基于經(jīng)典人群口嘗法和電子舌法的中藥飲片水煎液苦度疊加規(guī)律研究

張 璞，張 耀，桂新景，施鈞瀚，張慧杰，馮文豪，李媛媛，王艷麗，張 璐，姚 靜，劉瑞新*，李學(xué)林*

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)，河南 鄭州 450008

2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院 藥學(xué)部，河南 鄭州 450000

3.國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥制劑三級(jí)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450000

4.河南省中藥飲片臨床應(yīng)用現(xiàn)代化工程研究中心，河南 鄭州 450000

5.河南中醫(yī)藥大學(xué)呼吸疾病中醫(yī)藥防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450000

苦味作為一種人體的主觀感受，其產(chǎn)生機(jī)制主要是苦味質(zhì)與味覺(jué)細(xì)胞中的苦味受體蛋白結(jié)合使其活化，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)變化，從而引發(fā)神經(jīng)細(xì)胞興奮，之后傳入大腦中的味覺(jué)神經(jīng)中樞，使人類感知苦味[1]。目前，關(guān)于苦味的相關(guān)研究不在少數(shù)，如對(duì)中藥苦味的物質(zhì)基礎(chǔ)研究[2-3]、苦味物質(zhì)與苦味表達(dá)的化學(xué)結(jié)構(gòu)研究[4]等，本課題組前期也對(duì)中藥的苦味進(jìn)行苦度的量化以及部分苦味單體化合物的疊加苦度規(guī)律進(jìn)行研究[5]，但對(duì)于苦味中藥水煎液的苦味疊加規(guī)律研究目前未見(jiàn)報(bào)道。

據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)門診處方中應(yīng)用湯劑約占50%[6]，經(jīng)組方配伍后一個(gè)方劑中往往含有多種苦味飲片[7]，經(jīng)水煎煮后味道繁雜，苦味強(qiáng)烈，難以下咽，嚴(yán)重影響了患者的服藥依從性，影響療效。研究中藥飲片的苦味疊加規(guī)律，可為復(fù)合湯劑呈味規(guī)律的發(fā)展以及針對(duì)性研究中藥掩味劑提供參考。因此，本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)經(jīng)典人群口嘗評(píng)價(jià)法（traditional human taste panel method，THTPM）以及電子舌法（electrionic tongue，E-tongue）開(kāi)展二元（2 種組分）、三元（3 種組分）疊加中藥飲片水煎液（decoction of Chinese materia medica，DCMM）的苦度疊加規(guī)律研究。

1 儀器與材料

1.1 儀器

BSA224S-CW 型萬(wàn)分之一電子天平、CP225D型十萬(wàn)分之一電子天平，德國(guó)Sartorius 公司；HK250型科導(dǎo)臺(tái)式超聲清洗器，上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；LCD-A200 型電子天平，福州華志科學(xué)儀器有限公司；HHS 型電熱恒溫水浴鍋，常州普天儀器制造有限公司；AM-5250B 型磁力攪拌器，天津奧特賽恩斯儀器有限公司；TS-5000Z 型電子舌，日本Insent 公司，本實(shí)驗(yàn)使用C00 傳感器、AN0 傳感器、BT0 傳感器、AE1 傳感器。

1.2 材料

鹽酸小檗堿，批號(hào)170406，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98.62%，四川省玉鑫藥業(yè)有限公司；水為純化水，自制；本實(shí)驗(yàn)用中藥飲片均經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院陳天朝主任藥師鑒定均合格，符合《中國(guó)藥典》2020年版規(guī)定，具體信息見(jiàn)表1。

2 方法

2.1 苦味參比液的質(zhì)量濃度選擇及制備

參照文獻(xiàn)報(bào)道[8-9]，將苦味分為5 個(gè)等級(jí)，每個(gè)等級(jí)對(duì)應(yīng)一定的苦度范圍，以不同質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿溶液作為苦味參比液對(duì)應(yīng)不同苦度等級(jí)，以THTPM 為苦度評(píng)價(jià)方法，以苦度值（Ⅰ）作為量化指標(biāo)，評(píng)價(jià)單味飲片待測(cè)樣品、二元疊加待測(cè)樣品、三元疊加待測(cè)樣品的苦度，中藥Ⅰ值定性定量范圍具體見(jiàn)表2。

表1 9 種中藥飲片信息Table 1 Information of nine kinds of Chinese medicines

表2 中藥苦度值 (Ⅰ) 的定性描述、等級(jí)及定量范圍Table 2 Qualitative description,grade and quantitative range of bitterness value (Ⅰ) of Chinese medicines

2.2 單味飲片待測(cè)樣品的制備及質(zhì)量濃度選擇

2.2.1 單味飲片待測(cè)樣品制備 根據(jù)韋伯-費(fèi)希納定律及本課題組前期研究成果[10]，并參考《中國(guó)藥典》2015年版[11]規(guī)定用量，稱取不同量中藥飲片制備單味待測(cè)樣品，將飲片置于適宜容器內(nèi)；加水600 mL，浸泡30 min，于電磁爐上加熱，功率2100 W；待沸騰后，功率改為800 W，煎煮30 min，濾過(guò)；二煎加水400 mL，煎煮20 min，余同一煎，合并濾液，混勻，冷卻至室溫，4000 r/min 離心15 min，取上清液至1 L 量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度，灌裝，壓蓋，滅菌（105 ℃流通蒸汽滅菌45 min），備用。

2.2.2 待測(cè)樣品質(zhì)量濃度選擇 根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版中飲片的推薦用量范圍進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，并結(jié)合韋伯-費(fèi)希納定律，設(shè)定樣品的質(zhì)量濃度（以生藥量計(jì)）梯度，具體如表3 所示。

表3 DCMM 待測(cè)樣品所選質(zhì)量濃度Table 3 Selected concentrations of samples to be tested

2.3 苦味疊加的均勻設(shè)計(jì)及樣品制備

以均勻設(shè)計(jì)法作為二元、三元疊加的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，以2 種、3 種飲片的共煎液作為二元、三元疊加的待測(cè)樣品。

2.3.1 二元疊加均勻設(shè)計(jì)及樣品制備 以生物堿類、萜類、糖苷類中藥作為因素，以6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度為6 水平，質(zhì)量濃度梯度同“2.2”項(xiàng)下，使用U6*(64)均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行2 因素6 水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。煎煮以黃連＋苦參二元疊加的待測(cè)樣品制備為例，取黃連0.5 g、苦參3 g 共同煎煮得1 L 待測(cè)液，其余同“2.2”項(xiàng)下制備方法，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表4。

表4 二元疊加U6*(64) 2 因素6 水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 4 Binary superposition U6*(64) 2-factor 6-level design

2.3.2 三元疊加均勻設(shè)計(jì)及樣品制備 以生物堿類、萜類、糖苷類作為因素，以6 個(gè)質(zhì)量濃度梯度為6 水平，使用U6*(64)均勻設(shè)計(jì)表進(jìn)行3 因素6 水平的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。煎煮方法同“2.2”項(xiàng)，具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表5。

表5 三元疊加U6*(64) 3 因素6 水平實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 5 Ternary superposition U6*(64) 3-factor 6-level design

2.4 THTPM 評(píng)價(jià)法

2.4.1 志愿者篩選 本研究經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查批準(zhǔn)后，對(duì)招募的志愿者進(jìn)行了包括苦味敏感度等在內(nèi)的篩選（倫理號(hào)：2017HL-066-03）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）因苦味感受隨著年齡的升高而降低，故選擇20歲左右成年人[12]；（2）無(wú)嚴(yán)重過(guò)敏史、遺傳病史，無(wú)膽囊炎，無(wú)不良嗜好，且近期無(wú)疾病史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）最近2 d曾飲酒或吸煙者；（2）心態(tài)過(guò)于緊張者；（3）口嘗檸檬黃水溶液覺(jué)得有苦味的志愿者；（4）品嘗溶液前3 h 進(jìn)食（尤其是刺激性食物）者。本研究最終選擇健康志愿者21 名（男性5 名、女性16 名）。上述志愿者均知情同意并簽署了知情同意書(shū)。

2.4.2 志愿者口嘗評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn) 具體參照文獻(xiàn)方法[5]，分別取20 mL，37 ℃下表2 中各質(zhì)量濃度的鹽酸小檗堿參比溶液于口嘗杯中，由志愿者含于口中，計(jì)時(shí)15 s，在口腔進(jìn)行漱口動(dòng)作，目的是使舌根及舌側(cè)苦味的感受區(qū)域能夠感知樣品的苦味，根據(jù)表2 的描述對(duì)比記憶參比溶液的Ⅰ分級(jí)和具體Ⅰ值，吐出后用蒸餾水漱口至少3 次，直至口腔中不再有苦味感受，15 min 后測(cè)定另一質(zhì)量濃度的參比溶液，最終完成苦味的標(biāo)準(zhǔn)化感官記憶。

2.4.3 待測(cè)樣品組的口嘗評(píng)價(jià) 待測(cè)樣品組具體的口嘗操作要求同標(biāo)準(zhǔn)化培訓(xùn)，口嘗后記錄樣品的Ⅰ等級(jí)及Ⅰ值。

2.5 E-tongue 評(píng)價(jià)法

2.5.1 電子舌參比液制備

（1）正極清洗液配制：準(zhǔn)確稱量7.46 g 氯化鉀，500 mL 蒸餾水?dāng)嚢枞芙猓缓鬁?zhǔn)確加入300 mL 無(wú)水乙醇，邊攪拌邊加入準(zhǔn)確稱量的0.56 g 氫氧化鉀，溶解完畢后，轉(zhuǎn)移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（2）負(fù)極清洗液配制：準(zhǔn)確量取300 mL 無(wú)水乙醇，與500 mL 蒸餾水震蕩混合，然后加入8.3 mL濃鹽酸攪拌混合，轉(zhuǎn)移到1000 mL 量瓶中，定容，即得。

（3）參比液配制：準(zhǔn)確稱量2.24 g 氯化鉀和0.045 g 酒石酸，取適量蒸餾水溶解并轉(zhuǎn)移至1000 mL 量瓶中，定容，即得。

2.5.2 電子舌測(cè)試方法 首先將傳感器在清洗液中清洗90 s，接著用參比液清洗120 s、繼續(xù)用另一參比液清洗120 s，傳感器在平衡位置歸零30 s，達(dá)到平衡條件后，開(kāi)始測(cè)試，樣品測(cè)試時(shí)間30 s，輸出先味值；后在2 組參比液中分別短暫清洗3 s，傳感器插入新的參比液中測(cè)試回味30 s，循環(huán)測(cè)試4次，去掉第1 次循環(huán)，取后3 次平均數(shù)據(jù)作為測(cè)試結(jié)果。

2.5.3 電子舌傳感器選擇 TS-5000Z 型電子舌共有C00、AN0、BT0、AE1、GL1、CA0、CT0 7 根傳感器，其中C00 和AE1 傳感器有前、后2 種苦味信息，稱為先味和回味，而AN0 和BT0 傳感器只輸出回味值。因此本實(shí)驗(yàn)選取跟苦味有關(guān)的4 根傳感器，分別為C00、AN0、BT0、AE1 傳感器，共輸出6 種味覺(jué)信息值，具體如表6。

表6 傳感器味覺(jué)信息Table 6 Sensor taste information

2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

2.6.1 異常值處理 本實(shí)驗(yàn)由志愿者進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，由于人的主觀性及個(gè)體差異，可能造成不同志愿者之間的苦味評(píng)價(jià)結(jié)果存在差異，實(shí)際測(cè)試中個(gè)別數(shù)據(jù)會(huì)偏離整體水平，但又不能作為異常值直接予以剔除，因此參照文獻(xiàn)采用Grubbs 檢驗(yàn)法[13]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值的循環(huán)檢驗(yàn)和剔除。每組數(shù)據(jù)每輪僅剔除1 個(gè)異常值，進(jìn)行多輪的循環(huán)檢驗(yàn)剔除。此外，測(cè)試數(shù)據(jù)值過(guò)大和過(guò)小均有可能成為異常值，因此采用雙側(cè)檢驗(yàn)進(jìn)行剔除[14]，本實(shí)驗(yàn)選擇檢出水平為0.1、剔除水平為0.05。

2.6.2 模型構(gòu)建 本實(shí)驗(yàn)在單味苦味DCMM 的研究基礎(chǔ)上，探索不同苦味DCMM 二元、三元相互疊加規(guī)律，構(gòu)建二元、三元疊加DCMM 的疊加苦度-質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)（IZ-lnC）、疊加苦度-疊加前分苦度（IZ-I）、口嘗疊加苦度-電子舌疊加苦度（IZo-IZe）擬合模型。

單元構(gòu)建模型：I＝f1(C)＝β[1－e-(C－α)m/k]，I＝f2(C)＝alnC＋b，其中，C表示質(zhì)量濃度，a、b、α、β、m、k為待定參數(shù)。

二元、三元構(gòu)建模型：IZ＝f3(lnC1,…lnCn)，IZ＝f4(I1,…In)，IZo＝f5(IZe)，其中，C表示疊加前各組分質(zhì)量濃度，lnC表示疊加前各組分質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù)，Ⅰ表示疊加前各組分苦度，IZ表示疊加苦度，IZo表示口嘗疊加苦度，IZe表示電子舌疊加苦度，n＝2或3。

用SPSS 22.0 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元線性回歸分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。擬合過(guò)程中如果曲線形式可表示為X的某種變換形式與Y的線性關(guān)系，即“曲線直線化”[15]，擬合度應(yīng)以調(diào)整后的R2為準(zhǔn)，故結(jié)果中R2均為調(diào)整后R2，用Rc2表示。

2.6.3 貢獻(xiàn)率判斷標(biāo)準(zhǔn) 本實(shí)驗(yàn)擬合方程為二次多項(xiàng)式或近似結(jié)構(gòu)的模型，各組分對(duì)疊加后Ⅰ的貢獻(xiàn)率判斷方法如下：（1）同次項(xiàng)以標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)分析組分對(duì)疊加后Ⅰ的貢獻(xiàn)率；（2）一次項(xiàng)與二次項(xiàng)同時(shí)存在，則根據(jù)變量取值范圍并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)綜合分析。

3 結(jié)果

3.1 THTPM 結(jié)果

3.1.1 異常值剔除結(jié)果 對(duì)口嘗實(shí)驗(yàn)的苦度測(cè)試結(jié)果進(jìn)行異常值相關(guān)檢驗(yàn)，查Grubbs 臨界值Gp(n)表，對(duì)25 組（2483 個(gè)）數(shù)據(jù)進(jìn)行循環(huán)檢驗(yàn)剔除，剩余數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)剔除后不再補(bǔ)充測(cè)試，以剔除后剩余的每組的平均值作為最終測(cè)試的I值。25 組樣品共剔除43 個(gè)異常值。

3.1.2 單味DCMM 口嘗苦度（Io）與質(zhì)量濃度（C）的關(guān)系 根據(jù)韋伯-費(fèi)希納定律，以單味飲片質(zhì)量濃度C作為自變量，口嘗苦度Io為因變量，對(duì)9 種單味DCMM 進(jìn)行Io-C擬合，其威布爾、對(duì)數(shù)方程的擬合結(jié)果如表7 所示。其中，威布爾方程整體上優(yōu)于對(duì)數(shù)方程，因此采用威布爾模型作為一元口嘗苦度的擬合模型。整體而言，3 種類型的單味DCMM的口嘗苦度均隨質(zhì)量濃度的增加而增加。

表7 單味DCMM 質(zhì)量濃度 (C) 與口嘗苦度 (Io) 的擬合模型結(jié)果 (n = 6)Table 7 Fitting model results of concentration (C) and bitterness (Io) of single-flavor DCMM (n = 6)

圖1 二元疊加口嘗苦度 (IZo) 與 質(zhì)量濃度 (C) 的三維圖Fig.1 Three-dimensional graph of binary superposition of bitterness (IZo) and concentration (C)

3.1.3 口嘗疊加苦度的均勻設(shè)計(jì)回歸分析

（1）二元疊加實(shí)驗(yàn)：對(duì)“2.3.1”項(xiàng)下6 組二元疊加實(shí)驗(yàn)樣品進(jìn)行口嘗測(cè)定，其中3 組為同類型疊加，以每組中各飲片水煎液質(zhì)量濃度C、疊加后口嘗苦度IZo進(jìn)行繪圖，結(jié)果見(jiàn)圖1。

采用多元線性回歸法擬合疊加苦度IZo與lnC的最佳回歸方程，結(jié)果如表8 所示。其中，擬合度Rc2≥0.875，P＜0.01，擬合方程類型為二次多項(xiàng)式或其近似結(jié)構(gòu)。根據(jù)單味DCMM 質(zhì)量濃度可以很好地?cái)M合出疊加DCMM 口嘗苦度的預(yù)測(cè)方程。

表8 二元疊加DCMM 口嘗苦度 (IZo) 與單味DCMM 質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù) (lnC) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 8 Best-fitting equation of binary superposition DCMM bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC) of single-flavor DCMM (n = 6)

根據(jù)二元疊加DCMM 口嘗結(jié)果，擬合二元疊加DCMM 口嘗苦度IZo與單味DCMM 口嘗苦度Io關(guān)系的最佳回歸方程（表9）。其中，5 組方程P＜0.01，Rc2≥0.868，結(jié)果表明，根據(jù)單味DCMM 的口嘗苦度可以很好地?cái)M合出疊加DCMM 的口嘗苦度預(yù)測(cè)方程。

（2）三元疊加實(shí)驗(yàn)：根據(jù)10 組三元疊加DCMM的口嘗結(jié)果，采用多元線性回歸法擬合疊加DCMM苦度IZo與lnC的最佳回歸方程（表10），共9 組，其中6 組P＜0.01，Rc2≥0.871，但黃芩＋連翹＋野菊花未擬合出有意義的最佳方程。

根據(jù)三元疊加DCMM 口嘗結(jié)果，擬合三元疊加DCMM 口嘗苦度IZo與單味DCMM 口嘗苦度Io關(guān)系最佳回歸方程（表11）。共得到9 組有效方程，Rc2≥0.659，P＜0.05，但黃芩＋連翹＋野菊花組未得到有顯著性意義的擬合方程。

在二元、三元疊加中，IZ-lnC、IZ-I共得到30組有意義的擬合方程，P＜0.05，其中23 組擬合方程P＜0.01，Rc2≥0.855，即單味DCMM 的質(zhì)量濃度與口嘗苦度可以很好地?cái)M合出疊加DCMM 口嘗苦度的預(yù)測(cè)方程。

綜合標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程的系數(shù)以及在一定范圍內(nèi)各組分飲片質(zhì)量濃度或苦度對(duì)疊加后苦度影響程度分析發(fā)現(xiàn)，三元疊加中苦參＋黃柏＋苦楝皮組由于各組分取值范圍部分重疊，且IZ-lnC、IZ-I擬合方程中一次項(xiàng)與二次項(xiàng)同時(shí)存在，在變量取值范圍內(nèi)分析各組分變化率發(fā)現(xiàn)，IZ-lnC中當(dāng)黃柏質(zhì)量濃度C黃柏＞15.34 g/L 時(shí)黃柏貢獻(xiàn)率較大，反之則苦參貢獻(xiàn)度大，IZ-I中當(dāng)黃柏苦度I黃柏＜2.6 時(shí)苦參影響較大、I黃柏＞2.6 時(shí)黃柏影響較大；各組別中組分1 對(duì)IZ的貢獻(xiàn)度最大，其中14 組最佳擬合方程只與一個(gè)組分相關(guān)，且組別中出現(xiàn)黃連時(shí)黃連對(duì)疊加后苦度的貢獻(xiàn)率往往大于其余組分；多類型疊加中黃連、穿心蓮、龍膽的苦味貢獻(xiàn)度均高于同組其他飲片。

表9 二元疊加DCMM 口嘗苦度 (IZo) 與單味DCMM 苦度 (Io) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 9 Best-fitting equation of binary superposition DCMM bitterness (IZo) and single-flavor DCMM bitterness (Io) (n = 6)

表10 三元疊加口嘗苦度 (IZo) 與質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù) (lnC) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 10 Best fitting equation of ternary superposition bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC) (n = 6)

表11 三元疊加DCMM 口嘗苦度 (IZo) 與單味DCMM 苦度 (Io) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 11 Best fitting equation of ternary superposition DCMM tongue bitterness (IZo) and single-flavor DCMM bitterness (Io)(n = 6)

3.2 電子舌法結(jié)果

以質(zhì)量濃度對(duì)數(shù)為自變量，以6 根傳感器的響應(yīng)值為因變量，收集25 組電子舌苦度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，全部樣品的B-bitterness2 味覺(jué)信息響應(yīng)值都很高并且能區(qū)分出不同質(zhì)量濃度，其次是澀味味覺(jué)信息值和苦味味覺(jué)信息值。龍膽的味覺(jué)信息響應(yīng)值在所有飲片中最低。黃連和黃柏的H-bitterness 味覺(jué)信息響應(yīng)值較大，但是對(duì)其余6 味藥的響應(yīng)及質(zhì)量濃度區(qū)分都較小，因此著重分析 25 組樣品的B-bitterness2、澀味和苦味味覺(jué)信息值。因篇幅原因，此處以黃連、穿心蓮和龍膽為示例，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 黃連、穿心蓮、龍膽的電子舌傳感器靈敏度以及苦度結(jié)果Fig.2 Sensitivity and bitterness results of electronic tongue sensors of CR,AH and GRR

3.2.1 單味DCMM 電子舌苦度Ie與質(zhì)量濃度C關(guān)系 采用規(guī)劃求解建立威布爾和對(duì)數(shù)的單味DCMM質(zhì)量濃度和電子舌苦度的擬合模型。根據(jù)對(duì)電子舌傳感器響應(yīng)值的分析，本實(shí)驗(yàn)只針對(duì)3 種傳感器結(jié)果進(jìn)行擬合，共計(jì)27 組數(shù)據(jù)，最終擬合出24 組有顯著性意義的方程，其中，威布爾方程擬合度明顯優(yōu)于對(duì)數(shù)方程，因此采用威布爾模型作為一元電子舌苦度的擬合模型。具體見(jiàn)表12。其中，生物堿類飲片黃連、黃柏的苦味味覺(jué)信息響應(yīng)值隨質(zhì)量濃度增加而降低，其余各單味DCMM 的電子舌傳感器味覺(jué)信息響應(yīng)值均隨質(zhì)量濃度的增加而增加。

3.2.2 電子舌疊加苦度均勻設(shè)計(jì)回歸分析結(jié)果

（1）二元疊加電子舌苦度結(jié)果：根據(jù)二元疊加DCMM 電子舌結(jié)果，擬合疊加樣品電子舌苦度IZo與lnC最佳回歸方程，如表13 所示。共擬合出18組方程，Rc2≥0.756，P＜0.05，其中15 組方程P＜0.01，Rc2≥0.837。

根據(jù)二元疊加DCMM 電子舌測(cè)定結(jié)果，擬合二元疊加DCMM 電子舌苦度IZe與單味DCMM 電子舌苦度Ie關(guān)系最佳回歸方程，結(jié)果如表14 所示。共得到18 組最佳擬合方程，其中13 組方程擬合度Rc2≥0.864，P＜0.01，表明單味DCMM 的電子舌苦度可以擬合出二元疊加DCMM 電子舌苦度的預(yù)測(cè)方程。

表12 單味DCMM 電子舌苦度 (IZo) 與質(zhì)量濃度 (C) 的擬合模型結(jié)果 (n = 6)Table 12 Fitting model results of single-flavor DCMM electronic tongue bitterness (IZo) and concentration (C) (n = 6)

表13 二元疊加DCMM 電子舌苦度 (IZo) 與質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù) (lnC) 的擬合方程 (n = 6)Table 13 Fitting equation of binary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZo) and concentration logarithm (lnC)(n = 6)

（2）三元疊加DCMM 電子舌結(jié)果：根據(jù)三元疊加混合樣品電子舌苦度測(cè)定結(jié)果，采用多元線性回歸法擬合疊加DCMM 苦度IZe與lnC的最佳回歸方程。如表15 所示，共計(jì)27 組有顯著性差異方程（P＜0.05）。其中，14 組方程P＜0.01，Rc2≥0.853。

根據(jù)三元疊加DCMM 電子舌結(jié)果，擬合三元疊加DCMM 電子舌苦度IZe與單味DCMM 電子舌苦度Ie關(guān)系最佳回歸方程。共得到25 組有顯著性差異方程，其中14 組擬合方程P＜0.01，Rc2≥0.925，黃芩＋連翹＋野菊花組均未得到有顯著性意義的擬合方程。結(jié)果如表16 所示。

在二元、三元疊加中，IZe-lnC、IZe-I共96 組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，通過(guò)多元線性回歸進(jìn)行分析，共88 組得到了有效的最佳擬合方程，P＜0.05，其中56 組擬合方程P＜0.01，Rc2≥0.853，表明單味DCMM 的質(zhì)量濃度與電子舌苦度可以很好地?cái)M合出疊加DCMM 的電子舌苦度預(yù)測(cè)模型。36 組最佳擬合模型中僅與組別中某一組分相關(guān)，28 組模型與組別中所有組分均相關(guān)。

綜合標(biāo)準(zhǔn)化回歸方程的系數(shù)以及在一定范圍內(nèi)各組分飲片質(zhì)量濃度或苦度對(duì)疊加后苦度影響程度分析發(fā)現(xiàn)，二元疊加中黃連＋苦參組IZ-lnC的澀味信息擬合方程中當(dāng)C苦參＞4.3 時(shí)苦參貢獻(xiàn)度高于黃連；穿心蓮＋野菊花組的B-bitterness2 信息擬合方程中在穿心蓮質(zhì)量濃度范圍內(nèi)穿心蓮貢獻(xiàn)度較大，當(dāng)野菊花質(zhì)量濃度取值高于穿心蓮范圍時(shí)野菊花貢獻(xiàn)度較大；在澀味信息擬合方程中當(dāng)C野菊花＞15.93時(shí)野菊花貢獻(xiàn)度高于穿心蓮，反之則穿心蓮影響較大；三元疊加中黃芩＋連翹＋野菊花組B-bitterness2信息擬合方程中當(dāng)C野菊花＞38.28 時(shí)野菊花貢獻(xiàn)度較高，反之則黃芩影響較大；澀味信息擬合方程中當(dāng)C野菊花＞24.92 時(shí)野菊花貢獻(xiàn)度較高，反之則黃芩影響較大；而IZe-Ie中I野菊花＞7.33 時(shí)野菊花貢獻(xiàn)度較高，反之則黃芩影響較大；含有S1 的組別中，S1對(duì)疊加后苦度影響更大；同類型疊加中苦味貢獻(xiàn)最大的分別是黃連、穿心蓮、黃芩；不同類疊加中生物堿類的苦味貢獻(xiàn)度較高。

表14 二元疊加DCMM 電子舌苦度 (IZe) 與單味DCMM 苦度 (Ie) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 14 Best fitting equation of binary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and single-flavor DCMM bitterness (Ie) (n = 6)

3.3 口嘗法與電子舌法苦度對(duì)比模型建立

根據(jù)樣品測(cè)試結(jié)果，結(jié)合回歸分析，能夠得到單味飲片、二元疊加、三元疊加的口嘗苦度和電子舌苦度之間的最佳擬合模型為線性模型或?qū)?shù)模型。以電子舌苦度Ie為自變量，以口嘗苦度Io為因變量，擬合電子舌苦度Ie與口嘗苦度Io關(guān)系回歸方程，并構(gòu)建擬合模型。

從IZo-IZe的結(jié)果（表17～19）來(lái)看，27 組單味DCMM 苦度數(shù)據(jù)得到24 個(gè)有意義的線性方程（P＜0.05），91.67%的擬合度Rc2≥0.800；18 組二元疊加DCMM 苦度數(shù)據(jù)，共8 個(gè)有意義的線性方程（P＜0.05），75%的擬合度Rc2≥0.800；30 組三元疊加DCMM 苦度數(shù)據(jù)，共13 個(gè)有意義方程，方程類型為線性或?qū)?shù)方程（P＜0.05），69.23%的擬合度Rc2≥0.800。

25 組樣品共75 組數(shù)據(jù)，其中，S1、T3、G3、S1＋S2、T1＋G1、T3＋T2＋G3 6 組樣品整體擬合效果最優(yōu)，而G1＋G3、S1＋S3＋G2、G1＋G2＋G3、G1＋G2＋S3 4 組樣品3 個(gè)傳感器無(wú)任何有意義方程，其余樣品每組至少有一個(gè)有意義的方程。單味DCMM 的口嘗苦度與電子舌苦度有良好相關(guān)性，疊加DCMM 的口嘗苦度與電子舌苦度相關(guān)性隨著疊加元素的增多而減少。

表15 三元疊加DCMM 電子舌苦度 (IZe) 與質(zhì)量濃度的對(duì)數(shù) (lnC) 的最佳擬合方程 (n = 6)Table 15 Best fitting equation of ternary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and concentration logarithm(lnC) (n = 6)

4 討論

4.1 載體的選擇

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版[11]中對(duì)飲片的性味描述，選擇“極苦”“苦”且沒(méi)有其他兼味描述的飲片，同時(shí)查閱相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，根據(jù)中藥飲片中含有的特征苦味物質(zhì)進(jìn)行分類，生物堿類：黃連（小檗堿、表小檗堿等）[16-17]、黃柏（小檗堿、黃柏堿）[18]、苦參（苦參堿、氧化苦參堿）[19]；萜類：穿心蓮（穿心蓮內(nèi)酯、新穿心蓮內(nèi)酯）[20]、野菊花（單萜類、倍半萜類化合物）[21]、苦楝皮（三萜類化合物川楝素和異川楝素）[22-23]；糖苷類：龍膽（龍膽苦苷）[24]、黃芩（黃芩苷、漢黃芩苷）[25]、連翹（連翹酯苷類）[26]。

根據(jù)《中國(guó)藥典》2015年版中飲片的推薦用量范圍進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，設(shè)定樣品的濃度梯度，如藥典中苦楝皮的【用法與用量】3～6 g，外用適量。用量系指每日常用劑量，按照一付藥常規(guī)煎得400 mL藥液，苦楝皮最高推薦質(zhì)量濃度為15 g/L?？嚅の犊嗪?，有毒，但性狀味為味苦，經(jīng)水煎煮后苦味較極苦類飲片弱，故根據(jù)韋伯-費(fèi)希納定律及預(yù)實(shí)驗(yàn)確定苦楝皮的濃度梯度為1.88、3.75、7.50、15、30、60 g/L，最高質(zhì)量濃度超過(guò)了藥典推薦，但是作為研究探索，且經(jīng)過(guò)口嘗感知到樣品的苦度后，會(huì)將藥液吐出并漱口，藥液不進(jìn)入體內(nèi)，保證了人體的安全。疊加實(shí)驗(yàn)煎藥方法基于傳統(tǒng)中藥的實(shí)際煎藥方法，即多種飲片共煎，本實(shí)驗(yàn)也采用共煎法制備水煎液，最終制得水煎液1 L，與單味中藥飲片水煎液保持一致，既與實(shí)際對(duì)應(yīng)也方便后續(xù)進(jìn)行二元、三元疊加擬合模型的構(gòu)建。

表16 三元疊加DCMM 電子舌苦度 (IZe) 與單味DCMM 苦度 (Ie) 的擬合方程 (n = 6)Table 16 Fitting equation of ternary superposition DCMM electronic tongue bitterness (IZe) and single-flavor DCMM bitterness (Ie) (n = 6)

4.2 THTPM 測(cè)試結(jié)果分析討論

THTPM 是最常用的味覺(jué)評(píng)價(jià)方法之一，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)THTPM 進(jìn)行二元、三元疊加實(shí)驗(yàn)（32 組）測(cè)試，其中30 組均得到最佳擬合方程（P＜0.05）。二元疊加均得到有意義的擬合方程，三元疊加中，黃芩＋連翹＋野菊花（IZ-lnC、IZ-I）未擬合出有意義的最佳方程。14 組疊加后苦度僅與組別中某一組分相關(guān)，10 組疊加后苦度與組別中所有組分均相關(guān)。從表8～11 中標(biāo)準(zhǔn)化回歸系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，同類型疊加中黃連、穿心蓮、龍膽等極苦類中藥對(duì)疊加后苦度的貢獻(xiàn)度更大；不同類型同為味極苦藥物的疊加中，黃連與同類別飲片、不同類別的飲片比較中，均表現(xiàn)出“力壓眾苦、唯我最苦”的呈苦特點(diǎn)，這與古代對(duì)黃連作為代表性苦味中藥以及眾多民諺中如“啞巴吃黃連，有苦說(shuō)不出”“吃過(guò)黃連苦，方知蜜糖甜”“不吃黃連、不知藥苦”等選擇黃連作為代表的事實(shí)相吻合。萜類與糖苷類的疊加中萜類占據(jù)主導(dǎo)位置。

表17 單味DCMM 苦度Io-Ie 預(yù)測(cè)模型Table 17 Single-flavor DCMM bitterness Io-Ie prediction model

表18 二元疊加DCMM 苦度IZo-IZe 預(yù)測(cè)模型Table 18 Binary superposition DCMM bitterness IZo-IZe prediction model

表19 三元疊加DCMM 苦度IZo-IZe 預(yù)測(cè)模型Table 19 Three-dimensional superposition DCMM bitterness IZo-IZe prediction model

在口嘗三元疊加中，黃連＋黃柏＋黃芩組擬合方程中出現(xiàn)黃連黃芩交互作用并與疊加后苦度呈負(fù)相關(guān)，可以推測(cè)是由于黃連、黃柏中生物堿類成分與黃芩中黃酮苷類成分相互作用，生成沉淀析出。其余組別未發(fā)現(xiàn)飲片之間因成分酸堿復(fù)合或沉淀反應(yīng)出現(xiàn)的拮抗作用或協(xié)同作用影響疊加后苦度的情況。僅黃芩＋連翹＋野菊花一組未擬合出有意義的最佳方程，考慮3 種飲片均為味苦飲片，苦味強(qiáng)度差異不明顯，疊加后組間變異較小，難以擬合出有意義的回歸方程，且本次實(shí)驗(yàn)濃度水平數(shù)較少，后期將增加實(shí)驗(yàn)濃度水平數(shù)，進(jìn)一步分析規(guī)律。

4.3 電子舌傳感器對(duì)中藥飲片的響應(yīng)規(guī)律

電子舌是采用同人舌頭味覺(jué)細(xì)胞工作原理相類似的人工脂膜傳感器技術(shù)，對(duì)待測(cè)樣品進(jìn)行識(shí)別、分析、檢測(cè)，在食品的風(fēng)味檢測(cè)中應(yīng)用居多，課題組前期基于電子舌技術(shù)在中藥苦味定量化檢測(cè)方面進(jìn)行了深入的研究。本實(shí)驗(yàn)是在課題組研究基礎(chǔ)上利用日本Insent 公司TS-5000Z 型電子舌對(duì)苦味中藥水煎液的疊加苦度規(guī)律進(jìn)行研究。根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)B-bitterness2（苦味回味）、澀味和苦味3 組味覺(jué)信息對(duì)待測(cè)樣品的響應(yīng)值較高，因此后續(xù)實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)以上3 組傳感器的電子舌苦度值進(jìn)行分析。

電子舌測(cè)定結(jié)果顯示，龍膽響應(yīng)值明顯低于其他飲片，與藥典中龍膽“極苦”以及口嘗結(jié)果均不相符，但整體上苦度隨濃度增加而增加。經(jīng)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)[27]，多采用龍膽粉末冷浸液進(jìn)行電子舌測(cè)試，而本實(shí)驗(yàn)是采用龍膽水煎液作為研究對(duì)象，出現(xiàn)響應(yīng)值低可能是龍膽經(jīng)水煎煮后成分發(fā)生變化或者傳感器對(duì)龍膽水煎液中的苦味物質(zhì)響應(yīng)不完全。大多數(shù)樣品的各傳感器味覺(jué)信息響應(yīng)值都隨濃度升高而升高，而黃連與黃柏的苦味味覺(jué)信息響應(yīng)值均隨濃度的升高而降低，苦參與龍膽的苦味響應(yīng)值未擬合出有意義的方程，這表明隨著濃度的升高，苦味響應(yīng)值無(wú)顯著的變化規(guī)律。而苦味DCMM的苦味味覺(jué)信息響應(yīng)值測(cè)試結(jié)果較差有兩種可能性，一種是濃度梯度設(shè)置不合適，不能使苦味響應(yīng)值有較大變化，一種是使苦味特征響應(yīng)的物質(zhì)經(jīng)水加熱煎煮后成分發(fā)生變化。

4.4 影響苦味疊加預(yù)測(cè)的因素

中藥湯劑的苦味是多種成分的集中表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)不同類型苦味中藥DCMM 采用二元、三元疊加進(jìn)行相關(guān)苦度測(cè)定，由簡(jiǎn)到繁，初步探索苦味DCMM 的苦度疊加規(guī)律。通過(guò)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，影響口嘗苦度與電子舌苦度疊加預(yù)測(cè)的原因可能有，一是質(zhì)量濃度：?jiǎn)蝹€(gè)待測(cè)樣品濃度合適，但經(jīng)疊加后溶液中苦味質(zhì)質(zhì)量濃度是否已超出電子舌測(cè)定范圍；二是響應(yīng)程度：中藥水煎液是十分復(fù)雜的體系，引發(fā)電子舌的傳感器響應(yīng)的物質(zhì)在測(cè)定過(guò)程中易受到干擾，與人體味蕾細(xì)胞感受到的物質(zhì)有差異性；三是樣品組成個(gè)數(shù)：本實(shí)驗(yàn)中隨著樣品中含有的飲片越多，口嘗苦度和電子舌苦度相關(guān)性越差。后期需通過(guò)增加實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)水平數(shù)（樣本測(cè)試數(shù)）、優(yōu)化濃度梯度以降低實(shí)驗(yàn)偏差，提高模型精確度。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突