抑制TLR4對(duì)急性呼吸窘迫綜合征小鼠的保護(hù)作用及機(jī)制研究

姜 蕓 郭 紅

急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome, ARDS)是一種危及生命的呼吸系統(tǒng)疾病，是危重癥醫(yī)學(xué)中最具有挑戰(zhàn)性的臨床疾病之一。它是由創(chuàng)傷、炎癥、膿毒血癥等各種肺內(nèi)、外致病因素所引發(fā)的急性呼吸衰竭[1]。ARDS引起的病死率高達(dá)40%～60%[2，3]。目前，ARDS發(fā)病機(jī)制尚不明確，但是已有研究表明，其病理過程與炎性反應(yīng)密切相關(guān)，肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的炎性反應(yīng)，TNF-α、IL-6等炎性因子大量釋放，并且伴隨炎性細(xì)胞在肺部的大量聚集而進(jìn)一步加重肺組織損傷。已有研究表明，抑制炎性因子的釋放能夠有效緩解ARDS[4，5]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)是一類與炎性反應(yīng)密切相關(guān)的細(xì)胞膜受體，當(dāng)其與LPS等配體結(jié)合后可激活下游NF-κB信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)炎性因子的釋放，TAK242作為TLR4抑制劑，能夠抑制TLR4的表達(dá)[6]。本研究通過使用TAK242抑制TLR4觀察對(duì)脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征的影響及機(jī)制，旨在為ARDS臨床治療和研究提供幫助。

材料與方法

1.材料：6周齡雄性BALB/c小鼠45只，體質(zhì)量20～25g,購自新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)取材過程中嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理保護(hù)等相關(guān)規(guī)定；LPS購自美國Sigma公司；TAK242購自美國MedChemExpress公司；TLR4、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)、NF-κB一抗購自沈陽萬類生物科技有限公司；辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購自福麥斯生物技術(shù)有限公司；TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒購自烏魯木齊熬銳東源生物科技有限公司；血?dú)夥治鰞xABL90購自丹麥Radiometer公司。

2.動(dòng)物分組及造模：45只BALB/c小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組、模型組(ARDS組)和TLR4抑制劑TAK242組(TAK242組)。ARDS組和TAK242組小鼠分別尾靜脈注射5ng/g的LPS誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生膿毒血癥，制備膿毒血癥性急性肺損傷模型，對(duì)照組小鼠注射等體積的0.9%氯化納注射液，TAK242組小鼠造模的同時(shí)給予5ng/g TAK242。

3.行動(dòng)脈血?dú)夥治觯航o藥治療結(jié)束后，各組小鼠麻醉成功后，暴露腹主動(dòng)脈，用經(jīng)肝素潤洗的1ml一次性注射器抽出動(dòng)脈血約0.3ml，使用血?dú)夥治鰞x行血?dú)夥治?，比較PaO2/FiO2。

4.ELISA檢測血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：給藥結(jié)束后，各組小鼠麻醉后，開胸取腹主動(dòng)脈300μl全血，室溫靜置4h后，3500r/min、4℃離心15min，分離上層血清，按照ELISA試劑盒檢測方法分別測定血清TNF-α、IL-6含量。

5.HE染色:實(shí)驗(yàn)完成后，各組小鼠解剖取肺組織于組織固定液中固定，制作肺組織石蠟切片進(jìn)行染色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，并拍照記錄。

6.免疫組化:實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，各組小鼠解剖取肺組織于組織固定液中固定24h，石蠟包埋后制備石蠟切片，然后置于二甲苯中脫蠟，依次經(jīng)乙醇和蒸餾水中復(fù)水；使用檸檬酸緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù)，經(jīng)BSA封閉后一抗孵育過夜，清洗后二抗孵育，然后切片用蘇木精復(fù)染，使用中性樹脂封片后于顯微鏡下觀察。應(yīng)用IPP 圖像分析軟件測定小鼠肺組織各蛋白表達(dá)的平均吸光密度值來進(jìn)行分析。

7.Western blot法檢測TLR4、NF-κB蛋白表達(dá):取各組小鼠肺組織50mg，加入100ml RIPA蛋白裂解液，使用勻漿機(jī)于冰上勻漿，勻漿液 12000r/min離心15min，取上清即為組織總蛋白；BCA蛋白定量后樣品煮沸變性；然后進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，用5%的脫脂牛奶對(duì)PVDF膜封閉2h，然后以1∶1000比例稀釋后的TLR4、NF-κB一抗4℃孵育過夜，TBST洗膜后二抗室溫孵育1h，再用TBST洗膜后按照ECL試劑盒說明書配置發(fā)光液，并將PVDF膜浸入發(fā)光液中反應(yīng)30s，曝光并拍照，用Image J軟件對(duì)曝光結(jié)果進(jìn)行定量分析。

結(jié) 果

1.各組小鼠行血?dú)夥治鰴z測結(jié)果：與對(duì)照組比較，ARDS組小鼠PaO2/FiO2值顯著降低(452.00±9.54 vs 263.30±21.63,P<0.05)；與ARDS組比較，TAK242組小鼠PaO2/FiO2值顯著增加(263.30±21.63 vs 308.12±13.53,P<0.05)。

2.血清炎性因子TNF-α、IL-6水平：與對(duì)照組比較，ARDS組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著升高(P<0.05)；與ARDS組比較，TAK242組小鼠血清TNF-α、IL-6水平顯著降低(P<0.05，表1)。

表1 各組小鼠血清TNF-α、IL-6水平比較

3.小鼠肺組織病變:HE染色檢測結(jié)果顯示，對(duì)照組小鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)完整，組織細(xì)胞排列整齊，沒有出現(xiàn)出血以及炎性細(xì)胞的浸潤，沒有病理損傷；ARDS組小鼠肺組織出現(xiàn)彌散性肺損傷，肺泡壁損傷嚴(yán)重，肺間質(zhì)嚴(yán)重增寬，出現(xiàn)紅細(xì)胞露出，炎性細(xì)胞浸潤明顯，肺組織損傷嚴(yán)重，說明ARDS造模成功；TAK242組小鼠肺組織損傷程度較弱，肺泡結(jié)構(gòu)相對(duì)完整，炎性浸潤較ARDS組顯著減少，提示TAK242能夠緩解ARDS小鼠肺組織損傷(圖1)。

4.免疫組化檢測各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)：ARDS組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)高于對(duì)照組，而TAK242組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)低于ARDS組(圖2，表2)。

5.Western blot法檢測各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)：與對(duì)照組比較，ARDS組小鼠肺組織TLR4、NF-κB表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05)。與ARDS組比較，TAK242治療組小鼠TLR4、NF-κB表達(dá)水平均顯著下調(diào)(P<0.05,圖3)。

圖2 免疫組化檢測各組小鼠TNF-α、 IL-6表達(dá)結(jié)果(×200)

表2 各組小鼠肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)的 平均光密度統(tǒng)計(jì)

圖3 各組小鼠肺組織TLR4、NF-κB蛋白表達(dá)水平 與對(duì)照組比較，*P<0.05；與ARDS組比較，#P<0.05

討 論

研究表明，ARDS的主要病理特征為肺組織中蛋白質(zhì)類液體累積，炎性反應(yīng)暴發(fā)浸潤肺部，威脅患者的生命[7]。現(xiàn)階段臨床常采用機(jī)械通氣治療以及非機(jī)械治療，但治療效果并不理想。因此，控制炎性反應(yīng)、探究新型有效的抗炎治療藥物對(duì)于ARDS的臨床治療亦至關(guān)重要[8～10]。Toll樣受體(Toll-like receptors, TLR)是參與非特異性免疫(天然免疫)的一類重要蛋白質(zhì)分子，也是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁。TLR可以識(shí)別來源于微生物的具有保守結(jié)構(gòu)的分子并激活機(jī)體產(chǎn)生免疫細(xì)胞應(yīng)答，對(duì)病原微生物感染早期的特異性識(shí)別及介導(dǎo)炎性反應(yīng)具有十分重要的意義[11,12]。

另一方面，LPS是由免疫活性宿主中的細(xì)菌所產(chǎn)生的，可以在體內(nèi)外引起強(qiáng)烈的炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，并且在體內(nèi)可誘發(fā)感染，進(jìn)而引起肺組織嚴(yán)重的炎性反應(yīng)[13]。TLR4可以通過識(shí)別宿主壞死細(xì)胞釋放的熱休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)等促進(jìn)內(nèi)源性酶的級(jí)聯(lián)活化反應(yīng)，激活下游NF-κB信號(hào)通路，促進(jìn)TNF-α、IL-1β、IL-2、IL-6、趨化因子、黏附分子、集落刺激因子等細(xì)胞因子的釋放，介導(dǎo)體內(nèi)炎癥暴發(fā)[14]。本研究通過LPS誘導(dǎo)了小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型，旨在探究TAK242作為TLR4的選擇性的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制劑對(duì)ARDS小鼠的治療作用及機(jī)制。結(jié)果表明， TAK242能夠顯著增加ARDS小鼠氧合指數(shù)，改善ARDS小鼠血氧水平，并且降低血清炎性因子TNF-α、IL-6水平，緩解體內(nèi)炎性反應(yīng)。病理切片檢測結(jié)果顯示，TAK242能夠顯著改善ARDS小鼠肺組織損傷，以及肺組織TNF-α、IL-6表達(dá)水平，并且抑制ARDS小鼠肺組織TLR4及NF-κB表達(dá)，說明TAK242抑制TLR4表達(dá)而抑制NF-κB信號(hào)通路進(jìn)而緩解小鼠ARDS。

綜上所述，TAK242能夠通過阻斷TLR4抑制小鼠ARDS炎性因子表達(dá)，進(jìn)而抑制下游NF-κB信號(hào)通路及炎性反應(yīng)，發(fā)揮對(duì)ARDS小鼠的治療作用。