(fā)射下，待熒光信號穩(wěn)定后給與TPA處理，用光電倍增管收集530nm處發(fā)射的熒光，共聚焦顯微鏡(Nikon)動態(tài)檢測分析活性氧的含量。

5.明膠酶譜法：使用無血清的培養(yǎng)基處理各組細(xì)胞，24h后收集細(xì)胞上清液，與非還原緩沖液混合制備上樣品，在0.1%明膠的聚丙烯酰胺凝膠中進(jìn)行電泳，2.5%Triton X-100緩沖液洗滌30min，在37℃環(huán)境中以0.02% Brij，5mmol/L CaCl2，50mmol/L Tris-HCl(pH7.5)溶液孵育過夜。進(jìn)行0.25%考馬斯亮藍(lán)染色以及脫色，在圖像分析儀上拍照分析。

6.Transwell侵襲實驗檢測：各組細(xì)胞懸液加入到有基質(zhì)膠的上室，下室以條件培養(yǎng)基共孵育24h。然后，用棉簽將留在腔室上側(cè)的細(xì)胞除去，腔室下側(cè)的細(xì)胞用0.1%甲醇固定并用甲苯胺藍(lán)溶液染色，利用光學(xué)顯微鏡檢測腔室下側(cè)的侵襲細(xì)胞。

結(jié) 果

1.TPA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響：利用免疫電泳法觀察PKC激動劑TPA100nmol/L處理不同時間時細(xì)胞內(nèi)MMP-9蛋白表達(dá)的情況。與0h比較，TPA誘導(dǎo)MMP-9蛋白表達(dá)上調(diào)，即呈時間依賴性，表明結(jié)直腸癌細(xì)胞中PKC激活可誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)上調(diào)(P<0.01，圖1)。

2.TPA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞ROS生成的影響：為了研究TPA誘導(dǎo)細(xì)胞侵襲過程中對ROS的作用，利用激光共聚焦測定了細(xì)胞內(nèi)ROS的變化。與對照組比較，TPA組細(xì)胞內(nèi)ROS水平顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與TPA組比較，預(yù)處理PKC抑制劑GF109203X或ROS抑制劑NAC后細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖1 TPA對SW480細(xì)胞MMP-9蛋白表達(dá)的影響 與空白對照組比較，*P<0.01

3.ROS對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞p38MAPK通路的激活作用：為進(jìn)一步觀察TPA誘導(dǎo)MMP-9的分子通路，檢測了TPA誘導(dǎo)下p38的磷酸化情況。100nmol/L TPA在不同時間處理可時間依賴性上調(diào)p-p38的表達(dá)，在0.5h時表達(dá)上調(diào)最為明顯(P<0.01，圖3A)；與TPA組比較，預(yù)處理PKC抑制劑GF109203X或ROS抑制劑NAC后p-p38表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.05，圖3B)。

4.ROS/p38MAPK對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞NF-κB通路的影響：為了證實ROS/p38MAPK介導(dǎo)細(xì)胞侵襲的分子機(jī)制，利用PKC抑制劑/ROS抑制劑/p38抑制劑預(yù)處理，然后與TPA共孵育，Western blot法檢測核內(nèi)NF-κB亞基p65的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組比較，TPA明顯上調(diào)核內(nèi)p65蛋白的表達(dá)(P<0.01)；與TPA組比較，預(yù)處理PKC抑制劑、ROS抑制劑、p38抑制劑明顯下調(diào)p65核內(nèi)表達(dá)(P<0.01，圖4)。

圖2 TPA對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞ROS的作用 與對照組比較，*P<0.01；與TPA組比較，#P<0.01

圖3 TPA對SW480細(xì)胞p38MAPK通路的激活作用 A. TPA對p38磷酸化的影響；B.各種抑制劑對TPA誘導(dǎo)p38磷酸化的影響；與對照組比較， *P<0.01；與TPA組比較，#P<0.05，##P<0.01

圖4 ROS/p38通路對核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的影響 與對照組比較，*P<0.01；與TPA組比較，#P<0.01

5.ROS/p38MAPK對TPA誘導(dǎo)結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞MMP-9表達(dá)的影響：利用各種抑制劑預(yù)處理，采用蛋白印跡法檢測MMP-9蛋白表達(dá)情況，明膠酶譜法檢測MMP-9的分泌情況。與對照組比較，TPA組MMP-9蛋白表達(dá)及分泌顯著增加(P<0.01)；與TPA組比較，PKC抑制劑、ROS抑制劑、p38抑制劑組的MMP-9表達(dá)及分泌均顯著降低(P<0.01，圖5)。

6.ROS/p38MAPK對結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞侵襲能力的影響：利用Transwell檢測TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞侵襲能力。TPA處理可誘導(dǎo)侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增加，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)；與PKC抑制劑、ROS抑制劑、P38抑制劑聯(lián)合應(yīng)用后，侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，且與單用TPA組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，圖6)。

圖5 ROS/p38通路對MMP-9蛋白表達(dá)及分泌的影響 與對照組比較，*P<0.01；與TPA組比較，#P<0.01

圖6 ROS/p38通路對細(xì)胞侵襲能力的影響(甲苯胺藍(lán)，×200) A.空白對照組；B.TPA組；C.TPA+GF109203X組；D.TPA+NAC組；E.TPA+SB203580組； 與對照組比較，*P<0.01；與TPA組比較，#P<0.01

討 論

近年來結(jié)直腸癌發(fā)生率呈逐年快速上升趨勢，嚴(yán)重威脅我國人民的健康。結(jié)直腸癌早期臨床癥狀不典型，導(dǎo)致部分患者在初診時就已發(fā)生了腫瘤播散轉(zhuǎn)移，病死率居高不下[15]。腫瘤侵襲在癌癥轉(zhuǎn)移中起著至關(guān)重要的作用，抑制腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是癌癥治療的重要目標(biāo)。

MMP-9是腫瘤浸潤和轉(zhuǎn)移過程中的關(guān)鍵蛋白水解酶，可以通過降解腫瘤微環(huán)境中的基質(zhì)，破壞生化機(jī)械屏障，以獲得到細(xì)胞運動性，浸潤周圍組織、侵襲血管淋巴管實現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的啟動[16]。有研究表明，在多種腫瘤組織中MMP-9蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，與患者的腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移等不良事件密切相關(guān)，可作為評估腫瘤預(yù)后的風(fēng)險因子，阻滯MMP-9表達(dá)及活性已成為預(yù)防和治療腫瘤轉(zhuǎn)移的研究焦點[17, 18]。因此，闡明MMPs在結(jié)直腸癌細(xì)胞內(nèi)的激活途徑和分子機(jī)制顯得尤為重要。PKCs屬于蛋白激酶家族，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中起著重要作用[19]。筆者的研究表明，PKC特異性激活劑TPA可增加結(jié)直腸癌細(xì)胞MMP-9蛋白的表達(dá)及分泌，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲過程，而這種促進(jìn)作用可被PKC抑制劑GF109203X所抑制。這與相關(guān)研究中的TPA作為MMP-9的誘導(dǎo)劑參與多種信號通路激活的結(jié)論相符，也證實了在結(jié)直腸癌細(xì)胞中PKC激活可促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移[20]。

活性氧(ROS)是腫瘤發(fā)展的一個重要因素，可通過調(diào)控ROS的釋放進(jìn)一步介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的增殖、分化以及侵襲轉(zhuǎn)移過程。在腫瘤細(xì)胞中，TPA誘導(dǎo)激活PKC可促進(jìn)ROS的釋放，同時ROS的增加可以進(jìn)一步增強(qiáng)MAPK的活性，促進(jìn)人肝癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲過程[21]。促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)為絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是細(xì)胞內(nèi)主要信息傳遞因子，參與調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖凋亡以及MMP-9的表達(dá)[22]。p38是MAPK家族中的重要成員，激活PKC可誘導(dǎo)p38磷酸化促進(jìn)細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移[23]。本研究結(jié)果顯示，PKC抑制劑和ROS抑制劑可阻滯TPA誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)ROS生成和p38的磷酸化，驗證了TPA誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲過程中激活ROS/p38MAPK信號通路。并且，PKC抑制劑、ROS抑制劑和p38抑制劑均阻滯了SW480細(xì)胞MMP-9的表達(dá)及侵襲能力，進(jìn)一步說明了TPA通過ROS-p38MAPK通路誘導(dǎo)MMP-9表達(dá)和細(xì)胞侵襲。

NF-κB是調(diào)控MMP-9基因表達(dá)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，細(xì)胞內(nèi)多種信號通路級聯(lián)參與了NF-κB的激活。在乳腺癌細(xì)胞中ROS、MAPK信號通路參與了NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的激活，進(jìn)而調(diào)控MMP-9基因表達(dá)[24]。本研究結(jié)果顯示，PKC抑制劑、ROS抑制劑、p38抑制劑均明顯抑制TPA誘導(dǎo)的核內(nèi)p65的表達(dá)增加，證實了ROS/p38參與PKC誘導(dǎo)結(jié)直腸癌細(xì)胞NF-κB信號通路的激活過程。

綜上所述，TPA激活PKC誘導(dǎo)SW480細(xì)胞MMP-9表達(dá)及細(xì)胞侵襲，證實了ROS通過介導(dǎo)p38MAPK信號通路激活NF-κB，進(jìn)而促進(jìn)MMP-9表達(dá)及細(xì)胞侵襲能力的分子機(jī)制，為結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移治療提供了新的思路。