谷子MRP蛋白家族序列特征、分子進(jìn)化及表達(dá)模式分析

高豪 滿夏夏 孫朝霞 韓淵懷 李紅英 侯思宇 郭數(shù)進(jìn)

摘要：本研究旨在深入了解谷子葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)家族成員的基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式，為谷子體內(nèi)葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。使用Phytozome、Clustal X、MEGA7.0等在線工具和軟件，對(duì)谷子MRP家族成員進(jìn)行生物信息學(xué)分析；基于谷子谷穗有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，分析谷子MRP家族成員表達(dá)模式。結(jié)果顯示，谷子MRP蛋白家族成員共21個(gè)，在7號(hào)染色體分布最多，有8個(gè)基因；17個(gè)谷子MRP蛋白偏堿性和4個(gè)偏酸性，根據(jù)疏水值判斷其均為親水性蛋白；成員SiMRP7、SiMRP12基因的表達(dá)量與谷子組織中的總?cè)~酸含量表現(xiàn)出協(xié)同降低的趨勢(shì)，推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能對(duì)谷子葉酸的積累起到調(diào)控作用。本研究有助于進(jìn)一步鑒定葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)蛋白，為后續(xù)研究葉酸代謝途徑及谷子基因挖掘提供了理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：谷子；MRP蛋白家族；谷子葉酸；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式

中圖分類號(hào)：S515文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號(hào)：cjas2020-0059

MRP Protein Family of Foxtail Millet： Analysis of Sequence Characteristics， Molecular Evolution and Expression Pattern

Gao Hao， Man Xiaxia， Sun Zhaoxia， Han Yuanhuai， Li Hongying， Hou Siyu， Guo Shujin

（College of Agriculture， Shanxi Agricultural University， Taigu 030801， Shanxi， China）

Abstract： The aims are to study the gene structure and expression patterns of folate transport family members， and establish the foundation for exploring the molecular mechanism of folate transport in foxtail millet. Bioinformatics analysis of MRP family members was carried out with Phytozome， Clustal X， MEGA7.0 and other online tools and software. Based on the transcriptome sequencing data of foxtail millet， the expression patterns of foxtail millet MRP family members were analyzed. The results show that there are 21 foxtail millet MRP protein family members， most of which are distributed on chromosome 7， with 8 genes； 17 MRP proteins are alkaline and 4 proteins are acidic， and they are all hydrophilic proteins according to the hydrophobic value. The expression of SiMRP7 and SiMRP12 genes and the total folate content in foxtail millet tissue have a synergistic decrease trend， and these two proteins might play a regulatory role in the accumulation in foxtail millet. This study further identifies folate transport-related proteins， and could provide a theoretical basis for future research on folate metabolism pathway and gene mining.

Keywords： Foxtail Millet； MRP Protein Family； Folate of Foxtail Millet； Bioinformatics Analysis； Expression Pattern

0引言

谷子（Setaria italic）為禾本科植物，籽粒脫殼后被稱為小米，產(chǎn)于中國北方地區(qū)[1]。作為農(nóng)耕文明的一部分，曾是中國北方人民主要的糧食作物，在某種程度上決定了先民們的生產(chǎn)與生活方式[2]。隨著生活水平的提高，人們開始追求健康和營養(yǎng)均衡的飲食，小米的營養(yǎng)保健和食療價(jià)值都非常高，可以充分滿足消費(fèi)者對(duì)食品營養(yǎng)的需求。葉酸存在于各種動(dòng)物性食品、糧食作物和綠色蔬菜中[3]，是生物體內(nèi)不可缺少的有機(jī)物質(zhì)[4-5]，也是食物成分表中有待補(bǔ)充的重要營養(yǎng)成分之一[6-7]，人體不能自身合成葉酸，只有從膳食中攝取，糧食和蔬菜是人類葉酸的主要來源[8-9]。葉酸還具有補(bǔ)血，促進(jìn)嬰幼兒大腦的發(fā)育等功能，缺乏葉酸會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)衰弱、貧血、癌癥等多種疾病[10-12]。

目前，全世界都廣泛存在葉酸缺乏問題，中國也面臨著嚴(yán)重的葉酸缺乏問題。據(jù)上海市閔行區(qū)婦幼保健院孕前門診在備孕夫妻中進(jìn)行的橫斷面調(diào)查，結(jié)果顯示，總體人群膳食葉酸平均水平為296.3μg/d，男性為327.3μg/d，女性為267.2μg/d，低于成人400μg/d的推薦攝入量[13]。侯思宇等[14]建立了一種高效測(cè)定谷子籽粒葉酸的HPLC方法，同時(shí)測(cè)定了45份種質(zhì)的葉酸含量，其平均葉酸含量最高達(dá)1.84μg/g，含量最高的種質(zhì)的葉酸含量達(dá)到了2.86μg/g。邵麗華[15]測(cè)定了山西281份谷子種質(zhì)資源的小米和36種主要糧食作物、常見水果和蔬菜的總?cè)~酸含量，發(fā)現(xiàn)小米葉酸含量在糧食和蔬菜作物中屬于較高水平，只略低于新鮮水果。

MRP蛋白（Multidrug resistance-associated protein）家族是跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白超家族ABC家族的成員之一，其轉(zhuǎn)運(yùn)底物包括多糖、多肽、重金屬螯合物、生物堿和藥物等[16]。研究表明，玉米bronze-2 （bz2）突變體由于缺失bz2基因編碼的一種谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶，導(dǎo)致花色素苷不能在液泡中積累。因谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶對(duì)MRP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合底物的活性有很重要影響，推測(cè)在玉米bz-2突變體中，MRP型ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白很可能參與花色素苷轉(zhuǎn)運(yùn)過程[17]。ZmMrp3是從玉米中克隆的一個(gè)編碼ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，定位在液泡膜上，是花色素苷轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中積累所必須的，而ZmMrp4轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白也參與了花色素苷的積累過程，但在糊粉層組織大量表達(dá)[18]。王璐[19]以瓜葉菊藍(lán)色、洋紅色、黃色、粉色、白色5個(gè)色系植株為試驗(yàn)材料，利用RT-PCR技術(shù)分析瓜葉菊MRP亞家族14個(gè)不同成員在舌狀花發(fā)育最初的2個(gè)階段的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)ScMRP1在不含花青素苷的黃色、白色系瓜葉菊中低表達(dá)，而在含有花青素苷的藍(lán)色、洋紅色、粉色系瓜葉菊中高表達(dá)，推測(cè)ScMRP1可能與瓜葉菊花青素苷轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。Garza等[20- 21]和Storozhenko等[22]發(fā)現(xiàn)，AtMRP1參與四氫葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過程，在葉酸生物合成中起重要作用。

小米與其他大宗糧食比較，不僅營養(yǎng)豐富全面，而且具有特殊的醫(yī)療保健功能，所以深受國民尤其是中老年人的喜愛，更是產(chǎn)婦補(bǔ)身催乳的必備食品[23]。隨著生活水平和習(xí)慣的變化，人們對(duì)健康飲食的需求越來越高，小米是優(yōu)秀的營養(yǎng)保健和食療食品，富含葉酸等營養(yǎng)物質(zhì)，可以滿足消費(fèi)者均衡營養(yǎng)的需求。因全世界普遍存在的葉酸缺乏問題，葉酸的生物強(qiáng)化已成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)，然而當(dāng)前關(guān)于谷子富集葉酸的分子機(jī)制尚不清楚，尤其是葉酸代謝途徑的關(guān)鍵基因的序列特征和表達(dá)模式尚無人報(bào)道。本研究利用生物信息學(xué)相關(guān)技術(shù)鑒定谷子的MRP基因家族并對(duì)該家族的序列特征、分子進(jìn)化及表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期為谷子葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因的研究和作物的葉酸生物強(qiáng)化研究提供一定的參考。

1材料與方法

1.1谷子MRP家族成員的序列提取及理化性質(zhì)分析

在Pfam網(wǎng)站（http：//pfam.xfam.org/）中查找MRP家族的保守域序列號(hào)（PF00005，PF00664）。在Phytozome網(wǎng)站（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）下載基因位置信息。使用ProtParam網(wǎng)站（https：//web. expasy.org/protparam/）計(jì)算氨基酸理化參數(shù)。

1.2谷子MRP家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建

使用Clustal X進(jìn)行序列比對(duì)，在TAIR網(wǎng)站（https：//www.arabidopsis.org/index.jsp）下載擬南芥（Arabidopsis thaliana）MRP蛋白序列；在RGAP數(shù)據(jù)庫（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）下載水稻（Oryza sativa）MRP蛋白序列；在MEGA7.0中使用鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）構(gòu)建谷子、擬南芥和水稻的系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.3谷子MRP家族的蛋白質(zhì)保守序列

利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org/）對(duì)谷子的MRP家族蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析，基序長(zhǎng)度范圍設(shè)為10～50個(gè)，基序最大發(fā)現(xiàn)數(shù)目設(shè)為10個(gè)，其他設(shè)為默認(rèn)值。

1.4谷子MRP家族的蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)

使用SOPMA網(wǎng)站（https：//npsa- prabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，SWISS-MODLE服務(wù)器（https：// swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)。

1.5谷子MRP家族成員表達(dá)模式分析

對(duì)谷子S1、S3、S5時(shí)期的穗部組織樣品進(jìn)行有參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，結(jié)合谷子S1、S3、S5時(shí)期的穗部組織總?cè)~酸含量，根據(jù)谷子MRP家族成員在各時(shí)期的表達(dá)量，對(duì)谷子MRP家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析。

2結(jié)果與分析

2.1谷子MRP家族基因信息及理化性分析

鑒定出21個(gè)谷子MRP家族的基因，根據(jù)基因在染色體上的位置分布，按順序?qū)蜻M(jìn)行了命名，為SiMRP1-SiMRP21（表1）?；蛐蛄虚L(zhǎng)度范圍在4413（SiMRP6）～17930（SiMRP10），蛋白序列長(zhǎng)度范圍在635（SiMRP5）～1609（SiMRP10）。其中氨基酸數(shù)目大于1300和小于1300的蛋白數(shù)目各為11個(gè)和10個(gè)，除了編碼氨基酸數(shù)目最小的SiMRP5，其余MRP氨基酸數(shù)目跨度較小。對(duì)MRP蛋白理論等電點(diǎn)進(jìn)行分析，結(jié)果表明，其中SiMRP14編碼蛋白的等電點(diǎn)最小，為5.38，表現(xiàn)為酸性；SiMRP7編碼蛋白的等電點(diǎn)最大，為9.32，表現(xiàn)為堿性。表現(xiàn)為堿性的蛋白有17個(gè)，表現(xiàn)為酸性的蛋白有4個(gè)，說明谷子MRP蛋白含有較多的堿性氨基酸和較少的酸性氨基酸。

對(duì)MRP蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果表明， 21個(gè)蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)介于35.65～45.28，其中不穩(wěn)定系數(shù)大于40的蛋白數(shù)目為9個(gè)，小于40的蛋白數(shù)目為12個(gè)，表現(xiàn)為不穩(wěn)定蛋白的數(shù)目超過百分之五十。氨基酸的疏水性數(shù)值介于0.026～0.276，均為正值，表明谷子MRP蛋白均表現(xiàn)為親水性（表1）。

MRP家族基因分別位于7條染色體上。其中有8個(gè)基因分布在7號(hào)染色體（Chr7），數(shù)目最多，其次是Chr1，有7個(gè)基因分布其上。剩余基因分布在其他6條染色體上（圖1）。

2.2谷子MRP家族蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

為了研究谷子MRP基因家族蛋白之間的親緣關(guān)系，使用鄰接法對(duì)谷子與擬南芥、水稻，3個(gè)物種共52個(gè)MRP蛋白序列進(jìn)行分析，構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。根據(jù)谷子MRP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹的分支情況，可以將谷子MRP蛋白成員分為兩個(gè)進(jìn)化分支，即ClassⅠ和ClassⅡ。進(jìn)化樹顯示2個(gè)分支之間的蛋白質(zhì)數(shù)量差距不大，其中ClassⅠ包含11個(gè)蛋白，成員為SiMRP1、SiMRP2、SiMRP3、SiMRP4、SiMRP5、SiMRP6、SiMRP7、SiMRP8、SiMRP12、SiMRP18、SiMRP20；ClassⅡ包含10個(gè)蛋白，分別為SiMRP9、SiMRP10、SiMRP11、SiMRP13、SiMRP14、SiMRP15、SiMRP16、SiMRP17、SiMRP19、SiMRP21。所有擬南芥和水稻MRP家族成員都聚類到了ClassⅡ中。從進(jìn)化樹的聚類分析可見，蛋白結(jié)構(gòu)域相似的以及同源度高的蛋白聚在一起，如SiMRP1和SiMRP2，SiMRP16和SiMRP17，SiMRP18和SiMRP20，SiMRP21和OsMRP13，SiMRP11和OsMRP2聚類到了一起，通過蛋白序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)SiMRP1和SiMRP2的同源性為82.51%，SiMRP16和SiMRP17的同源性為96.87%，SiMRP18和SiMRP20的同源性為86.73%，推測(cè)它們有較相似的功能。

2.3谷子MRP家族蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域及保守基序分析

利用MEME對(duì)谷子的MRP家族21個(gè)蛋白質(zhì)保守基序進(jìn)行分析，結(jié)果表明，在MRP家族蛋白中，一共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)保守基序（motif）（圖3）。其中，SiMRP1、SiMRP2、SiMRP3具有完全相同的motif排列，SiMRP19、SiMRP20具有完全相同的motif排列，SiMRP16、SiMRP17具有完全相同的motif排列；有15個(gè)MRP蛋白的最后4個(gè)motif排列順序是相同的，順序?yàn)閙otif 10、motif 2、motif 3、motif 6；除了SiMRP5，所有成員的蛋白保守序列的倒數(shù)第3、4個(gè)motif都為motif 10、motif 2，這兩個(gè)motif的排列順序是固定不變的；圖中顯示這10個(gè)保守基序的氨基酸序列（圖4）。

2.4谷子MRP家族蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)分析

利用SOPMA對(duì)谷子MRP家族的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)包括無規(guī)則卷曲，延伸鏈，α螺旋，β折疊。谷子MRP家族在這4項(xiàng)中差別不大（表2），α螺旋最大為55.70%，最小為47.36%；延伸鏈最大為17.34%，最小為13.86%；β折疊最大為9.92%，最小為4.30%；無規(guī)則卷曲最大為30.82%，最小為 22.36%。根據(jù)MRP家族系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果，選擇SiMRP1、SiMRP2、SiMRP8三個(gè)成員繪制蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)圖，蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5）不但在某些方面上決定了蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，而且對(duì)蛋白質(zhì)功能的預(yù)測(cè)有一定的幫助。

SiMRP1的α螺旋為52.33%，β折疊為5.71%，延伸鏈為17.20%和無規(guī)則卷曲為24.76%；SiMRP2的α螺旋為50.56%，β折疊為6.00%，延伸鏈為17.04%和無規(guī)則卷曲為26.40%；SiMRP8的α螺旋為50.28%，β折疊為6.04%，延伸鏈為17.24%和無規(guī)則卷曲為26.45%。這3個(gè)蛋白質(zhì)的α螺旋，β折疊，延伸鏈和無規(guī)則卷曲的數(shù)值相差不大，蛋白的三維結(jié)構(gòu)有一些的差別（圖6）。

2.5谷子MRP家族成員表達(dá)模式分析

為進(jìn)一步了解MRP家族成員的特性和功能作用，對(duì)其組織特異表達(dá)情況進(jìn)行分析。所有的成員在谷子的S1、S3、S5時(shí)期組織中均有表達(dá)，SiMRP2在S1時(shí)期表達(dá)量最低，fpkm值為0.014，SiMRP10在S1時(shí)期表達(dá)量最高，fpkm值為46.013，SiMRP3在S3時(shí)期表達(dá)量最低，fpkm值為0.021，SiMRP21在S3時(shí)期表達(dá)量最高，fpkm值為38.654，SiMRP3在S5時(shí)期表達(dá)量最低，fpkm值為0.017，SiMRP21在S5時(shí)期表達(dá)量最低，fpkm值為33.164（圖7）。其中SiMRP7、SiMRP9、SiMRP10、SiMRP12、SiMRP13、SiMRP18、SiMRP19、SiMRP20和SiMRP21在每個(gè)時(shí)期的表達(dá)量都很高，暗示著這9個(gè)基因有可能發(fā)揮多方面作用。不同的基因在不同時(shí)期表達(dá)量差異很大，如SiMRP7在S1時(shí)期的表達(dá)值是其在S5時(shí)期的2.42倍，SiMRP12在S1時(shí)期的表達(dá)值是其在S5時(shí)期的3.55倍，SiMRP10在谷子S1時(shí)期表達(dá)值最高，SiMRP21在S3、S5時(shí)期表達(dá)值都最高。結(jié)合谷子S1、S3、S5時(shí)期的谷子穗部組織總?cè)~酸含量（圖8），發(fā)現(xiàn)SiMRP7、SiMRP12基因的表達(dá)量與谷子組織中的總?cè)~酸含量表現(xiàn)出協(xié)同降低的趨勢(shì)，其基因在谷子不同時(shí)期的表達(dá)差異及功能機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

3討論與結(jié)論

谷子在中國具有長(zhǎng)久的種植歷史，是中國人民的傳統(tǒng)糧食作物，在古代，它曾被作為中國北方主要糧食作物來種植，是中國北方人民喜愛的食物。隨著社會(huì)的發(fā)展，谷子由于它豐富的營養(yǎng)、獨(dú)特的風(fēng)味，正日漸成為全國人民都喜愛的健康食物。谷子籽粒脫皮后被成為小米，其富含豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括多種維生素、蛋白質(zhì)、脂肪、糖類及鈣、磷、鐵等人體所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)還具有一定的藥用價(jià)值[24]。因谷子營養(yǎng)豐富，尤其富含葉酸，所以對(duì)谷子營養(yǎng)成分的富集機(jī)制的研究逐漸引起科學(xué)家的注意，谷子葉酸富集機(jī)制的探究更是成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)。

目前谷子MRP蛋白家族的鑒定和系統(tǒng)分析尚未見報(bào)道，本研究對(duì)谷子MRP蛋白家族進(jìn)行鑒定，并進(jìn)行了一系列生物信息學(xué)分析。得到谷子的MRP家族一共有21個(gè)成員，并對(duì)該族蛋白序列進(jìn)行了基序分析，發(fā)現(xiàn)谷子MRP蛋白家族具有保守性較高的特點(diǎn)。其一級(jí)結(jié)構(gòu)之間和二級(jí)結(jié)構(gòu)之間較為相似，三級(jí)結(jié)構(gòu)之間的差異說明在進(jìn)化的過程中這些蛋白序列發(fā)生了功能上的差異。谷子中親緣關(guān)系較近的MRP蛋白一般具有相似的基因結(jié)構(gòu)和蛋白結(jié)構(gòu)域，如SiMRP18和SiMRP20蛋白的親緣關(guān)系很近，其蛋白結(jié)構(gòu)域也很相似，推測(cè)這對(duì)MRP基因很有可能來源于同一祖先基因，是基因復(fù)制的結(jié)果。SiMRP21和OsMRP13，SiMRP11和OsMRP2聚類到了一起，推斷它們可能具有較高的同源性和較為相似的功能。在21個(gè)成員中共發(fā)現(xiàn)的10個(gè)保守基序，其中Motif 6和Motif 3非常相似，這可能會(huì)對(duì)結(jié)果造成一定的偏差。

研究表明，由MRP家族介導(dǎo)的氨甲喋呤（MTX）能通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制DHFR，阻斷二氫葉酸（FH2）合成四氫葉酸（FH4），導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)四氫葉酸不足[25- 26]。同時(shí)，AtMRP1也參與了到葉酸生物合成途徑中的四氫葉酸的轉(zhuǎn)運(yùn)過程中[20-22]，而SiMRP7、SiMRP12基因的表達(dá)量與谷子組織中的總?cè)~酸含量表現(xiàn)出協(xié)同降低的趨勢(shì)，推測(cè)這兩個(gè)蛋白可能對(duì)谷子葉酸的積累起到調(diào)控作用。由此可以推斷，谷子MRP蛋白家族很可能參與到了谷子葉酸的合成途徑中，它可能在谷子葉酸合成途徑中扮演了重要的角色。目前對(duì)MRP蛋白家族的研究主要集中在動(dòng)物、癌癥、藥物領(lǐng)域，在植物領(lǐng)域中的研究比較少見，與谷子葉酸的合成途徑的關(guān)系也未探明，因此本研究針對(duì)谷子MRP蛋白家族序列特征、分子進(jìn)化及表達(dá)模式的分析有助于進(jìn)一步探究谷子葉酸的合成途徑，為挖掘谷子葉酸調(diào)控相關(guān)基因資源提供理論依據(jù)，為后續(xù)分子育種奠定基礎(chǔ)。

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