柴歸顆粒對慢性不可預(yù)知溫和刺激抑郁大鼠模型腸道菌群的作用

趙映霞，許 騰，田俊生，秦雪梅

山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

抑郁癥屬于情感性心境障礙，已成為嚴(yán)重影響患者身心健康的重大疾病，其發(fā)病率逐年增加，患病人數(shù)已超過3 億，約占世界人口的4.4%[1]。但其病因和發(fā)病機(jī)制尚不清楚，現(xiàn)有抗抑郁藥物的臨床療效不佳且不良反應(yīng)明顯，因此被列為重大疑難疾病之一。近年來，越來越多的研究報道腸道和大腦之間擁有一個包含內(nèi)分泌、免疫、自主神經(jīng)和腸神經(jīng)等的雙向通訊系統(tǒng)。腸道菌群與大腦之間的關(guān)系對抑郁癥具有一定的影響，研究發(fā)現(xiàn)抑郁患者的糞便菌群組成與健康受試者存在明顯差異[2]；抑郁患者的糞便菌群移植到無菌小鼠可誘發(fā)抑郁樣行為[3]；抗抑郁藥氟西汀、文拉法辛等可明顯調(diào)節(jié)抑郁患者的腸道菌群組成[4-6]；逍遙散可通過調(diào)節(jié)腸道菌群來改善慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）大鼠的抑郁樣行為[7]。

柴歸顆粒是課題組前期對宋代《太平惠民和劑局方》中的經(jīng)典方劑逍遙散進(jìn)行抗抑郁組分篩選和化學(xué)成分分析，通過藥效學(xué)研究和臨床試驗(yàn)觀察，對原方進(jìn)行化裁而研發(fā)的抗抑郁中藥新藥，處方由柴胡、當(dāng)歸、白芍、麩炒白術(shù)、炙甘草和薄荷組成。柴歸顆粒的離體腸吸收特性研究發(fā)現(xiàn)，柴歸顆?？沙杀对黾痈什莶槎狟 和異甘草素在CUMS 大鼠腸道的吸收，甘草查耳酮B 和異甘草素是有效的抗抑郁活性成分[8]。柴歸顆粒中含有的柴胡皂苷、白術(shù)內(nèi)酯、香草酸、芍藥苷、芍藥新苷、芍藥內(nèi)酯苷、Z-丁烯基苯酞和甘草次酸均已被報道具有抗抑郁作用，可能是柴歸顆粒發(fā)揮抗抑郁作用的有效成分，柴歸顆粒已獲得國家藥物臨床試驗(yàn)批件（2018L03149），目前正在開展藥物臨床試驗(yàn)研究。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，柴歸顆粒具有改善抑郁大鼠伴發(fā)的學(xué)習(xí)記憶能力下降、焦慮情緒和胃腸功能障礙的作用，推測柴歸顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)腸道菌群來改善胃腸功能和抑郁樣行為。因此本研究采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)，分析柴歸顆粒對CUMS大鼠腸道菌群組成的影響，闡明柴歸顆粒通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成從而發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)制，為治療抑郁癥及抗抑郁藥物的研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動物

SPF 級雄性SD 大鼠，8 周齡，體質(zhì)量180～200 g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，許可證號SCXK（京2016-0006）。動物于室溫（22±2）℃，相對濕度（50±10）%，自然晝夜節(jié)律飼養(yǎng)，自由飲食和飲水。動物實(shí)驗(yàn)通過山西大學(xué)科學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號SXULL-2018009）。

1.2 藥材

柴歸顆粒（批號20181009）由柴胡16.38 kg、當(dāng)歸16.38 kg、白芍16.38 kg、麩炒白術(shù)16.38 kg、炙甘草8.19 kg、薄荷5.46 kg 組成，由山西省中醫(yī)研究院制劑中心制備。以上藥材均購于山西省華陽藥業(yè)有限公司，經(jīng)山西大學(xué)中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心秦雪梅教授鑒定分別為柴胡Bupleurum chinenseDC.、當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.) Diels、白芍Paeonia lactifloraPall.、白術(shù)Atractylodes macrocephalaKoidz.、甘草Glycyrrhiza uralensisFisch.和薄荷Mentha haplocalyxBriq.，均符合《中國藥典》2020年版標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 藥品與試劑

瓊脂糖凝膠（批號75510-019）、瓊脂糖凝膠電泳緩沖液（批號AM9870）、Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit（批號P7589）購自美國Invitrogen公司；Marker（批號DL2000）購自日本Takara 公司；Q5?High-Fidelity DNA 聚合酶（批號M0491L）購自美國NEB 公司。

1.4 儀器

Centrifuge TDL-5 高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；BSA124S 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）；大鼠曠場測試箱（長100 cm、寬100 cm、高70 cm，黑色，25 格，實(shí)驗(yàn)室自制）；KQ-400KDE超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；NC2000 Nanodrop 紫外定量儀（美國Thermo Scientific Fisher公司）；DYY-6C 電泳儀（北京六一生物科技有限公司）；BG-gdsAUTO（130）凝膠成像系統(tǒng)（北京百晶生物技術(shù)有限公司）；2720 PCR 擴(kuò)增儀（美國ABI公司）；FLX800T 酶標(biāo)儀（美國BioTek 公司）；Miseq測序儀（美國Illumina 公司）。

2 方法

2.1 動物分組與給藥

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，進(jìn)行糖水偏愛實(shí)驗(yàn)、曠場測試和體質(zhì)量基線測試，并隨機(jī)分為對照組、模型組、柴歸顆粒（8.3 g/kg，以生藥量計）組，每組10 只。藥物溶于蒸餾水，柴歸顆粒組ig 藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig 等體積蒸餾水，1 次/d，給藥1 h 后造模，持續(xù)28 d。

2.2 CUMS 模型的建立

參照Willner[9]及本課題組方法[10]，CUMS 模型使用9 種刺激因子，包括冰水浴、熱刺激、禁食、禁水、超聲刺激、夾尾、束縛、足底電擊、晝夜顛倒，每天隨機(jī)給予1 種應(yīng)激，保證同一刺激不連續(xù)出現(xiàn)，持續(xù)28 d。

2.3 樣本收集

給藥及造模28 d 后，大鼠禁食不禁水12 h，ip 10%水合氯醛（5 mL/kg）麻醉[11]，腹主動脈取血后處死，收集腸道內(nèi)容物于滅菌凍存管中，液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 16S rRNA V3～V4 區(qū)高通量測序

2.4.1 DNA 樣本的提取與擴(kuò)增 以行為學(xué)指標(biāo)為依據(jù)，每組篩選6 只大鼠進(jìn)行高通量測序。取大鼠腸道內(nèi)容物200 mg，提取細(xì)菌總DNA，采用Nanodrop對DNA 進(jìn)行定量分析，通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 純度。擴(kuò)增目的片段為V3～V4 區(qū)，上游引物序列為5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3’，下游引物序列為5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’。PCR 條件為98 ℃預(yù)變性30 s，98 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共27 個循環(huán)，72 ℃擴(kuò)展延伸5 min。

2.4.2 PCR 產(chǎn)物定量 使用Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit 對PCR 產(chǎn)物在Microplate reader進(jìn)行熒光定量。根據(jù)熒光定量結(jié)果，按照樣本的測序量，對樣本按相應(yīng)比例進(jìn)行混合。

2.4.3 Miseq 測序 采用Illumina 公司的TruSeq Nano DNA LT Library Prep Kit 制備測序文庫，使用Miseq Reagent Kit V3 測序儀進(jìn)行2×300 bp 的雙端測序。利用Flash 軟件（http://ccb.jhu.edu/software/FLASH/），通過質(zhì)量初篩的雙端序列根據(jù)重疊堿基進(jìn)行配對連接，獲得樣本的有效序列；運(yùn)用QIIME軟件（http://qiime.org/）剔除疑問序列，采用Mothur軟件通過Metastats 統(tǒng)計進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

2.5 統(tǒng)計分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，使用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。

3 結(jié)果

3.1 腸道菌群多樣性分析

如圖1-A 所示，各組間菌群操作分類單元（operational taxonomic unit，OTU）數(shù)量發(fā)生明顯改變。豐度等級曲線將每個樣本中的OTU 用折線連接，以此反映各樣本OTU 豐度的分布規(guī)律，可直觀地反映群落中高豐度和稀有OTU 的數(shù)量。折線在橫軸上的長度反映了該樣本中OTU 的數(shù)量，代表了群落豐度，折線的平緩程度反映了群落組成的均勻度，折線越平表示緩群落組成的均勻度越高，折線越陡峭則群落中OTU 間的豐度差異越大。如圖1-B 所示，柴歸顆粒組橫軸上的折線較長，表明其OTU 數(shù)量較多。

α 多樣性通過群落多樣性指數(shù)與群落豐度指數(shù)反映樣品的物種多樣性，其中 Chao1 指數(shù)和Observed_species 指數(shù)表示豐度，Shannon 指數(shù)表示多樣性，Pielou 指數(shù)表示均勻度。如表1 所示，與對照組比較，模型組Chao1 和Observed_species 指數(shù)顯著降低（P＜0.05），柴歸顆?？娠@著升高Chao1、Observed_species、Shannon 和Pielou 指數(shù)（P＜0.05、0.01），表明柴歸顆?？捎行г黾幽c道菌群豐度、多樣性和均勻度。

β 多樣性通過比較微生物群落構(gòu)成來評估微生物群落間的差異。主坐標(biāo)分析（principal coordinates analysis，PCoA）結(jié)果如圖1-C 所示，對照組與模型組菌群結(jié)構(gòu)組成差異明顯，柴歸顆粒組偏離模型組，接近對照組。表明CUMS 誘導(dǎo)大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成發(fā)生變化，柴歸顆?？筛纳艭UMS 大鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)組成和菌群多樣性。

3.2 不同分類水平的腸道菌群組成分析

3.2.1 門水平腸道菌群組成 如圖2 所示，從18個樣品中共鑒定出厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、棲熱菌門（Thermi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）等20 個菌門，厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度較高，兩者的比值（Firmicutes/Bacteroidetes，F(xiàn)/B）在一定程度上可以反映機(jī)體的健康狀態(tài)。如圖3 所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群棲熱菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門相對豐度水平顯著降低（P＜0.05），F(xiàn)/B 值顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴歸顆粒組棲熱菌門、變形菌門、擬桿菌門和放線菌門相對豐度水平顯著升高（P＜0.05、0.01），F(xiàn)/B 值顯著降低（P＜0.01），表明柴歸顆粒可調(diào)節(jié)失調(diào)的腸道菌群水平和菌群的結(jié)構(gòu)組成，從而發(fā)揮抗抑郁作用。

圖1 各組大鼠腸道菌群的OTU 數(shù)量 (A)、豐度等級曲線 (B) 和PCoA (C)Fig.1 OTUs number (A),rank abundance curve (B),and PCoA (C) of gut microbiota in each group

表1 各組大鼠腸道菌群的α 多樣性指數(shù)分析 ()Table 1 Alpha diversity indexes analysis of gut microbiota in each group ()

表1 各組大鼠腸道菌群的α 多樣性指數(shù)分析 ()Table 1 Alpha diversity indexes analysis of gut microbiota in each group ()

與對照組比較：#P＜0.05；與模型組比較：*P＜0.05 **P＜0.01#P < 0.05 vs control group; *P < 0.05 **P < 0.01 vs model group

組別 劑量/(g·kg-1) Chao1 指數(shù) Observed_species 指數(shù) Shannon 指數(shù) Pielou 指數(shù)對照 — 260.44±99.87 266.67±90.02 3.12±0.75 0.35±0.07模型 — 131.07±17.25# 121.00±2.33# 2.23±0.36 0.28±0.02柴歸顆粒 8.3 260.34±53.65** 261.20±40.80** 3.05±0.51* 0.35±0.04*

圖2 各組大鼠腸道菌群在門水平的組成Fig.2 Classification and abundance of jejunum contents of phylum of gut microbiota in each group

圖3 各組大鼠腸道菌群在門水平的相對豐度比較Fig.3 Relative abundance of selected phylum with significant differences of gut microbiota in each group

圖4 各組大鼠腸道菌群在科水平 (A) 和屬水平 (B) 的組成Fig.4 Classification and abundance of jejunum contents of family (A) and genus (B) of gut microbiota in each group

3.2.2 科及屬水平菌群組成 從18 個樣品中共得到135 個菌科和238 個菌屬，其科和屬水平組成見圖4。如圖5 所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群中布魯氏菌科（Brucellaceae）、棲熱菌科（Thermaceae）、莫拉菌科（ Moraxellaceae ）、甲基桿菌科（Methylobacteriaceae）和周蝶菌科（Weeksellaceae）相對豐度水平顯著降低（P＜0.05、0.01），梭桿菌科（Clostridiaceae）相對豐度水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，柴歸顆?？娠@著回調(diào)以上菌科（P＜0.01）。如圖6 所示，與對照組比較，模型組大鼠腸道菌群中乳酸桿菌屬Lactobacillus相對豐度水平顯著升高（P＜0.05），棲熱菌屬Thermus、不動桿菌屬Acinetobacter、 甲基桿菌屬M(fèi)ethylobacterium、青枯菌屬Ralstonia、纖毛菌屬Leptothrix、假單胞菌屬Pseudomonas、棒狀桿菌屬Corynebacterium和蒼白桿菌屬Ochrobactrum相對豐度水平顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，柴歸顆?？娠@著降低乳酸桿菌屬相對豐度水平（P＜0.01），顯著升高棲熱菌屬、不動桿菌屬、甲基桿菌屬、青枯菌屬、纖毛菌屬和蒼白桿菌屬相對豐度水平（P＜0.01）。表明柴歸顆粒可顯著調(diào)節(jié)抑郁大鼠腸道菌群，通過調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成平衡維持機(jī)體健康。

4 討論

本研究采用16S rRNA 高通量測序方法分析柴歸顆粒對CUMS 大鼠腸道菌群的影響，從調(diào)節(jié)腸道菌群平衡的角度探討柴歸顆?？挂钟舻淖饔脵C(jī)制。研究結(jié)果表明柴歸顆?？娠@著改善CUMS 大鼠腸道中乳酸桿菌屬、不動桿菌屬、蒼白桿菌屬和棲熱菌屬的相對豐度水平，其抗抑郁作用可能與調(diào)節(jié)上述菌群有關(guān)。課題組前期通過行為絕望模型（小鼠懸尾和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)）、藥物誘導(dǎo)抑郁模型（利血平拮抗模型、5-羥色胺誘導(dǎo)甩頭模型）和CUMS 模型對柴歸顆粒的抗抑郁作用進(jìn)行反復(fù)多次實(shí)驗(yàn)，以動物活動能力、糖水偏愛率、體質(zhì)量等指標(biāo)評價柴歸顆粒的抗抑郁作用，發(fā)現(xiàn)8.3 g/kg 柴歸顆?？挂钟粜Ч罴裑12-13]。

圖5 科水平腸道菌群的相對豐度Fig.5 Relative abundance of selected family with significant differences of gut microbiota

圖6 屬水平腸道菌群的相對豐度Fig.6 Relative abundance of selected gene with significant differences of gut microbiota

本研究發(fā)現(xiàn)，柴歸顆粒對門分類水平的菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用。90%腸道菌群集中在厚壁菌門和擬桿菌門，厚壁菌可以將碳水化合物代謝發(fā)酵成短鏈脂肪酸如丁酸鹽、乙酸鹽、戊酸鹽等。短鏈脂肪酸鹽誘導(dǎo)T 細(xì)胞分化[14]，可作為具有免疫抑制[15]和抗炎[16]功能的藥物；嚙齒動物的臨床前研究表明，抑制組蛋白脫乙酰酶能夠在恐懼、焦慮、抑郁和創(chuàng)傷中起到增強(qiáng)認(rèn)知的作用[17]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)學(xué)說認(rèn)為多巴胺能和腎上腺能神經(jīng)系統(tǒng)功能異常是抑郁癥的發(fā)病機(jī)制之一[18]。抑郁癥患者腦內(nèi)5-羥色胺水平降低，腸道菌群通過影響色氨酸代謝，激活吲哚胺2,3-雙加氧酶，將色氨酸轉(zhuǎn)化為犬尿氨酸，最終耗竭色氨酸，使5-羥色胺水平降低，從而引發(fā)抑郁。益生菌可降低吲哚胺2,3-雙加氧酶活性，通過增加5-羥色胺前體色氨酸來增加5-羥色胺水平，從而改善抑郁[19]。課題組前期研究表明，柴歸顆?？缮险{(diào)血清中神經(jīng)遞質(zhì)（5-羥色胺、去甲腎上腺素、5-羥吲哚乙酸）水平[20]。Aizawa 等[21]發(fā)現(xiàn)抑郁癥患者和健康人群在腸道菌群的結(jié)構(gòu)上存在明顯差異；前期研究也發(fā)現(xiàn)，對照組和模型組大鼠的腸道菌群存在顯著差異[22]。芍藥苷可在糞腸球菌、金黃色葡萄球菌和短雙歧桿菌的作用下轉(zhuǎn)化為苯甲酸，從而發(fā)揮抗抑郁作用，表明腸道菌群與抗抑郁藥物關(guān)系密切[23]。本研究結(jié)果顯示，柴歸顆?？娠@著調(diào)節(jié)CUMS 大鼠腸道菌群的結(jié)構(gòu)組成，表明柴歸顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)組成來發(fā)揮抗抑郁作用。

在屬分類水平，柴歸顆?？山档虲UMS 大鼠腸道中乳酸桿菌屬相對豐度水平。乳酸桿菌作為益生菌具有較強(qiáng)的代謝機(jī)體內(nèi)碳水化合物產(chǎn)酸的能力，可合成葡聚糖和雜多糖、抵抗腸道病原體的定殖、競爭性排斥病原體、抑制和消除條件致病菌、調(diào)節(jié)腸道菌群失衡[24-26]。γ-氨基丁酸（gammaaminobutyric acid，GABA）可由乳酸桿菌分泌，GABA 是存在于情感、行為調(diào)節(jié)腦區(qū)的物質(zhì)，GABA受體受損導(dǎo)致GABA 能信號傳遞失衡，海馬神經(jīng)元受到抑制，從而產(chǎn)生抑郁[27]。乳酸桿菌可通過迷走神經(jīng)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)（5-羥色胺和多巴胺）受體的表達(dá)來改善抑郁行為[28]。前期研究發(fā)現(xiàn)，健康人與抑郁患者的代謝存在差異，抑郁患者體內(nèi)乳酸堆積，其可能原因是抑郁患者體內(nèi)可產(chǎn)生乳酸的菌群增多，菌群平衡被破壞，進(jìn)而誘發(fā)抑郁[29]。本研究發(fā)現(xiàn)抑郁大鼠中產(chǎn)生乳酸的乳酸桿菌水平顯著增加，與課題組前期研究一致。

本研究發(fā)現(xiàn)，柴歸顆粒能夠回調(diào)抑郁大鼠腸道中不動桿菌屬、蒼白桿菌屬和棲熱菌屬水平，這些差異菌屬均參與了精氨酸的代謝途徑。研究發(fā)現(xiàn)，CUMS 抑郁大鼠海馬中精氨酸水平升高[30]，而抑郁癥患者血漿中精氨酸水平降低[31]，Ozden 等[32]提出精氨酸代謝物與抑郁癥的病理和生理有關(guān)，精氨酸代謝物腐胺水平可能是預(yù)測抑郁嚴(yán)重程度的生物標(biāo)志物。Ikeda 等[33]發(fā)現(xiàn)腐胺的產(chǎn)生受腸道菌群影響，雙歧桿菌可產(chǎn)生腐胺，動物腸道菌群中具有將精氨酸合成腐胺和亞精胺的酶。Nakamura 等[34]發(fā)現(xiàn)腸道內(nèi)的腐胺通過多種代謝途徑產(chǎn)生，主要依賴于腸道菌群，表明腸道菌群在精氨酸代謝過程中發(fā)揮作用。研究發(fā)現(xiàn)，胍丁胺作為腐胺的前體物質(zhì)通過阻斷抑郁動物模型中N-甲基-D-天冬氨酸受體起到快速抗抑郁作用[35-36]，提示精氨酸代謝物在一定程度上可能具有抗抑郁作用。精氨酸在降解過程中涉及多種酶，腸道菌群主要通過精氨酸脫羧酶合成多胺，且多胺主要被小腸吸收[37]。多胺水平主要受限速酶調(diào)控，亞精胺/精胺N1-乙酰基轉(zhuǎn)移酶是參與多胺分解代謝的關(guān)鍵酶，在抑郁癥患者腦中其表達(dá)降低[38]，提示抑郁的發(fā)生可能與多胺系統(tǒng)有關(guān)。慢性應(yīng)激導(dǎo)致胞質(zhì)多胺增多，促進(jìn)興奮，而長時間高濃度的胞質(zhì)多胺使神經(jīng)元過度興奮，產(chǎn)生神經(jīng)毒性[39]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)[40]，逍遙散低級性部位可明顯降低CUMS 大鼠亞精胺水平，而亞精胺是精氨酸的代謝產(chǎn)物，多胺中的腐胺、精胺、亞精胺、胍丁胺等均為精氨酸的降解產(chǎn)物，提示精氨酸降解途徑在抑郁癥中扮演重要的角色。本研究發(fā)現(xiàn)的不動桿菌屬參與精氨酸途徑，其柴歸顆?？娠@著調(diào)節(jié)該菌群的結(jié)構(gòu)組成，提示柴歸顆粒發(fā)揮抗抑郁作用可能與參與精氨酸途徑的不動桿菌屬有關(guān)。

綜上所述，柴歸顆粒的抗抑郁作用可能與精氨酸代謝途徑及其相關(guān)的菌群有關(guān)，課題組后續(xù)將通過分子生物學(xué)方法對差異菌群和精氨酸降解途徑相關(guān)限速酶進(jìn)行驗(yàn)證。本研究有助于探討柴歸顆粒的抗抑郁作用及機(jī)制，為柴歸顆粒在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突