AAV-DJ病毒對H9C2細胞感染效果的研究

章晶晶 鐘 鵬 孔 彬 黃 鶴

外源基因轉(zhuǎn)入真核細胞即通常所說的細胞轉(zhuǎn)染技術，是研究基因表達調(diào)控及基因治療的有效技術之一，目前可通過磷酸鈣沉淀法、脂質(zhì)體介導法、電穿孔法、顯微注射法及病毒感染等實現(xiàn)[1～5]。而大鼠心肌細胞系 H9C2能穩(wěn)定傳代，有著骨骼肌的很多特性，是一種常用的心肌細胞模型[6]。隨著細胞轉(zhuǎn)染技術的廣泛應用，找到高效、無毒轉(zhuǎn)染 H9C2 細胞的方法將為心血管疾病治療提供更多思路。其中病毒感染是一種應用廣泛的策略，其具有操作簡便、宿主范圍廣且可以高效感染細胞等特點。而腺相關病毒(AAV)是迄今為止最安全、最良好、最有前景的基因治療工具，AAV-DJ病毒是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種由AAV2型、8型、9型組成的嵌合體，是通過改組8種不同的野生型病毒而產(chǎn)生的。已有報道顯示，AAV-DJ病毒對多種組織和細胞的感染效率遠高于原生AAV血清型[7]。因其具有廣泛的侵噬性，可以高效地感染多種細胞，而被廣泛地用于基因轉(zhuǎn)導。然而，AAV-DJ病毒對心臟感染的研究卻少有報道，到目前為止，僅有1例研究報道AAV-DJ病毒對心肌梗死后小鼠的心臟具有感染效能[8]。所以，筆者想探究AAV-DJ病毒對心肌細胞的感染能力，從而尋找出一種可以安全高效地感染心臟的病毒載體。

材料與方法

1.材料：質(zhì)粒載體包括pAAV-MCS、pcDNA3.1-EGFP、pHelper、pAAV-DJ、pAAV-RC9均購自武漢淼靈生物科技有限公司。EcoRⅠ和XbaⅠ限制酶購自美國NEB公司。T4 DNA連接酶和凝膠純化試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司。DH5α感受態(tài)細胞獲自上海威迪生物技術有限公司。

2.細胞培養(yǎng)：H9C2細胞和HEK293T細胞獲自上海生物化學與細胞生物學研究所。將H9C2細胞培養(yǎng)在含10%FBS，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中。將HEK293T細胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清，100U/ml青霉素和100mg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)中。將所有細胞置于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.腺相關病毒的生產(chǎn)和純化：AAV的生產(chǎn)和純化參考文獻[9]進行。簡而言之，為了產(chǎn)生AAV，將HEK293T細胞接種在10個15cm2的培養(yǎng)皿中。當融合度達到95%時，將pAAV-EGFP、pHelper、pAAV-DJ 3種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染到 HEK293T 細胞中(使用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑, 每種質(zhì)粒的摩爾量按照1∶1∶1比例加入, 每15cm2的培養(yǎng)皿中共轉(zhuǎn)入40μg質(zhì)粒,質(zhì)粒和PEI按照 1μg∶4μg 的比例加入)，轉(zhuǎn)染3天后，收集細胞和細胞上清液并離心以分離細胞沉淀物和上清液，兩者均含有AAV。含有AAV的細胞上清液可直接用于隨后的定性實驗，以測試AAV在體外培養(yǎng)的心肌細胞的轉(zhuǎn)導效率。至于定量實驗，將細胞沉淀物收集在300μl PBS中，然后進行5次凍融循環(huán)，在液氮和37℃水浴鍋中進行凍融循環(huán)。最后，以18000×g的離心力除去細胞碎片，合并含AAV的上清液和細胞培養(yǎng)上清液，然后進行PEG 8000沉淀和不連續(xù)的碘克沙醇梯度超速離心。

4.細胞感染：按不同的感染復數(shù)(multiplicity of infection，MOI) 把細胞分為6 組:MOI= 0微克/細胞的細胞組(對照組)，即未轉(zhuǎn)染病毒組;MOI=100微克/細胞的細胞組; MOI=200微克/細胞的細胞組; MOI=400微克/細胞的細胞組; MOI =1×103微克/細胞的細胞組；MOI =1×104微克/細胞的細胞組。將細胞置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中，24h 后，在原有液體的基礎上繼續(xù)加入適量FBS 及DMEM/F12培養(yǎng)基，使FBS 終濃度達到10%。

5.熒光顯微鏡采圖：培養(yǎng)24h后，開始用熒光顯微鏡觀察，MOI=0微克/細胞作為對照組，于轉(zhuǎn)染后第1、2、3、4、5、6 和7天進行細胞形態(tài)和生長的觀察，以波長為490nm 的藍色光激發(fā)出綠色熒光的H9C2 細胞為陽性細胞，按一個隨機高倍視野下計數(shù)200 個細胞中陽性細胞的個數(shù)計算出平均百分率(重復3 次)，并照相記錄。

6.細胞明場照片及CCK-8法檢測評價細胞活性：培養(yǎng)24h后，用普通顯微鏡對6組不同MOI的H9C2細胞進行拍照以觀察AAV-DJ病毒對細胞生長情況的影響。并參考已發(fā)表的文獻，使用CCK-8細胞計數(shù)試劑盒(日本Dojindo Laboratories公司)測量細胞的存活率[10]。簡而言之，將細胞以2×104個/孔的密度接種在96孔板中，在處理期結(jié)束時，將10μl WST-8溶液添加到細胞中，并將細胞在37℃下孵育3h，通過美國的Bio- Rad酶標儀測量450nm處的吸光度來定量細胞增殖。

結(jié) 果

1.AAV-DJ病毒可有效感染心肌H9C2細胞：筆者首先構(gòu)建pAAV-EGFP作為病毒載體。為了構(gòu)建pAAV-EGFP載體，筆者用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性內(nèi)切酶從pcDNA3.1-EGFP載體中分離出EGFP cDNA片段。同時，用相同的限制酶組合消化pAAV-MCS載體(圖1A)。然后，通過瓊脂糖凝膠電泳純化所需片段(圖1B)。接著將純化的EGFP片段和pAAV-MCS骨架通過T4連接酶連接，并在化學感受態(tài)DH5α細胞中轉(zhuǎn)化回收，最后在帶有氨芐青霉素的瓊脂板上劃線(圖1C)。其中，EGFP的表達由組成型啟動子CMV啟動表達。

筆者嘗試通過如前所述的三重轉(zhuǎn)染方法制備AAV-DJ-EGFP病毒。筆者混合了pAAV-EGFP、pHelper和pAAV-DJ載體，并利用PEI作為轉(zhuǎn)染試劑(圖1D)，然后將混合后的質(zhì)粒加到HEK293T細胞的培養(yǎng)基中。由于AAV可以自行分泌到培養(yǎng)基中，因此于第3天收集上清液，更換細胞培養(yǎng)基，并于第6天再次收集上清液。在第3天和第6天觀察細胞的熒光強度(圖1E)。最后，將含有AAV-DJ-EGFP的細胞上清液通過0.2μm過濾器過濾，以除去細胞碎片，最終將病毒上清液用于以下實驗。

筆者嘗試定性檢測AAV-DJ病毒對H9C2細胞的感染效率。將含有AAV-DJ-EGFP的病毒上清液加到H9C2細胞的培養(yǎng)基中。在AAV-DJ-EGFP感染后的不同時間點，通過熒光顯微鏡觀察H9C2細胞的熒光強度。如圖1F和1G所示，筆者發(fā)現(xiàn)H9C2細胞的熒光強度以時間依賴性方式增加。這些結(jié)果證明了AAV-DJ-EGFP病毒對H9C2細胞有較強的感染效率。

2.熒光強度檢測評價AAV-DJ病毒對H9C2細胞的感染效率的定量實驗：為了進一步定量確定AAV-DJ病毒對H9C2細胞的基因轉(zhuǎn)導效率，利用純化的明確病毒效價的AAV-DJ-EGFP病毒以不同MOI分別感染H9C2細胞，然后在感染病毒后的第1、2、3、4、5、6、7天連續(xù)觀察細胞熒光強度。如圖2所示，AAV-DJ-EGFP感染H9C2細胞后熒光細胞所占的百分比以劑量依賴性和時間依賴性方式逐漸增加。

圖2 AAV-DJ-EGFP病毒對H9C2細胞感染效率評估的定量實驗 A.顯示將具有相同啟動子及綠色熒光蛋白基因的AAV9-EGFP和AAV-DJ-EGFP病毒分別加入H9C2細胞的示意圖；B.顯示用不同MOI的AAV-DJ-EGFP病毒分別感染H9C2細胞，然后分別在感染病毒后的第1、2、3、4、 5、6、7天觀察細胞熒光(×10)，并顯示了熒光細胞百分比的統(tǒng)計數(shù)據(jù)

3.AAV-DJ病毒與AAV9病毒對H9C2細胞的感染效率的比較：為了明確AAV-DJ病毒對H9C2細胞的感染效率是否比AAV9病毒的強，筆者用相同MOI的AAV-DJ病毒與AAV9病毒分別去感染H9C2細胞。發(fā)現(xiàn)當MOI分別為100～10000微克/細胞時，AAV9-EGFP所感染的細胞中沒有明顯的熒光細胞，而AAV-DJ-EGFP所感染的細胞中熒光細胞所占的百分比以劑量依賴性和時間依賴性方式遞增(圖3)。

圖3 AAV-DJ與AAV9病毒對H9C2細胞感染效率的比較(×10) A.AAV-DJ；B.AAV9

4.細胞明場照片及CCK-8檢測評價AAV-DJ病毒對H9C2細胞活性的影響：筆者通過拍攝細胞明場照片及CCK-8試劑盒分析明確了AAV-DJ病毒感染H9C2細胞后對其細胞活性的影響。如圖4所示，以不同MOI的AAV-DJ病毒分別感染H9C2細胞24h后，其細胞生長狀況及細胞活性均沒有明顯變化。

圖4 AAV-DJ病毒對H9C2細胞活性的影響 A.細胞明場照片(×10)；B.CCK8檢測

討 論

目前，基因治療是一個正在飛速發(fā)展的學科，其通過病毒載體將正常基因?qū)氲饺毕萁M織中，以替代或補償缺陷基因的功能，達到治療遺傳性或獲得性疾病的目的。因此，基因治療相關的病毒載體也受到廣泛關注，主要包括慢病毒、腺病毒、腺相關病毒以及非病毒載體，各有其優(yōu)缺點。其中，腺相關病毒載體因其較高的生物安全級別、低免疫原性、宿主范圍廣泛且穩(wěn)定表達等獨特優(yōu)勢成為目前應用最為廣泛的基因治療載體[11]。而良好的病毒載體系統(tǒng)必須具備3個要素: 安全性、轉(zhuǎn)導高效性和相對特異性[12]。慢病毒生物安全性較低，腺病毒難以形成細胞內(nèi)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，且表達持續(xù)時間短，而腺相關病毒安全性最高(RK1級別)，目前無報道其參與任何疾病的發(fā)生，且腺相關病毒感染宿主范圍廣，相對特異性高，免疫原性和宿主炎性反應極低，表達時程長(可穩(wěn)定表達半年以上)。迄今為止，已經(jīng)找到來自人類的13 種血清型的腺相關病毒，主要區(qū)別在于其衣殼蛋白Cap不同，對不同的組織和細胞有不同的感染效率[13]。

AAV-DJ病毒是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種具有廣泛侵噬性的嵌合體病毒，對多種器官具有高轉(zhuǎn)導效率及低免疫原性，同時，可防止胞內(nèi)降解并促進轉(zhuǎn)基因表達。已有不少研究報道其可以安全高效地感染多種細胞，如AAV-DJ載體可用于敲除豬成纖維細胞的基因，其靶向性遠高于其他野生型腺相關病毒[14]。AAV-DJ對人類角質(zhì)細胞的轉(zhuǎn)導效率遠大于其他血清型[15]。AAV-DJ載體可以把目的基因轉(zhuǎn)導到光感受器層，其對視網(wǎng)膜內(nèi)的多種細胞具有高感染效率，尤其是視網(wǎng)膜內(nèi)的米勒細胞，且對視網(wǎng)膜功能并無影響[16]。此前，還未曾有研究將目的基因成功地轉(zhuǎn)導到小鼠的味覺細胞，直到將AAV-DJ作為一種病毒載體將EGFP成功地轉(zhuǎn)導到小鼠的味覺細胞，并且小鼠未產(chǎn)生免疫反應[17]。最近，Wei等[18]以AAV-DJ為載體成功介導了靶基因的上調(diào)與下調(diào)，從而實現(xiàn)了膽管上皮細胞向肝細胞的分化?；贏AV-DJ病毒的特性并成功地應用于其他類型細胞的感染及基因轉(zhuǎn)導，筆者研究了其在心血管領域的應用。

筆者證實，AAV-DJ病毒對H9C2細胞有很強的感染特性，其感染效率與時間及病毒效價呈正相關，且該病毒對H9C2細胞沒有明顯的細胞毒性。慢病毒屬于反轉(zhuǎn)錄病毒，能與宿主細胞的染色體隨機整合并對轉(zhuǎn)錄沉默作用有一定的抵抗力，從而可以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系并持續(xù)高表達水平，然而，也正是由于該特點使慢病毒的生物安全性明顯降低，造成致瘤致突變的風險，同時，慢病毒還具有明顯的細胞毒性[19]。相對于慢病毒，AAV-DJ 病毒的生物安全性明顯提升，幾乎不會產(chǎn)生致瘤致突變的風險，另外，筆者也證實了AAV-DJ 病毒對H9C2細胞的活性無明顯影響。AAV-DJ 病毒能安全有效地介導綠色熒光蛋白基因的表達，這為AAV-DJ 病毒轉(zhuǎn)導其他治療基因提供了一定的基礎，為心臟疾病的基因治療提供一個可行的研究模式。

本研究就AAV-DJ病毒對H9C2細胞的感染特性進行了定性驗證及一定程度的定量驗證，有待于進一步的定量實驗驗證AAV-DJ病毒的該特性，且本研究局限于體外細胞實驗，未在動物層面上進行驗證，這些也為下一步的實驗提供了思路。

綜上所述，AAV-DJ病毒是一種新型的且具有廣闊前景的基因治療載體，隨著對其研究的深入會為心血管疾病方面的基因治療和再生醫(yī)學領域帶來突破性進展。