氨基酸轉(zhuǎn)化三七花中稀有人參皂苷及提取液對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞活性的影響

邵紫君，李志滿，于鵬程，陳建波，李珊珊，孫印石*

1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春 130033

2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，吉林 長(zhǎng)春 130112

三七Panax notoginseng(Burk.) F.H.Chen 為五加科人參屬植物，已有600年以上的藥用歷史，是我國(guó)名貴中藥材。由于療效確切、效果顯著，近些年來(lái)三七的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，受到不少重視養(yǎng)生、健身人士的追捧。但遺憾的是三七一直未能進(jìn)入“藥食同源”目錄，三七產(chǎn)業(yè)發(fā)展遭遇了政策瓶頸?！吨袊?guó)藥典》規(guī)定三七的藥用部位為根和根莖[1]，三七花（Panax notoginsengflower）作為三七的副產(chǎn)物，一直未能得到有效的開(kāi)發(fā)與利用?？上驳氖窃?016年云南省衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)正式批準(zhǔn)三七花可以按照當(dāng)?shù)靥赜械氖称吩线M(jìn)行管理，標(biāo)志著三七花正式進(jìn)入食品行業(yè)[2]。三七花中含有人參皂苷、維生素、氨基酸等多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中人參皂苷是三七花中的主要有效成分[3-6]。根據(jù)結(jié)構(gòu)不同，人參皂苷可分為達(dá)瑪烷型和齊墩果酸型。其中，達(dá)瑪烷型中四環(huán)三萜類人參皂苷分為原人參二醇型皂苷［如人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rd（Rb1、Rb2、Rc、Rd）］和原人參三醇型皂苷［如人參皂苷Re、Rg1（Re、Rg1）］[7]。此外，還有一些次級(jí)人參皂苷，它們?cè)谠牧现泻亢艿停缛藚⒃碥?0(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5［20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5］等這些人參皂苷可以經(jīng)過(guò)一定的加工獲得，它們被稱為稀有人參皂苷[8]?，F(xiàn)有研究表明，稀有人參皂苷對(duì)一些疾病有顯著的療效，如對(duì)抑郁癥、糖尿病和炎癥疾病具有良好的藥理作用[9]，對(duì)肝癌、肺癌、胃癌等癌細(xì)胞的凋亡有顯著的影響[10]。隨著科學(xué)研究的深入，市場(chǎng)對(duì)稀有人參皂苷的需求正在增加，所以探尋一種高效綠色的稀有人參皂苷富集方法至關(guān)重要。

稀有人參皂苷可以通過(guò)蒸煮[11]、酸水解[12]、微生物降解和金屬離子催化[13-15]等手段來(lái)進(jìn)行富集。但這些方法既復(fù)雜又耗時(shí)，并對(duì)外源添加物的專屬性和反應(yīng)條件要求較高，容易造成環(huán)境污染。據(jù)報(bào)道，天冬氨酸可通過(guò)降解原人參二醇組總皂苷來(lái)獲得稀有人參皂苷[16]。但這種轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)原材料要求較高，轉(zhuǎn)化方法復(fù)雜、成本高，不適用于工業(yè)化生產(chǎn)。而三七花中皂苷含量豐富，位居三七各部位首位[17-18]，但關(guān)于三七花中稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)研究了氨基酸種類、氨基酸濃度、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間和液固比對(duì)三七花中稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響。并進(jìn)一步比較了轉(zhuǎn)化前、后三七花提取物對(duì)脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞抗炎活性的影響，以期為三七花的開(kāi)發(fā)利用提供新的思路。

1 材料

1.1 材料和試劑

三七花，購(gòu)自云南省文山市三七藥業(yè)批發(fā)行，經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)李偉教授鑒定為五加科人參屬植物三七P.notoginseng(Burk.) F.H.Chen 的干燥花（4年生）；RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院細(xì)胞中心提供；對(duì)照品精氨酸（Arg，批號(hào)1008J033）、組氨酸（His，批號(hào)816L031）、天冬氨酸（Asp，批號(hào)1784M052）、谷氨酸（Glu，批號(hào)1005L047）和賴氨酸（Lys，批號(hào)2395H145），北京索萊寶科技有限公司；對(duì)照品人參皂苷20(S)-Rg3（批號(hào)Z15D8X50607 ）、 20(R)-Rg3（批號(hào)YA0417YA14）、Rk1（批號(hào)P20N6F6254）、Rg5（批號(hào)P26N7F25707）、Rg1（批號(hào)Z13O8L45576）、Re（批號(hào)H15M6X1）、Rb1（批號(hào)Z16J9X52719)、Rb2（批號(hào)P25D8F51140）、Rc（批號(hào)Z10J6B1）、Rd（批號(hào)Z13O8L45576）、LPS（批號(hào)S18A9168132），質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%，上海源葉生物科技有限公司；乙腈和甲醇，色譜純，美國(guó)Fisher 公司；DMEM 培養(yǎng)基、胎牛血清和PBS，Gibco 公司；CCK-8，日本同仁有限公司；NO 試劑盒，碧云天試劑公司；IL-6 ELISA 試劑盒，愛(ài)博泰克生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BioTek Epoch2 酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰儀器有限公司；Acquity UPLC H-Class 超高效液相色譜儀，PDA檢測(cè)器，英國(guó)Waters 公司；EX125D2H 電子天平，奧豪斯儀器（常州）有限公司；GZX-9140 MBE 數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；C18Sep-Pak?SPE 液相色譜柱，愛(ài)爾蘭賽分科技公司；Milli-Q Advantage A1 超純水機(jī)，美國(guó)密理博公司；0.22 μm 有機(jī)系針頭式過(guò)濾器，天津市津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；LDZM-40KCS-II 立式壓力蒸汽滅菌器，上海申安醫(yī)療器械廠；SW-CJ-2FD 超凈工作臺(tái)，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；CO2培養(yǎng)箱，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；7A07015 顯微鏡，奧林巴斯（中國(guó)）有限公司；TGL-16G 醫(yī)用離心機(jī)，湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司；Alpha 1-4LD plus 凍干機(jī)，德國(guó)Christ 公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 原材料處理

取三七花60 ℃烘干、粉碎過(guò)60 目不銹鋼篩網(wǎng)獲得原藥材粉末，放于陰涼干燥處，備用。

2.2 人參皂苷的測(cè)定

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5各5 mg 于5 mL 量瓶中，甲醇溶解并定容；配制成混合對(duì)照品母液。準(zhǔn)確吸取0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL 于5 mL 量瓶中，定容，-20 ℃條件下儲(chǔ)存。

2.2.2 供試品溶液的制備 取各反應(yīng)后的上清液，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，收集濾液，作為供試品溶液，待上機(jī)分析。

2.2.3 色譜條件 色譜柱為Acquity UPLC?BEH C18柱（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動(dòng)相為水-乙腈，梯度洗脫程序：0～5.8 min，13%～22%乙腈；5.8～18.75 min，22%～38%乙腈；18.75～22.05 min，38%～40%乙腈；22.05～23.55 min，40%～45%乙腈；23.55～24.25 min，45%～58%乙腈；24.25～30.00 min，58%～62%乙腈；30.00～30.75 min，62%～80%乙腈；30.75～37.75 min，80%～100%乙腈；37.75～40 min，0%～87%水；柱溫35 ℃；體積流量0.4 mL/min；進(jìn)樣量3 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)203 nm。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y）、對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程、相關(guān)系數(shù)（R2）和線性范圍分別為20(S)-Rg3Y＝3.31×106X－2.18×104，R2＝0.999 4，線性范圍20.2～323.2 μg/mL；20(R)-Rg3Y＝2.26×106X－1.30×104，R2＝0.999 4，線性范圍20.6～329.6 μg/mL；Rk1Y＝4.72×106X－114，R2＝0.999 3，線性范圍20.8～332.8 μg/mL；Rg5Y＝8.66×106X－4.82×104，R2＝0.999 3，線性范圍20.6～329.6 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一質(zhì)量濃度的混合對(duì)照品溶液3 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，連續(xù)進(jìn)樣9 次，測(cè)定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5峰面積的RSD 分別為1.88%、2.33%、1.67%、2.67%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一轉(zhuǎn)化后三七花提取液樣品6 份，精密吸取6 份供試品溶液3 μL，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的峰面積，通過(guò)回歸方程計(jì)算轉(zhuǎn)化后三七花樣品中20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量及RSD。結(jié)果表明20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5質(zhì)量濃度的RSD 分別為1.64%、1.33%、2.68%、1.44%，表明本實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取轉(zhuǎn)化后三七花提取液樣品3 μL，分別在0、2、4、8、16、24 h 按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5峰面積的RSD 值分別為2.68%、1.73%、2.47%、2.39%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取轉(zhuǎn)化后三七花提取液樣品6 份，加入適量的20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5對(duì)照品，按照“2.2.2”項(xiàng)下方法操作，按“2.2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定得到4 種人參皂苷的平均加樣回收率分別為99.74%、99.83%、98.35%、99.64%，RSD 分別為3.25%、2.87%、2.31%、3.89%，表明加樣回收率良好。

2.3 數(shù)據(jù)處理

用GraphPad Prism 5 軟件分析數(shù)據(jù)，所有數(shù)據(jù)均采用±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析，P＜0.05 為顯著性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 氨基酸種類對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量的影響

選擇5 種氨基酸分別與三七花粉末進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)條件參考文獻(xiàn)報(bào)道[19]，即氨基酸濃度為5%，反應(yīng)時(shí)間為1 h，液固比為20 mL/g，反應(yīng)溫度為120 ℃。使用UPLC 測(cè)定20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量，所有樣品重復(fù)3 次。2 種酸性氨基酸和3 種堿性氨基酸對(duì)4 種稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響如表1 所示，Asp、Glu、His、Lys 和Arg 對(duì)稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量依次減弱，其中，酸性氨基酸對(duì)稀有人參皂苷群的轉(zhuǎn)化含量顯著高于堿性氨基酸（P＜0.05）。Asp 和Glu 對(duì)4 種稀有人參皂苷的總轉(zhuǎn)化含量分別為（28.90±0.45）mg/g 和（27.56±0.48）mg/g。這與夏娟[15]的研究結(jié)果一致。與孫成鵬等[13]報(bào)道的檸檬酸轉(zhuǎn)化稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量相比，可提高1.28 倍，因此最終選定Asp 作為最佳催化劑。

2.5 反應(yīng)條件優(yōu)化

考察了反應(yīng)溫度（80、90、100、110、120 ℃）、Asp 濃度（1%、3%、5%、10%、20%）、液固比（10、20、30、40、50 mL/g）和反應(yīng)時(shí)間（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）對(duì)稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5轉(zhuǎn)化含量的影響。根據(jù)上述單因素試驗(yàn)的結(jié)果，設(shè)計(jì)了4 因素3 水平的正交試驗(yàn)對(duì)提取工藝進(jìn)一步優(yōu)化，所有樣品重復(fù)3 次。

表1 不同氨基酸種類對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 1 Effects of different amino acids on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表1 不同氨基酸種類對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 1 Effects of different amino acids on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標(biāo)含相同字母表示無(wú)顯著性差異，否則表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the same letter means that there is no significant difference,otherwise it means that there is a significant difference (P < 0.05)

氨基酸 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量His 1.68±0.12 1.35±0.11 2.80±0.06 0.54±0.02 6.37±0.08c Lys 1.06±0.04 0.70±0.04 1.49±0.15 0.22±0.04 3.47±0.07d Glu 10.40±0.77 3.87±0.33 6.12±0.42 7.17±0.47 27.56±0.48b Asp 10.71±0.77 3.34±0.32 6.27±0.45 8.58±0.26 28.90±0.45a Arg 0.95±0.09 0.67±0.07 1.40±0.04 0.20±0.02 3.22±0.08d

2.5.1 反應(yīng)溫度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量的影響研究表明，鮮人參加工為紅參的過(guò)程中，稀有人參皂苷的含量會(huì)明顯增加，表明溫度是影響稀有人參皂苷形成的重要因素。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果（表2）表明，隨著溫度的升高，4 種稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量呈現(xiàn)逐漸升高又下降的趨勢(shì)。在110 ℃時(shí)，4 種稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的轉(zhuǎn)化含量最高，分別為（11.08±0.88）、（3.63±0.60）、（6.63±0.52）、（8.06±0.38）mg/g，與其他組比較有顯著性差異（P＜0.05）。因此，最終選定110 ℃作為最優(yōu)的反應(yīng)溫度。

2.5.2 Asp 濃度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量的影響本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明（表3），隨氨基酸濃度的增加（1%～5%），稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量隨Asp 濃度增加而增加。在5%時(shí)稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量達(dá)到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.49±1.15）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，并與其他組比較有顯著性差異（P＜0.05）。當(dāng)氨基酸濃度超過(guò)5%時(shí)，稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量逐漸減少。因此，最終選定Asp 最適宜的濃度為5%。

表2 不同溫度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 2 Effects of different temperatures on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

表2 不同溫度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 2 Effects of different temperatures on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

上標(biāo)含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

溫度/℃ 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量80 0.46±0.02 0.36±0.01 0.23±0.01 0.23±0.01 1.29±0.01e 90 1.12±0.20 1.12±0.06 0.72±0.04 0.77±0.04 3.73±0.08d 100 2.60±0.07 2.27±0.05 1.41±0.16 2.17±0.01 8.50±0.70c 110 11.08±0.88 3.63±0.60 6.63±0.52 8.06±0.38 29.41±0.59a 120 5.95±3.20 2.72±0.53 3.50±1.94 4.16±2.27 16.33±2.08b

表3 不同Asp 濃度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 3 Effect of different Asp addition on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表3 不同Asp 濃度對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 3 Effect of different Asp addition on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標(biāo)含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

ASP 濃度/% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量1 6.39±0.11 4.00±0.06 3.83±0.09 4.09±0.19 18.31±0.11e 3 11.08±0.88 3.63±0.60 6.62±0.52 8.06±0.38 29.41±0.59c 5 15.49±1.15 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.95±0.80a 10 12.61±0.64 2.32±0.01 7.78±0.29 7.78±0.29 30.49±0.31b 20 8.53±0.24 1.47±0.50 5.51±0.70 6.75±0.26 22.27±0.16d

2.5.3 液固比對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量的影響液固比對(duì)稀有人參皂苷群轉(zhuǎn)化的影響如表4 所示，隨著液固比的增加，稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在20 mL/g 時(shí)轉(zhuǎn)化含量達(dá)到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.48±1.15）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，且顯著高于其他組的轉(zhuǎn)化含量（P＜0.05）。最終選定最適宜的液固比為20 mL/g。

2.5.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化含量的影響反應(yīng)時(shí)間對(duì)稀有人參皂苷的影響如表5 所示。稀有人參皂苷的含量隨反應(yīng)時(shí)間的增加而逐漸增加。當(dāng)反應(yīng)2.0 h 時(shí)，4 種稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化含量達(dá)到最高，20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5分別為（15.49±0.64）、（3.77±0.57）、（9.51±0.98）、（11.17±0.52）mg/g，且顯著高于其他組（P＜0.05）。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間超過(guò)2.0 h 后，稀有人參皂苷的總量沒(méi)有繼續(xù)增長(zhǎng)。這可能是因?yàn)殡S著反應(yīng)時(shí)間的增加，底物被不斷消耗，并且有效成分在達(dá)到最大值后有效碰撞減少，含量變化趨于平坦?？紤]未來(lái)規(guī)?；a(chǎn)，低能耗高產(chǎn)率的原則，最終選定2.0 h 為最佳反應(yīng)時(shí)間。

表4 不同液固比對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 4 Effect of different liquid-solid ratios on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

表4 不同液固比對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 4 Effect of different liquid-solid ratios on transformation of rare ginsenosides ( = 3)

上標(biāo)含不同字母表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the different letter means that there is a significant difference (P < 0.05)

液固比/(mL·g-1) 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量10 10.43±0.09 3.26±0.15 6.87±0.19 9.36±0.14 29.92±0.14e 20 15.48±1.15 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.94±0.80a 30 14.93±0.38 3.85±0.26 8.45±0.02 10.80±0.20 38.04±0.22b 40 14.36±0.58 3.94±0.08 8.22±0.15 10.54±0.23 37.06±0.25c 50 14.08±0.51 2.88±0.15 7.75±0.15 10.47±0.13 35.18±0.23d

表5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 5 Effects of different time on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

表5 不同反應(yīng)時(shí)間對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的影響 ( = 3)Table 5 Effects of different time on conversion of rare ginsenosides ( = 3)

上標(biāo)含相同字母表示無(wú)顯著性差異，否則表示有顯著性差異（P＜0.05）The superscript containing the same letter means that there is no significant difference,otherwise it means that there is a significant difference (P < 0.05)

反應(yīng)時(shí)間/h 質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(mg·g-1)20(S)-Rg3 20(R)-Rg3 Rk1 Rg5 總量0.5 6.43±0.11 4.05±0.16 3.95±0.18 4.25±0.21 18.53±0.25e 1.0 12.10±0.78 3.83±0.72 6.75±0.58 8.08±0.39 30.02±0.31c 1.5 10.43±1.15 3.25±0.15 6.88±0.20 9.36±0.14 29.92±0.14d 2.0 15.49±0.64 3.77±0.57 9.51±0.98 11.17±0.52 39.95±0.80a 2.5 14.93±0.24 3.85±0.26 8.45±0.02 10.80±0.20 38.04±0.22a 3.0 14.36±0.56 3.94±0.08 8.22±0.15 10.54±0.23 37.06±0.25b

2.5.5 正交試驗(yàn)結(jié)果 由于多個(gè)因素對(duì)稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化都存在一定的影響，優(yōu)化提取工藝是稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化的重要步驟。通過(guò)前期單因素試驗(yàn)結(jié)果，以反應(yīng)溫度（A）、Asp 濃度（B）、液固比（C）、反應(yīng)時(shí)間（D）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)置3 個(gè)水平，進(jìn)行采用L9(34)正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表6，方差分析見(jiàn)表7。由表6 可見(jiàn)，對(duì)稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化總轉(zhuǎn)化含量的影響因素大小排列為A＞C＞D＞B，最佳轉(zhuǎn)化條件是A3B2C3D2。由方差分析可知，溫度對(duì)轉(zhuǎn)化含量影響顯著，Asp 濃度、液固比、時(shí)間對(duì)轉(zhuǎn)化含量影響不顯著。因此最佳的轉(zhuǎn)化條件是溫度為120 ℃、Asp 濃度為5%、液固比為30 mL/g 和反應(yīng)時(shí)間為2.0 h。

表6 三七花中稀有人參皂苷轉(zhuǎn)化L9(34)正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 L9(34) orthogonal test results of conversion of rare ginsenosides from PNF

表7 正交試驗(yàn)方差分析Table 7 ANOVA of orthogonal test

2.6 結(jié)果驗(yàn)證

按照正交試驗(yàn)篩選出的最優(yōu)條件A3B2C3D2進(jìn)行驗(yàn)證，重復(fù)5 次，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化后4 種稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的轉(zhuǎn)化含量分別為（17.80±0.43）、（5.40±0.64）、（10.62±0.68）、（13.10±0.22）mg/g，平均的總轉(zhuǎn)化含量為（47.12±0.52）mg/g，表明本實(shí)驗(yàn)確定的稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化方法穩(wěn)定且轉(zhuǎn)化效率高。三七花皂苷轉(zhuǎn)化前后對(duì)比圖如圖1 所示。

2.7 轉(zhuǎn)化前后三七花提取物對(duì) LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞活力的影響

據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道，三七花對(duì)耳廓炎癥、滲出性炎癥以及小鼠或大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹、足腫脹等均有抑制作用[19-21]。并能顯著抗5-羥色胺、組胺及緩激肽所致大鼠皮膚毛細(xì)血管通透性增加，還可減少炎癥滲出物中的PGE 含量[22-23]。說(shuō)明三七花具有良好的消腫抗炎功效。而稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5對(duì)于炎癥反應(yīng)也有顯著抑制[24-25]。因此，對(duì)比轉(zhuǎn)化前后三七花提取物對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。

圖1 三七花轉(zhuǎn)化前 (a)、后 (b) 人參皂苷UPLC 對(duì)比圖Fig.1 UPLC comparison of PNF before (a) and after (b)ginsenoside transformation

RAW264.7 小鼠巨噬細(xì)胞用DMEM 培養(yǎng)基（含10%胎牛血清，鏈霉素和青霉素總含量為1%的雙抗）培養(yǎng)傳代，培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37 ℃、5% CO2。將RAW264.7 細(xì)胞以2×104/孔的密度接種于96 孔板上，培養(yǎng)24 h 后進(jìn)行分組處理，正常組：不做任何處理，正常培養(yǎng)12 h，炎癥模型組：1 μg/mL LPS持續(xù)刺激細(xì)胞12 h，轉(zhuǎn)化前后三七花提取液處理組：1 μg/mL LPS 和提取液（1.562、3.125、6.250、12.500、25.000、50.000、100.000、200.000 μg/mL）共同處理細(xì)胞12 h。12 h 后每孔加入10 μL CCK-8，孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度（A）值，計(jì)算增殖指數(shù)。

增殖指數(shù)＝A處理/A對(duì)照

由圖2 可知，與對(duì)照組相比，LPS 顯著促進(jìn)巨噬細(xì)胞的增殖（P＜0.05），與LPS 組相比，轉(zhuǎn)化后三七花提取物在質(zhì)量濃度為1.56～200 μg/mL，對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 的增殖具有顯著抑制作用（P＜0.05）。在質(zhì)量濃度≥6.250 μg/mL 時(shí)，與三七花提取物相比，轉(zhuǎn)化后三七花提取物更能顯著抑制LPS 引起RAW264.7 細(xì)胞的增殖（P＜0.05）。

2.8 轉(zhuǎn)化前后三七花提取物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞NO分泌的影響

圖2 三七花提取物轉(zhuǎn)化前后對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞吞噬活性的影響 ( = 3)Fig.2 Effect of PNF extract on phagocytic activity of RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

NO 在炎癥反應(yīng)過(guò)程中大量表達(dá)，是炎癥發(fā)病機(jī)制中的重要信使[26]。RAW264.7 細(xì)胞以8×104/孔的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，1 μg/mL LPS 刺激細(xì)胞2 h，1 μg/mL LPS 和提取液（1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）共同處理細(xì)胞12 h，收集細(xì)胞上清液，按NO 試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定細(xì)胞上清液中NO 的含量。

由圖3 可知，與對(duì)照組相比，模型組RAW264.7細(xì)胞NO 分泌水平顯著升高（P＜0.05）。轉(zhuǎn)化前三七花提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞中NO 具有顯著抑制作用的最低質(zhì)量濃度為3.125 μg/mL，而轉(zhuǎn)化后三七花提取物具有顯著抑制作用的最低質(zhì)量濃度為1.562 μg/mL。并且在相同質(zhì)量濃度中，轉(zhuǎn)化后三七花提取物更能顯著抑制 LPS 引起RAW264.7 細(xì)胞中NO 的分泌（P＜0.05）。

圖3 三七花提取物對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞NO 釋放量的影響 ( = 3)Fig.3 Effect of extract from PNF on release of NO from RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

2.9 轉(zhuǎn)化前后三七花提取物對(duì)RAW264.7 細(xì)胞白細(xì)胞介素-6 (IL-6) 分泌的影響

小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 在LPS 的誘導(dǎo)下會(huì)釋放出大量的促炎因子IL-6，細(xì)胞中促炎因子分泌的增加可加速炎癥的發(fā)展[27]。RAW264.7 細(xì)胞以8×104個(gè)/孔的密度接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，1 μg/mL LPS 刺激細(xì)胞2 h，1 μg/mL LPS 和提取液（1.56、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL）共同處理細(xì)胞12 h，收集細(xì)胞上清液，按IL-6 ELISA試劑盒說(shuō)明操作，測(cè)定細(xì)胞上清液中IL-6 的含量。

從如圖4 可以看出，模型組IL-6 的分泌顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）。與模型組相比，轉(zhuǎn)化前三七花提取物在質(zhì)量濃度大于3.125 μg/mL 時(shí)，可顯著抑制IL-6 的釋放（P＜0.05），而轉(zhuǎn)化后三七花提取物在質(zhì)量濃度大于1.56 μg/mL 時(shí)，就可以顯著抑制促炎因子IL-6 的釋放（P＜0.05）。在相同質(zhì)量濃度中，轉(zhuǎn)化后三七花提取物對(duì)IL-6 抑制率顯著高于轉(zhuǎn)化前三七花提取物（P＜0.05）。

圖4 三七花提取物對(duì)LPS 刺激RAW264.7 細(xì)胞IL-6 釋放量的影響 ( = 3)Fig.4 Effect of PNF extract on release of IL-6 from RAW264.7 cells stimulated by LPS ( = 3)

3 討論

本研究添加食品級(jí)氨基酸，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和正交試驗(yàn)探索了一種安全高效綠色的將三七花中原有人參皂苷轉(zhuǎn)化為稀有人參皂苷的方法。結(jié)果表明，添加Asp 可以顯著增加三七花中稀有人參皂苷20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rk1、Rg5的含量，這可能是因?yàn)锳sp 是酸性氨基酸，在熱裂解的條件下，較高濃度的H+和較多的二醇組皂苷顯著促進(jìn)了水解反應(yīng)的發(fā)生。人參二醇組皂苷在C-20 位的糖苷鍵斷裂生成中間產(chǎn)物20(S)-Rg3和20(R)-Rg3，再進(jìn)一步脫水水解成稀有人參皂苷Rk1和Rg5，這大大促進(jìn)了稀有人參皂苷的生成。

LPS 是全身炎癥反應(yīng)綜合癥的一種重要致病因子，可與巨噬細(xì)胞表面抗原識(shí)別受體相結(jié)合而刺激細(xì)胞[28-29]，繼而激活多條炎癥通路，產(chǎn)生一系列促炎因子，引起機(jī)體嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)[30-32]。適度的巨噬細(xì)胞增殖可提高機(jī)體抵御外界和修復(fù)機(jī)體損傷的能力，而過(guò)度刺激會(huì)引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡和機(jī)體損傷。因此本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用此炎癥模型對(duì)轉(zhuǎn)化后三七花與轉(zhuǎn)化前抗炎效果進(jìn)行比較，探究轉(zhuǎn)化后三七花的藥理作用。在轉(zhuǎn)化前后的三七花提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞活性、NO 的分泌和炎癥因子IL-6 的釋放量的影響進(jìn)行了考察中可以看出，與三七花提取物相比較，轉(zhuǎn)化后三七花提取物對(duì)LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)有更好的抑制作用（P＜0.05）。這有可能是因?yàn)橄∮性碥盏脑黾?，根?jù)文獻(xiàn)記載稀有人參皂苷 20(S)-Rg3、20(R)-Rg3可通過(guò)調(diào)節(jié)iNOS的表達(dá)抑制NO的產(chǎn)生，抑制LPS 或UV 照射誘導(dǎo)的細(xì)胞ROS 水平[24]；人參皂苷Rg5可以通過(guò)抑制LPS 與巨噬細(xì)胞Toll 樣受體（TLR）-4 結(jié)合而減輕肺部炎癥[33]；Rk1和Rg5對(duì)TNF-α/IFN-γ-和LPS 誘導(dǎo)的趨化因子和細(xì)胞因子的產(chǎn)生有明顯的抑制和下調(diào)作用，抑制這些介導(dǎo)因子的產(chǎn)生可降低LPS 誘導(dǎo)的RAW264.7 細(xì)胞NO 和ROS 的生成[25]。因此，稀有皂苷的增加可能是轉(zhuǎn)化后三七花對(duì)于LPS 誘導(dǎo)RAW264.7 細(xì)胞炎癥反應(yīng)有顯著抑制的原因。但其抗炎機(jī)理有待進(jìn)一步驗(yàn)證。本論文對(duì)稀有人參皂苷的轉(zhuǎn)化提供了新的綠色、安全和高效的轉(zhuǎn)化方法，為三七花的生產(chǎn)與利用提供了新的思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突