基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索青鹽方治療圍絕經(jīng)期綜合征的配伍合理性研究

楊一博，徐 穎，王 璐，樊媛芳，林 娜

中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所，北京 100700

圍絕經(jīng)期綜合征是指婦女因卵巢功能衰竭而出現(xiàn)的一系列由雌激素水平下降引起的不適癥狀，如心悸失眠、血壓升高、月經(jīng)紊亂、煩躁易怒、失眠、骨質(zhì)疏松等，中醫(yī)稱之為“絕經(jīng)前后諸癥”，經(jīng)典補(bǔ)腎方劑在臨床上具有良好的治療效果[1]。青鹽方源于宋代《圣濟(jì)總錄》，由肉蓯蓉、巴戟天、牛膝、蜀椒、青鹽組成，5 味藥皆入腎經(jīng)，是補(bǔ)腎益精的經(jīng)典方劑。肉蓯蓉甘咸而溫，質(zhì)地滋膩，性柔而不燥，補(bǔ)腎壯陽(yáng)之中還兼有強(qiáng)陰潤(rùn)燥、益精之功，為君藥；巴戟天辛甘而溫，性偏燥而不柔，溫陽(yáng)助火力勝，兼有祛風(fēng)除濕之力，為臣藥；佐以牛膝、蜀椒（花椒），牛膝活血脈、補(bǔ)肝腎，既補(bǔ)且行能引藥入腎經(jīng)，花椒溫補(bǔ)脾陽(yáng)；青鹽為使藥，能引諸藥入腎經(jīng)，潤(rùn)燥潛降；諸藥通過(guò)調(diào)補(bǔ)腎氣陰陽(yáng)、潤(rùn)燥益精，以達(dá)防治絕經(jīng)前后諸癥之功。課題組前期研究表明，青鹽方70%乙醇提取物具有雌激素樣作用，可促進(jìn)未成熟小鼠生殖靶器官子宮、陰道的生長(zhǎng)發(fā)育；還可抑制去雙側(cè)卵巢大鼠生殖靶器官萎縮，緩解實(shí)驗(yàn)性圍絕經(jīng)期綜合征近期焦慮癥狀和遠(yuǎn)期骨質(zhì)疏松癥狀[2-5]。但對(duì)于青鹽方治療圍絕經(jīng)期綜合征的組方配伍規(guī)律及合理性研究尚不全面。本研究結(jié)合青鹽方君臣佐使組方特點(diǎn)，采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，選取各組藥中的代表性成分進(jìn)行分析，對(duì)該方的配伍合理性進(jìn)行初步探究和闡釋。

1 材料

中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)（traditional chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/）、PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、UniProt 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.uniprot.org/）、Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.genecards.org/）、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)（https://omim.org/）、DisGeNET 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.disgenet.org/）、STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://string-db.org/）、京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genome.jp/kegg/）、Cytoscape 3.7.1 軟件、Rx64 3.6.1 軟件、DAVID 6.8（https://david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)。

2 方法

2.1 藥物分組

根據(jù)中醫(yī)方劑君、臣、佐、使的配伍法則及青鹽方方解，對(duì)青鹽方進(jìn)行以下拆方分組：君藥（肉蓯蓉）組、君＋臣藥（肉蓯蓉＋巴戟天）組、君＋臣＋佐藥（肉蓯蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝）組、君＋臣＋佐＋使藥（肉蓯蓉＋巴戟天＋花椒＋牛膝＋青鹽）組。

2.2 青鹽方各拆方組合的化學(xué)成分收集與篩選

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中以各中藥名稱檢索青鹽方5 味藥中所含的化學(xué)成分，篩選條件為生物利用度＞30%、類藥性＞0.18。結(jié)合文獻(xiàn)，不滿足篩選條件但文獻(xiàn)報(bào)道明確的有效成分也納入候選成分。

2.3 青鹽方各拆方組合的化學(xué)成分潛在作用靶點(diǎn)收集

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中以各中藥名稱進(jìn)行檢索得到潛在藥物靶點(diǎn)。將潛在藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt 蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)，轉(zhuǎn)換為官方名稱，在PubChem 數(shù)據(jù)庫(kù)搜索青鹽主要成分NaCl 所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)，得到各拆方組合的化學(xué)成分相關(guān)候選靶點(diǎn)。

2.4 圍絕經(jīng)期綜合征疾病的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

在Genecards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、DisGeNET數(shù)據(jù)庫(kù)查詢圍絕經(jīng)期綜合征、雌激素低下、圍絕經(jīng)期焦慮、生殖道萎縮、骨質(zhì)疏松所對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)信息作為疾病靶點(diǎn)信息。

2.5 各拆方組合作用于疾病和各病理時(shí)期的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

采用Rx64 3.7.1 軟件統(tǒng)計(jì)青鹽方各拆方組合與圍絕經(jīng)期綜合征疾病和各病理時(shí)期的共同靶點(diǎn)，即為作用于圍絕經(jīng)期綜合征疾病和各病理時(shí)期的作用靶點(diǎn)；將得到的作用于圍絕經(jīng)期綜合征的靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 平臺(tái)獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（proteinprotein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，采用Cytoscape 軟件對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)中的靶點(diǎn)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，篩選出點(diǎn)度中心性和介數(shù)中心性均超過(guò)平均值的靶點(diǎn)，作為后續(xù)分析的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)[6]。

2.6 基因本體（geneontology，GO）、通路富集分析和網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape 軟件對(duì)篩選得到的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，在結(jié)果中選取P＜0.05，排名前10 的項(xiàng)目進(jìn)行分析[7]。將關(guān)鍵作用靶點(diǎn)輸入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，利用KEGG 數(shù)據(jù)庫(kù)，選取P值（P＜0.05）排名前20 的通路進(jìn)行分析。結(jié)合藥物化學(xué)成分、作用靶點(diǎn)、GO 富集分析和KEGG 富集分析結(jié)果，利用Cytoscape 軟件制作各拆方組合作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析圖[8]。

2.7 成分和機(jī)制的文獻(xiàn)驗(yàn)證

通過(guò)檢索國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)，挖掘分析青鹽方相關(guān)的活性成分治療圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)機(jī)制，為網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)所預(yù)測(cè)的結(jié)果提供文獻(xiàn)驗(yàn)證。

3 結(jié)果

3.1 君藥作用特點(diǎn)分析

如表1所示，共得到君藥肉蓯蓉18個(gè)化學(xué)成分、240 個(gè)靶點(diǎn)。與疾病靶點(diǎn)作交集，得到216 個(gè)共有靶點(diǎn)，具體成分及靶點(diǎn)見(jiàn)表2。216 個(gè)共有靶點(diǎn)中，204 個(gè)與雌激素低下相關(guān)、33 個(gè)與圍絕經(jīng)期焦慮相關(guān)、130 個(gè)與生殖道萎縮相關(guān)、139 個(gè)與骨質(zhì)疏松有關(guān)，共214 個(gè)靶點(diǎn)參與了PPI 網(wǎng)絡(luò)。

對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，點(diǎn)度中心性和介數(shù)中心性均超過(guò)平均值的關(guān)鍵作用靶點(diǎn)有40 個(gè)，分別為C-反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）、谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1（glutathioneS-transferase P1，GSTP1）、Myc 原癌基因蛋白（myc proto-oncogene protein，MYC）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metalloproteinase-9，MMP-9）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）、絲裂原活化蛋白激酶3（mitogen-activated protein kinase 3，MAPK3）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 3（endothelial nitric oxide synthase 3，NOS3）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（transcription factor AP-1，JUN）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、雌激素受體α（estrogen receptor α，ESR1）、超氧化物歧化酶2（superoxide dismutase 2，SOD2）、纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N1）、受體酪氨酸蛋白激酶erbB-2（receptor tyrosine-protein kinase erbB-2，ERBB2）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、胰島素（insulin，INS）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）、表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）、半胱氨酸蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、銅鋅超氧化物歧化酶1（Cu/Zn superoxide dismutase 1，SOD1 ）、 細(xì)胞周期蛋白 B1（G2/mitotic-specific cyclin B1，CCNB1）、髓過(guò)氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、半胱氨酸蛋白酶8（caspase-8，CASP8）、小凹蛋白1（caveolin-1，CAV1）、RAC-α 絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（RAC-alpha serine/threonine-protein kinase，AKT1）、骨橋蛋白（osteopontin，SPP1）、G1/特異性細(xì)胞周期蛋白D1（G1/S-specific cyclin D1，CCND1）、細(xì)胞色素P450酶家族3A4 亞型（cytochrome P450 3A4，CYP3A4）、趨化因子8（C-X-C motif ligand 8，CXCL8）、雄激素受體（androgen receptor，AR）、蛋白激酶Cα（protein kinase C alpha，PRKCA）、信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子 3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、間隙連接蛋白α-1（gap junction alpha-1 protein，GJA1）、轉(zhuǎn)錄因子p65（transcription factor p65，RELA）、血紅素加氧酶1（heme oxygenase 1，HMOX1）、過(guò)氧化物酶體增殖激活受體γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma，PPARG）、絲氨酸蛋白激酶（serine-protein kinase ATM，ATM）、前列腺素 G/H 合成酶 2（prostaglandin G/H synthase 2，PTGS2）、原癌基因c-Fos（proto-oncogene c-Fos，F(xiàn)OS），如圖1 所示。對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，君藥組治療圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)生物過(guò)程涉及化學(xué)刺激反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、生物過(guò)程的正負(fù)調(diào)控、組織發(fā)育、細(xì)胞過(guò)程的負(fù)調(diào)控、調(diào)控細(xì)胞增殖、對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)等。排除廣泛通路，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示其相關(guān)通路主要富集在ER信號(hào)通路（涉及9 個(gè)靶點(diǎn)）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路（涉及17 個(gè)靶點(diǎn)）、MAPK 信號(hào)通路（涉及15 個(gè)靶點(diǎn)）、缺氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路（涉及14 個(gè)靶點(diǎn)）等。

表1 青鹽方“中藥-化學(xué)成分-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)”信息Table 1 Information of “Chinese medicine-active ingredient-predictive target” for Qingyan Formula

表2 青鹽方作用于圍絕經(jīng)期綜合征的化學(xué)成分及靶點(diǎn)信息Table 2 Components and targets information of Qingyan Formula

3.2 君＋臣藥組作用特點(diǎn)分析

如表1 所示，共得到君＋臣藥組54 個(gè)化學(xué)成分、288 個(gè)靶點(diǎn)。與疾病靶點(diǎn)作交集，得到258 個(gè)共有靶點(diǎn)，具體成分及靶點(diǎn)見(jiàn)表2。258 個(gè)共有靶點(diǎn)中肉蓯蓉18 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)216 個(gè)靶點(diǎn)，巴戟天39 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)116 個(gè)靶點(diǎn)。258 個(gè)靶點(diǎn)中有243 個(gè)與雌激素低下相關(guān)（較君藥組增加39 個(gè)）、38 個(gè)有圍絕經(jīng)期焦慮相關(guān)（較君藥組增加5 個(gè)）、147 個(gè)與生殖道萎縮相關(guān)（較君藥組增加17 個(gè)）、166 個(gè)與骨質(zhì)疏松有關(guān)（較君藥組增加27 個(gè)），257 個(gè)參與了PPI 網(wǎng)絡(luò)。對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，點(diǎn)度中心性和介數(shù)中心性均超過(guò)平均值的關(guān)鍵靶點(diǎn)共有47 個(gè)，分別為膠質(zhì)纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，G FA P）、三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白 G 2（ATP-binding cassette sub-family G member 2，ABCG2）、腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、過(guò)氧化氫酶（catalase，CAT）、絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、巴豆?；D(zhuǎn)移酶（histone acetyltransferase p300，EP300）、轉(zhuǎn)錄因子Sp1（transcription factor Sp1，SP1）、過(guò)氧化酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARA）、HIF1A、SOD1、MMP9、MAPK1、PRKCA、MYC、FOS、RELA、MAPK3、ATM、CXCL8、CCND1、FN1、AKT1、IL-1β、CASP8、CYP3A4、SPP1、JUN、CCNB1、VEGFA、IL-6、ESR1、INS、CAV1、PTGS2、GSTP1、PPARG、AR、CRP、HMOX1、ERBB2、CASP3、NOS3、EGFR、SOD2、STAT3、EGF、IL-2，如圖2 所示。對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，君＋臣藥組治療圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)生物過(guò)程涉及化學(xué)刺激反應(yīng)、調(diào)控發(fā)育過(guò)程、生物過(guò)程的正負(fù)調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、組織增殖、細(xì)胞過(guò)程正負(fù)調(diào)控、調(diào)控細(xì)胞增殖、對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)等。排除廣泛通路，KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示其相關(guān)通路主要富集在ER 信號(hào)通路（涉及10 個(gè)靶點(diǎn)）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（涉及18 個(gè)靶點(diǎn)）、MAPK 信號(hào)通路（涉及17 個(gè)靶點(diǎn)）、HIF-1 信號(hào)通路（涉及16 個(gè)靶點(diǎn)）等。

圖1 君藥組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.1 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun group

圖2 君＋臣藥組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun and Chen group

3.3 君＋臣＋佐藥組作用特點(diǎn)分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐藥組73 個(gè)化學(xué)成分、306 個(gè)靶點(diǎn)。與疾病靶點(diǎn)作交集，得到274 個(gè)共有靶點(diǎn)，具體成分及靶點(diǎn)見(jiàn)表2。274 個(gè)共有靶點(diǎn)中肉蓯蓉18 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)216 個(gè)靶點(diǎn)，巴戟天39個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)116 個(gè)靶點(diǎn)，花椒7 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)147 個(gè)靶點(diǎn)，牛膝16 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)170 個(gè)靶點(diǎn)。274 個(gè)靶點(diǎn)中有258 個(gè)與雌激素低下相關(guān)（較君＋臣藥組增加15 個(gè)）、40 個(gè)有圍絕經(jīng)期焦慮相關(guān)（較君＋臣藥組增加2 個(gè)）、153 個(gè)與生殖道萎縮相關(guān)（較君＋臣藥組增加6 個(gè)）、176 個(gè)與骨質(zhì)疏松有關(guān)（較君＋臣藥組增加10 個(gè)），273 個(gè)參與了PPI 網(wǎng)絡(luò)。如圖3 所示，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，點(diǎn)度中心性和介數(shù)中心性值均超過(guò)平均值的關(guān)節(jié)靶點(diǎn)共有48 個(gè)，分別為絲裂原活化蛋白激酶8（mitogenactivated protein kinase 8，MAPK8）、細(xì)胞色素C（cytochrome C，CYCS）、載脂蛋白A1（apolipoprotein A1，APOA1）、CAT、MMP9、GSTP1、PPARA、AKT1、ESR1、SPP1、NOS3、FOS、SOD2、CCND1、MAPK3、ERBB2、CASP3、CYP3A4、CXCL8、EP300、EGFR、PPARG、AR、GJA1、IL-1β、BDNF、SP1、EGF、STAT3、PRKCA、CAV1、MAPK1、FN1、RELA、ATM、CASP8、JUN、HMOX1、PTGS2、VEGFA、MAPK14、ABCG2、IL-2、IL-6、INS、HIF-1α、MYC、SOD1。對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，君＋臣＋佐藥組治療圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)生物過(guò)程涉及化學(xué)刺激反應(yīng)、生物過(guò)程的正負(fù)調(diào)控、調(diào)控發(fā)育過(guò)程、細(xì)胞過(guò)程正負(fù)調(diào)控、應(yīng)激反應(yīng)、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、代謝過(guò)程正負(fù)調(diào)控、組織增殖、對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)等。排除廣泛通路，KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示其相關(guān)通路主要富集在ER 信號(hào)通路（涉及10 個(gè)靶點(diǎn)）、MAPK 信號(hào)通路（涉及18 個(gè)靶點(diǎn)）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（涉及18 個(gè)靶點(diǎn)）、HIF-1 信號(hào)通路（涉及16 個(gè)靶點(diǎn)）等。

圖3 君＋臣＋佐藥組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.3 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo group

3.4 君＋臣＋佐＋使藥（全方）組作用特點(diǎn)分析

如表1 所示，共得到君＋臣＋佐＋使藥（全方）組74 個(gè)化學(xué)成分、322 個(gè)靶點(diǎn)。與疾病靶點(diǎn)作交集，得到290 個(gè)共有靶點(diǎn)，具體成分及靶點(diǎn)見(jiàn)表2。290個(gè)共有靶點(diǎn)中肉蓯蓉18 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)216 個(gè)靶點(diǎn)，巴戟天39 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)116 個(gè)靶點(diǎn)，花椒7個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)147 個(gè)靶點(diǎn)，牛膝16 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)170 個(gè)靶點(diǎn)，青鹽1 個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)19 個(gè)靶點(diǎn)。290 個(gè)共有靶點(diǎn)中有273 個(gè)與雌激素低下相關(guān)（較君＋臣＋佐藥組增加15 個(gè)）、40 個(gè)與圍絕經(jīng)期焦慮相關(guān)（較君＋臣＋佐藥組未增加）、162 個(gè)與生殖道萎縮相關(guān)（較君＋臣＋佐藥組增加9 個(gè)）、182個(gè)與骨質(zhì)疏松有關(guān)（較君＋臣＋佐藥組增加6 個(gè)），288 個(gè)參與了PPI 網(wǎng)絡(luò)。如圖4 所示，對(duì)PPI 網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵傩苑治?，點(diǎn)度中心性和介數(shù)中心性值均超過(guò)平均值的靶點(diǎn)共有51 個(gè)，分別為趨化因子2（C-C motif chemokine 2，CCL2）、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶（glucose-6-phosphatedehydrogenase，G6PD）、尿激酶型纖溶酶原激活物（ urokinase-type plasminogen activator，PLAU）、熱休克蛋白A4（heat shock protein A4，HSPA4）、白細(xì)胞介素-10（interleukin-10，IL-10）、CCND1、ATM、MMP9、CYP3A4、EGFR、CXCL8、HIF-1α、PRKCA、PPARG、APOA1、STAT3、ESR1、CASP8、IL-2、CAT、PTGS2、SOD2、JUN、VEGFA、MYC、NOS3、RELA、BDNF、SOD1、CYCS、GSTP1、HMOX1、MAPK3、AR、ERBB2、MAPK14、EP300、FOS、CAV1、EGF、CASP3、MAPK1、IL-1β、MAPK8、SP1、PPARA、FN1、INS、SPP1、AKT1、IL-6。對(duì)關(guān)鍵作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO 富集分析，君＋臣＋佐＋使藥組治療圍絕經(jīng)期綜合征的相關(guān)生物過(guò)程涉及化學(xué)刺激反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、組織發(fā)育、生物過(guò)程的正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞過(guò)程正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)等。排除廣泛通路，KEGG通路富集分析結(jié)果顯示其相關(guān)通路主要富集在ER信號(hào)通路（涉及10 個(gè)靶點(diǎn)）、PI3K-Akt 信號(hào)通路（涉及18 個(gè)靶點(diǎn)）、MAPK 信號(hào)通路（涉及18 個(gè)靶點(diǎn)）、HIF-1 信號(hào)通路（涉及16 個(gè)靶點(diǎn)）等。

4 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)涉及生物信息學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)、網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫(kù)檢索等技術(shù)和知識(shí)，能預(yù)測(cè)出藥物與通路、疾病的相關(guān)性，構(gòu)建“藥物-成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，揭示多分子藥物協(xié)同作用機(jī)制，與中藥及其復(fù)方多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同作用的原理契合度較高，因此本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，將青鹽方拆方作用于圍絕經(jīng)期綜合征分別進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè)篩選及功能和通路富集分析，探索補(bǔ)腎方劑青鹽方治療圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制和配伍合理性。

圖4 君＋臣＋佐＋使藥（全方）組作用特點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)分析Fig.4 Network analysis of pharmacological characteristics of Jun-Chen-Zuo-Shi group

本課題組前期開(kāi)展的青鹽方治療圍絕經(jīng)期焦慮癥的網(wǎng)絡(luò)分析[4]，為更廣泛獲得該方治療該疾病的潛在靶標(biāo)，結(jié)合TCMIP v2.0 和Swiss Target Prediction 得到青鹽方45 個(gè)化合物對(duì)應(yīng)的455 個(gè)潛在靶標(biāo)信息，并進(jìn)行初步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。本研究采用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)中的相關(guān)靶點(diǎn)功能，并結(jié)合文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)及知識(shí)歸納篩選出青鹽方74 個(gè)潛在化學(xué)成分及322 個(gè)潛在靶標(biāo)信息，旨在從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度闡釋青鹽方防治圍絕經(jīng)期的作用特點(diǎn)及配伍規(guī)律。各藥可通過(guò)多種成分、多個(gè)靶點(diǎn)、多種信號(hào)通路作用于圍絕經(jīng)期綜合征，各藥之間既有重復(fù)，又互相補(bǔ)充，全方作用于圍絕經(jīng)期綜合征的靶點(diǎn)290 個(gè)，其中關(guān)鍵靶點(diǎn)51 個(gè)，可通過(guò)化學(xué)刺激反應(yīng)、應(yīng)激反應(yīng)、組織發(fā)育、生物過(guò)程的正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞過(guò)程正負(fù)調(diào)控、細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、對(duì)類固醇激素刺激的反應(yīng)等生物過(guò)程作用于圍絕經(jīng)期綜合征，主要通過(guò)影響細(xì)胞因子如AKT1、CCND1、凋亡調(diào)節(jié)劑B 淋巴細(xì)胞瘤2（B-cell lymphoma 2，Bcl-2），炎癥因子如IL-1β、IL-10、CCL2，內(nèi)分泌因子如BDNF、ESR1、AR 參與神經(jīng)系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等，從而作用于圍絕經(jīng)期綜合征。KEGG通路富集結(jié)果顯示，青鹽方主要通過(guò)ER、PI3K-Akt、MAPK、HIF-1 等信號(hào)通路作用于圍絕經(jīng)期綜合征。

肉蓯蓉作為方中君藥，囊括了全方290 個(gè)靶點(diǎn)中的216 個(gè)靶點(diǎn)，涉及圍絕經(jīng)期焦慮、生殖道萎縮、骨質(zhì)疏松各個(gè)不同癥狀和雌激素低下關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。在君藥基礎(chǔ)上依次增加臣、佐、使藥后，靶點(diǎn)個(gè)數(shù)和各通路所涉及的靶點(diǎn)均有不同程度的增加。君＋臣藥組作為方中的核心藥對(duì)，囊括了290 個(gè)靶點(diǎn)中258 個(gè)靶點(diǎn)，臣藥巴戟天在君藥基礎(chǔ)上增加了42 個(gè)靶點(diǎn)，尤以增加雌激素低下關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)的靶點(diǎn)為最多，也涉及各個(gè)不同癥狀靶點(diǎn)的增加，提示君藥、君-臣藥對(duì)在方中的關(guān)鍵地位，對(duì)各個(gè)不同癥狀和雌激素低下關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)均有防治作用。在君臣藥對(duì)基礎(chǔ)上加入佐藥花椒、牛膝后，增加了16 個(gè)靶點(diǎn)，涉及各個(gè)不同癥狀和關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)均有增加，顯示其在方中“佐”的地位。在君、臣、佐藥基礎(chǔ)上增加使藥青鹽后增加了16 個(gè)靶點(diǎn)，在各個(gè)不同時(shí)期癥狀和關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)均有涉及，如血清和糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)蛋白激酶（serum/ glucocorticoid-regulated kinase 1，SGK1）[9]、乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶（cholin acetyltransferase，CHAT）[10]涉及神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)；炎癥因子高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）[11]、整合素β2（integrin beta 2，ITGB2）[12]涉及免疫、炎癥因子；G6PD[13]、15-羥基前列腺素脫氫酶（15-hydroxyprostaglandindehydrogenase，15-PGDH）[14]涉及細(xì)胞凋亡；碳酸酐酶1（carbonic anhydrase 1，CA1）[15]、碳酸酐酶2（carbonic anhydrase 2，CA2）[16]涉及骨代謝過(guò)程。表明青鹽作為引經(jīng)藥，在方中潤(rùn)燥潛降，引諸藥入腎經(jīng)，可關(guān)聯(lián)多個(gè)圍絕經(jīng)期綜合征涉及的系統(tǒng)及功能，增加君臣佐藥組在各個(gè)不同癥狀和關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)的參與防治，起到引經(jīng)報(bào)使的作用。

《素問(wèn)·上古天真論》云：“女子七歲腎氣盛，齒更發(fā)長(zhǎng)；二七而天癸至，任脈通……時(shí)至七七則任脈虛，太沖脈衰少，天癸竭，地道不通，故形壞而無(wú)子也。”中醫(yī)認(rèn)為婦女時(shí)至七七時(shí)，腎氣衰，天癸竭，進(jìn)而出現(xiàn)“絕經(jīng)前后諸癥”即圍絕經(jīng)期綜合征，故腎虛是致圍絕經(jīng)期綜合征之本。課題組前期多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎方藥作用于圍絕經(jīng)期綜合征與雌激素網(wǎng)絡(luò)有著密切聯(lián)系[2-3,17-19]。雌激素在整個(gè)生命過(guò)程中影響著雌性丘腦下部的活動(dòng)，對(duì)性分化、發(fā)育和成熟均有影響，對(duì)骨代謝具有重要調(diào)節(jié)作用[20-21]。研究表明，方中肉蓯蓉、巴戟天、花椒、牛膝均含有雌激素樣作用的成分，如槲皮素（quercetin）作為肉蓯蓉、花椒、牛膝的共有成分，可與ESR1 結(jié)合發(fā)揮雌激素樣保護(hù)作用[22]，并調(diào)控雌激素受體下游底物和信號(hào)通路，通過(guò)雌激素受體介導(dǎo)的通路促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖和成骨向分化，改善骨組織結(jié)構(gòu)和功能[23]。MAPK 信號(hào)通路可介導(dǎo)卵巢顆粒細(xì)胞增殖、分化、遷移、凋亡[24]。HIF-1 信號(hào)通路既可促進(jìn)骨形成和血管形成[25]，又可增加破骨細(xì)胞的數(shù)量和破骨活性[26]。PI3K/Akt信號(hào)通路及其下游靶蛋白可參與骨形成和骨重建過(guò)程[27]。ErbB 信號(hào)通路可激活PI3K/Akt 途徑，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞分化，干預(yù)神經(jīng)系統(tǒng)疾病[28]。調(diào)節(jié)VEGF 信號(hào)通路可改善腦部微循環(huán)與腦代謝異常，從而緩解焦慮、抑郁等情況[29]。p53 信號(hào)通路參與誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜細(xì)胞凋亡[30]，抑制原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[31]。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，分析青鹽方中各拆方組合作用于圍絕經(jīng)期綜合征的作用靶點(diǎn)及機(jī)制，揭示青鹽方作用于圍絕經(jīng)期綜合征的作用機(jī)制及君、臣、佐、使配伍的合理性，為進(jìn)一步探究其發(fā)揮作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制提供方向。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突