肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)tsRNA表達(dá)譜的影響及其功能研究

李 涵 潘 勤

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)一類膜性細(xì)胞器，有脂質(zhì)合成、蛋白質(zhì)加工及鈣離子穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)等重要功能。當(dāng)細(xì)胞受到損傷刺激時(shí)，可發(fā)生以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)錯(cuò)誤折疊或未折疊蛋白積聚、鈣離子平衡紊亂為特征的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ERS)[1]。適度的ERS有助于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的恢復(fù)，持續(xù)的ERS則可能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

近年來(lái)伴隨肥胖的全球流行和生活方式的逐漸西化，以肝細(xì)胞脂肪變性、氣球樣變、小葉內(nèi)炎癥等為主要病理表現(xiàn)的非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)日益高發(fā)，已經(jīng)成為公共衛(wèi)生的重要負(fù)擔(dān)[2]。有研究表明，ERS既能夠誘導(dǎo)脂肪生成，又可參與胰島素抵抗和自噬來(lái)驅(qū)動(dòng)肝臟脂肪變性，從而在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。然而，ERS介導(dǎo)NAFLD的病理生理機(jī)制尚未完全闡明。

據(jù)近年來(lái)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)激可誘導(dǎo)一類tRNA衍生性小RNA(tRNA derived small RNA, tsRNA)的產(chǎn)生。tsRNA是由成熟tRNA或tRNA前體經(jīng)酶切產(chǎn)生的非編碼RNA[4]。研究顯示，tsRNA在肥胖癥、酒精性脂肪性肝病等代謝性疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[5～7]。因此，本研究采用棕櫚酸鈉誘導(dǎo)肝細(xì)胞脂肪變，從而建立ERS模型，以此為基礎(chǔ)探討tsRNA在肝脂肪變中的表達(dá)情況及其潛在功能。

材料與方法

1.材料：小鼠肝細(xì)胞株AML12由中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供； ITS液體培養(yǎng)基補(bǔ)充劑(100×,ITS liquid media supplement)、棕櫚酸(palmitic acid, PA)及油紅O粉末均購(gòu)自美國(guó)Simga-Aldrich公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)、DMEM/F12培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RT-qPCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78，GRP7) 兔單克隆抗體、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein C/EBP，CHOP)兔單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；β-tubulin兔單克隆抗體及山羊抗兔二抗購(gòu)自上海優(yōu)寧維公司；RT-qPCR引物購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

2.細(xì)胞培養(yǎng)及ERS模型的建立：采用含ITS、40ng/ml地塞米松及10%FBS的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)AML12細(xì)胞。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的AML12細(xì)胞，隨機(jī)分為對(duì)照組和高脂組，每組設(shè)3個(gè)重復(fù)。待細(xì)胞融合度達(dá)50%～60% 時(shí)，高脂組給予200μmol/L PA干預(yù)24h以建立ERS模型，對(duì)照組予不含PA的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。

3.RT-qPCR檢測(cè)mRNA的表達(dá)：收集各組AML12細(xì)胞，采用Trizol法提取細(xì)胞總RNA，測(cè)定濃度及純度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。然后以cDNA為模板，GAPDH為內(nèi)參照進(jìn)行qPCR反應(yīng)，并采用2-ΔΔCt法計(jì)算GRP78、CHOP的相對(duì)表達(dá)量。GRP78的上游引物序列為：5′-GTGTGTGAGACCAGAACCGT-3′，下游引物序列為：5′-TAGGTGGTCCCCAAGTCGAT-3′；CHOP的上游引物序列為：5′-CCACCACACCTGAAAGCAGAA-3′，下游引物序列為：5′-AGGTGAAAGGCAGGGACTCA-3′。

4.Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)：收集各組AML12細(xì)胞，加入RIPA裂解液，冰上靜置30min，收集裂解液，離心后取上清，用BCA法測(cè)定蛋白濃度。采用10%SDS-PAGE膠行蛋白電泳分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。以5%脫脂牛奶室溫封閉2h后，分別加入抗GRP78(1∶1000)和CHOP(1∶1000)抗體4℃孵育過(guò)夜。TBST清洗后加入二抗，室溫孵育1h。采用化學(xué)發(fā)光液進(jìn)行顯影。以β-tubulin作為內(nèi)參，分析蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

5.油紅O染色：將各組細(xì)胞以4%多聚甲醛固定30min，PBS漂洗兩次，隨后根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行油紅O染色。

6.tsRNA測(cè)序：收集各組細(xì)胞，以Trizol法提取總RNA，測(cè)定其濃度及純度后采用以下步驟制備文庫(kù)：①3′接頭連接；②5′接頭連接；③cDNA合成；④PCR擴(kuò)增；⑤回收0～150bp的PCR擴(kuò)增片段。使用Agilent 2100 Bioanalyzer儀器檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并根據(jù)供應(yīng)商操作說(shuō)明，在Illumina HiSeq 4000測(cè)序儀上進(jìn)行50個(gè)循環(huán)測(cè)序。

7.差異tsRNA的鑒定：使用Q30進(jìn)行質(zhì)控分析，保留Q30>80%的測(cè)序結(jié)果。采用Cutadapt軟件(v1.9.3)去除接頭和低質(zhì)量reads，得到長(zhǎng)度≥16nt的trimmed reads。依據(jù)tsRNA數(shù)據(jù)庫(kù)(MINTbase v2.0)的注釋，統(tǒng)計(jì)每個(gè)tsRNA在每個(gè)樣品trimmed reads中的計(jì)數(shù)，將其作為該tsRNA的原始表達(dá)量。然后使用edgeR軟件(v3.16.5)計(jì)算各tsRNA的變化倍數(shù)和P值。采用倍數(shù)變化>2.0和P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選顯著差異表達(dá)的tsRNA。

8.生物信息學(xué)分析：使用基于TargetScan(http:∥www.targetscan.org)和miRanda(http:∥www.microrna.org)的miRNA靶基因預(yù)測(cè)工具，預(yù)測(cè)tsRNA在小鼠mRNA 3′非翻譯區(qū)的結(jié)合位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行基于Geneontology (http:∥www.geneontology.org/)的功能分析，以及基于KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes )數(shù)據(jù)庫(kù)(http:∥www.kegg.jp/)的信號(hào)通路分析。

結(jié) 果

1.肝細(xì)胞ERS模型的構(gòu)建：經(jīng)200μmol/L 的PA干預(yù)24h后，采用RT-qPCR和Western blot法分別檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志物GRP78、CHOP的表達(dá)變化。結(jié)果顯示，高脂組GRP78及CHOP的mRNA和蛋白表達(dá)水平較對(duì)照組顯著上調(diào)(P<0.01)，詳見(jiàn)圖1。

圖1 棕櫚酸誘導(dǎo)肝細(xì)胞ERS A.GRP78和CHOP mRNA表達(dá)水平; B.GRP78和CHOP蛋白表達(dá)水平

2.肝細(xì)胞ERS對(duì)脂肪變性的影響：經(jīng)油紅O染色，對(duì)照組AML12細(xì)胞內(nèi)未見(jiàn)明顯的脂滴沉積，而高脂組的細(xì)胞質(zhì)內(nèi)存在大量紅色脂滴，詳見(jiàn)圖2。

圖2 肝細(xì)胞油紅O染色(×100) A.對(duì)照組；B.高脂組

3.肝細(xì)胞ERS對(duì)tsRNA表達(dá)譜的影響及差異tsRNA的靶基因預(yù)測(cè)：對(duì)高脂組(n=3)和對(duì)照組(n=3)的細(xì)胞進(jìn)行tsRNA測(cè)序，在兩組中共鑒定出193條tsRNA。以倍數(shù)變化>2及P<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)一步篩選得到10條顯著上調(diào)的tsRNA和28條顯著下調(diào)的tsRNA，詳見(jiàn)圖3。上調(diào)的前5位tsRNA包括：tsRNA-Ser-AGA、tsRNA-Met-CAT、tsRNA-Arg-TCG、tsRNA-Ile-AAT、tsRNA-Ser-GCT；下調(diào)的前5位tsRNA包括：tsRNA-Glu-CTC、tsRNA-pre-Val-TAC-1、tsRNA-pre- Val-TAC-2、tsRNA-Lys-CTT、tsRNA-pre-Val-TAC-3。使用基于TargetScan和miRanda的預(yù)測(cè)工具對(duì)tsRNA作用的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，共得到4973個(gè)靶基因。

圖3 肝細(xì)胞ERS對(duì)tsRNA表達(dá)譜的影響

4.差異tsRNA靶基因的信號(hào)通路分析：針對(duì)差異tsRNA的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行KEGG分析。上調(diào)的差異tsRNA調(diào)控的靶基因在cAMP信號(hào)通路、壞血酸和藻酸鹽代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯的相互轉(zhuǎn)化、淀粉和蔗糖代謝等肝細(xì)胞代謝相關(guān)的信號(hào)通路中高度富集，詳見(jiàn)圖4。下調(diào)的差異tsRNA的靶基因則主要富集于Rap1信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路、VEGF信號(hào)通路、甘油磷脂代謝等信號(hào)通路，詳見(jiàn)圖5。

圖4 上調(diào)的差異tsRNA靶基因的KEGG分析

圖5 下調(diào)的差異tsRNA靶基因的KEGG分析

5.差異tsRNA預(yù)測(cè)靶基因的功能分析：針對(duì)差異tsRNA的預(yù)測(cè)靶基因進(jìn)行GO分析，并列出前10位的功能富集類別，詳見(jiàn)表1。可見(jiàn)上調(diào)的差異tsRNA所調(diào)控的靶基因主要干預(yù)類黃酮代謝、細(xì)胞葡萄糖醛酸化、葡萄糖醛酸代謝、糖醛酸代謝等生物學(xué)過(guò)程。而下調(diào)的差異tsRNA所調(diào)控的靶基因主要影響肝細(xì)胞的代謝功能，如細(xì)胞對(duì)固醇耗竭的反應(yīng)、巖藻糖基化等。

討 論

tsRNA作為新興的非編碼RNA，其異常表達(dá)已在多種疾病中得到證實(shí)，并通過(guò)調(diào)節(jié)生物過(guò)程和基因表達(dá)發(fā)揮重要作用[8]。本研究通過(guò)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)ERS能夠?qū)е?.2%的肝細(xì)胞tsRNA顯著上調(diào)，而14.5% tsRNA顯著下調(diào)。在高度差異表達(dá)(倍數(shù)變化>3)的tsRNA中，上調(diào)和下調(diào)tsRNA的數(shù)量分別為 2條和11條，提示ERS主要抑制肝細(xì)胞tsRNA的表達(dá)。業(yè)已證實(shí)，tsRNA具有與miRNA相似的功能，可能與特定靶基因的mRNA結(jié)合并使其直接降解或抑制其轉(zhuǎn)錄后翻譯，提示tsRNA可通過(guò)類miRNA樣作用調(diào)控下游靶基因，進(jìn)而發(fā)揮生物學(xué)功能[9]。

表1 肝細(xì)胞ERS相關(guān)差異tsRNA靶基因的GO功能分析

筆者聯(lián)合使用基于TargetScan和miRanda的預(yù)測(cè)工具來(lái)預(yù)測(cè)ERS相關(guān)差異tsRNA的靶基因。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，上調(diào)tsRNA的靶基因顯著富集于抗壞血酸和藻酸鹽代謝、淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化等碳水化合物代謝途徑。目前研究表明，酒精性脂肪性肝病可導(dǎo)致淀粉和蔗糖代謝、戊糖和葡萄糖醛酸酯相互轉(zhuǎn)化等糖代謝通路發(fā)生顯著改變[10]。Zhong等[6]研究發(fā)現(xiàn)，以Gly-tRF為代表的tsRNA參與了補(bǔ)體C3激活所致的肝脂肪變性。因此，筆者推測(cè)肝細(xì)胞在ERS條件下可通過(guò)上調(diào)tsRNA表達(dá)，抑制糖代謝相關(guān)基因的表達(dá)。

此外，下調(diào)tsRNA的靶基因顯著富集于Rap1及Ras信號(hào)通路，表明ERS誘導(dǎo)的tsRNA下調(diào)可能增強(qiáng)Rap1及Ras信號(hào)通路活性。Rap1是Ras超家族的一個(gè)小G蛋白，參與細(xì)胞黏附和運(yùn)動(dòng)、細(xì)胞增殖、血管生成和細(xì)胞骨架重塑等多種生理過(guò)程[11]。在Ras信號(hào)通路中，Ras參與細(xì)胞增殖、分化和細(xì)胞周期等細(xì)胞過(guò)程的調(diào)控[12]。兩者可能通過(guò)影響細(xì)胞骨架，參與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)換(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)[13]。EMT則與細(xì)胞代謝重編程密切相關(guān)，可能導(dǎo)致糖酵解增強(qiáng)，脂肪生成增強(qiáng)和分解下降，從而系統(tǒng)影響肝細(xì)胞的代謝表型[14,15]。

在GO功能分析中，筆者發(fā)現(xiàn)上調(diào)的tsRNA靶基因主要涉及類黃酮代謝過(guò)程、葡萄糖醛酸代謝過(guò)程及糖醛酸代謝過(guò)程。多種類黃酮均具有對(duì)抗細(xì)胞氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用。Zheng等[16]研究發(fā)現(xiàn)，黃芩苷可通過(guò)抑制ERS和TXNIP/NLRP3炎性體的激活，保護(hù)AML12細(xì)胞免于PA誘導(dǎo)的脂毒性損傷。結(jié)合筆者的研究結(jié)果，提示tsRNA表達(dá)上調(diào)可能通過(guò)抑制類黃酮代謝功能加劇ERS介導(dǎo)的細(xì)胞損傷。另外，糖醛酸途徑的中間產(chǎn)物——尿苷二磷酸葡糖醛酸是重要的解毒物質(zhì)，并在肝內(nèi)生物轉(zhuǎn)化過(guò)程參與多種結(jié)合反應(yīng)。上調(diào)的tsRNA可能抑制葡萄糖醛酸代謝及糖醛酸代謝等肝臟生物轉(zhuǎn)化過(guò)程，影響肝臟解毒功能，從而導(dǎo)致肝細(xì)胞受損。

在下調(diào)tsRNA的靶基因功能分析中，筆者發(fā)現(xiàn)靶基因主要涉及巖藻糖基化過(guò)程。巖藻糖基化是肝病中最常見(jiàn)的聚糖改變之一，有研究證實(shí)IgG的巖藻糖基化水平與NAFLD呈正相關(guān)，并且?guī)r藻糖基化與細(xì)胞EMT過(guò)程密切相關(guān)[17，18]。這些研究結(jié)果提示，ERS介導(dǎo)的tsRNA下調(diào)可能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞巖藻糖基化過(guò)程參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，脂肪酸刺激誘導(dǎo)的ERS可顯著改變肝細(xì)胞tsRNA表達(dá)譜。差異表達(dá)的tsRNA通過(guò)調(diào)控與碳水化合物代謝、EMT相關(guān)的信號(hào)通路，可能影響肝細(xì)胞的糖代謝、氧化應(yīng)激和生物轉(zhuǎn)化等功能。這些發(fā)現(xiàn)提出了一種肝細(xì)胞ERS參與NAFLD的新型病理生理機(jī)制，有望為NAFLD的診斷和治療提供全新思路。但tsRNA的確切作用仍有待更深入的體內(nèi)外研究加以闡釋。