肝臟常溫機(jī)械灌注修復(fù)及評(píng)估系統(tǒng)的研制

劉雯雁 ，劉鋒鋒，呂毅，湯博，馬濤，閆煬，鄭云巧，鄭幸龍,

1 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 血液凈化科，西安市，710061

2 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 精準(zhǔn)外科與再生醫(yī)學(xué)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心，西安市，710061

3 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 心血管外科，西安市，710061

4 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 麻醉手術(shù)部，西安市，710061

0 引言

肝移植仍是目前治愈終末期肝病的唯一有效手段。目前我國(guó)肝移植供肝的主要來(lái)源為公民心臟死亡器官捐獻(xiàn)（donation after cardiac death，DCD），其中邊緣供肝的使用一定程度上拓展了供肝的來(lái)源，但其對(duì)缺血再灌注損傷（ischemia reperfusion injury，IRI）的耐受能力明顯減弱[1]。常溫機(jī)械灌注（normothermic machine perfusion，NMP）能夠在生理溫度下為肝臟持續(xù)提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，并排出代謝廢物，改善器官保存期間的能量代謝狀態(tài)[2-3]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究提示NMP可有效減輕移植肝IRI，促進(jìn)術(shù)后肝功恢復(fù)[4-5]，甚至可減少術(shù)后缺血性膽道狹窄的發(fā)生率[6]及修復(fù)脂肪供肝[7]。

基于此，本團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)并研制了肝臟常溫機(jī)械灌注修復(fù)及評(píng)估系統(tǒng)，在灌注修復(fù)供肝的同時(shí)對(duì)肝功能進(jìn)行評(píng)估，評(píng)估供肝質(zhì)量是否達(dá)到肝移植要求，或者經(jīng)過修復(fù)后是否達(dá)到肝移植要求。

1 設(shè)計(jì)思路

目前，傳統(tǒng)的器官保存方式仍是靜態(tài)冷保存，然而越來(lái)越多的證據(jù)證實(shí)即使持續(xù)處于4oC，仍在進(jìn)行大約5%的代謝，這就會(huì)造成ATP儲(chǔ)備減少且持續(xù)產(chǎn)生有害的代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致供肝質(zhì)量受損。傳統(tǒng)的保存方式已不能滿足DCD供肝保存需求。為解決臨床困境，我們團(tuán)隊(duì)研發(fā)了肝臟常溫機(jī)械灌注修復(fù)及評(píng)估系統(tǒng)，由肝臟常溫機(jī)械灌注裝置、熒光成像系統(tǒng)及組織測(cè)氧儀組成。常溫機(jī)械灌注裝置持續(xù)在生理溫度下為肝臟提供氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，維持細(xì)胞功能，減輕炎癥反應(yīng)，達(dá)到保護(hù)及修復(fù)的目的，熒光成像系統(tǒng)通過激發(fā)并識(shí)別灌注液中吲哚菁綠（indoeyanine green,ICG）的熒光，并在屏幕上成像來(lái)實(shí)時(shí)評(píng)估供肝微循環(huán)情況及肝細(xì)胞代謝功能，組織測(cè)氧儀可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝臟氧分壓變化評(píng)估細(xì)胞氧供狀態(tài)。同時(shí)，通過灌注屠宰場(chǎng)獲取的豬肝初步驗(yàn)證了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

2 基本結(jié)構(gòu)

2.1 肝臟常溫機(jī)械灌注修復(fù)系統(tǒng)

圖1 肝臟常溫機(jī)械灌注修復(fù)系統(tǒng)組成Fig.1 Components of liver normothermic machine perfusion repair system

系統(tǒng)由三個(gè)模塊組成，分別為灌注模塊、氧合模塊及監(jiān)測(cè)控制模塊（見圖1）。灌注模塊包括：蠕動(dòng)泵（BQ50-1J保定蘭格），用于提供動(dòng)脈循環(huán)動(dòng)力；儲(chǔ)肝容器，用于放置肝臟；第一動(dòng)脈循環(huán)管路，入口端與儲(chǔ)肝容器的出口端連通；第二動(dòng)脈循環(huán)管路，入口端與恒溫氧合裝置的第一出口端連通，出口端延伸至開放式儲(chǔ)血容器內(nèi)，用于與放置在儲(chǔ)肝容器內(nèi)的供肝的肝動(dòng)脈連通；靜脈循環(huán)管路，入口端與恒溫氧合裝置的第二出口端連通，出口端延伸至儲(chǔ)肝容器內(nèi)，用于與供肝的門靜脈連通。主要功能為肝臟動(dòng)脈及門靜脈提供雙重灌注，模擬在體狀態(tài)下的血液循環(huán)。氧合模塊包括：儲(chǔ)液罐，用于儲(chǔ)存灌注液，內(nèi)部設(shè)置有液位傳感器，用于監(jiān)測(cè)儲(chǔ)液罐內(nèi)的液位；變溫水箱，有熱水出口和回水口，熱水出口和回水口分別與膜式氧合器內(nèi)的熱交換管的兩個(gè)端口對(duì)應(yīng)連通以使變溫水箱內(nèi)的熱水循環(huán)流過熱交換管以將流過膜式氧合器血液加熱至預(yù)設(shè)溫度；膜式氧合器（Maquet），用于氧合灌注液，為供肝提供富氧灌注液，入口端與第一動(dòng)脈循環(huán)管路的出口端連通將儲(chǔ)肝容器的血液輸送至膜式氧合器；氧氣瓶，用于儲(chǔ)存氧氣，在器官轉(zhuǎn)運(yùn)途中也可為灌注液提供氧合條件。主要功能為利用膜式氧合器對(duì)灌注液中的紅細(xì)胞進(jìn)行氧合，并對(duì)灌注液加溫，為肝臟提供充足的氧氣，滿足肝細(xì)胞代謝需求。監(jiān)測(cè)控制模塊包括：流量計(jì)，用于檢測(cè)動(dòng)脈循環(huán)管路及靜脈循環(huán)管路的灌注液流量；壓力傳感器，用于檢測(cè)動(dòng)脈循環(huán)管路及靜脈循環(huán)管理的灌注壓力；流量控制閥，用于穩(wěn)定動(dòng)脈循環(huán)管路及靜脈循環(huán)管路灌注液流量在設(shè)置范圍內(nèi)，當(dāng)流量超過設(shè)定值時(shí)，流量閥啟動(dòng)，壓迫管道，通過減小管徑來(lái)降低流量；控制顯示屏，控制器獲取流量計(jì)、壓力計(jì)、液位傳感器的監(jiān)測(cè)信號(hào)，控制器與驅(qū)動(dòng)器連接，根據(jù)相應(yīng)的監(jiān)測(cè)信號(hào)通過驅(qū)動(dòng)器控制蠕動(dòng)泵、變溫水箱、流量控制閥啟動(dòng)、停止或進(jìn)行相應(yīng)的控制動(dòng)作，同時(shí)控制器與顯示屏連接能夠?qū)⒏鞣N監(jiān)測(cè)信號(hào)發(fā)送至顯示屏進(jìn)行顯示，并可通過顯示屏調(diào)節(jié)各項(xiàng)控制參數(shù)。主要功能為實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)灌注過程中門靜脈、肝動(dòng)脈的流量及壓力，并穩(wěn)定灌注流量與壓力在一定范圍內(nèi)。

2.2 程序處理流程

系統(tǒng)開機(jī)啟動(dòng)后，初始化完所有的硬件設(shè)備，通過主控制臺(tái)設(shè)置溫度、血液流量、壓力閾值、蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速等參數(shù)。點(diǎn)擊啟動(dòng)按鈕系統(tǒng)開始運(yùn)行，讀取液位傳感器信息，判斷水位達(dá)到指定容量，控制繼電器開啟電加熱管電源開始水箱加熱，水恒溫到設(shè)定值。啟動(dòng)循環(huán)泵，運(yùn)行加熱循環(huán)系統(tǒng)，通過膜肺將血液加熱至設(shè)定值。連接灌注肝臟，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵開始系統(tǒng)血液循環(huán)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)流量與壓力，調(diào)整流量控制閥或蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速保證血液流量及壓力均在要求范圍之內(nèi)。串口實(shí)時(shí)獲取溫度、壓力傳感器的數(shù)據(jù)解析并計(jì)算處理，定時(shí)器實(shí)時(shí)獲取計(jì)數(shù)脈沖并計(jì)算得到流量（見圖2）。

圖2 程序處理流程Fig.2 Program treatment process

整個(gè)系統(tǒng)中，肝動(dòng)脈端流量主要依靠蠕動(dòng)泵驅(qū)動(dòng)，靜脈端流量主要依靠?jī)?chǔ)液罐與儲(chǔ)肝容器之間的高度差通過重力驅(qū)動(dòng)。系統(tǒng)的流量反饋調(diào)節(jié)依靠流量控制閥實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)控制。蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速設(shè)置在430 r/min以維持系統(tǒng)基本流量，通過第二動(dòng)脈循環(huán)管路中流量控制閥擠壓管道以實(shí)現(xiàn)對(duì)儲(chǔ)液罐液面及肝動(dòng)脈流量的控制。同時(shí)，通過調(diào)節(jié)靜脈循環(huán)管路中流量控制閥的松緊程度以實(shí)現(xiàn)門靜脈灌注的流量控制。亦可手動(dòng)通過顯示屏控制調(diào)整蠕動(dòng)泵泵速，然后經(jīng)流量計(jì)反饋系統(tǒng)自動(dòng)調(diào)整流量控制閥松緊度，以確保流量符合要求。灌注過程中門靜脈流量維持在1 000～1 200 mL/min，肝動(dòng)脈流量維持在200～400 mL/min，肝動(dòng)脈壓力維持在65～75 mmHg（1 mmHg=133.32 Pa）。若儲(chǔ)血罐液面水平低于警戒線或肝動(dòng)脈壓力高于設(shè)定閾值，系統(tǒng)將報(bào)警，蠕動(dòng)泵隨之停轉(zhuǎn)。

2.3 供肝評(píng)估系統(tǒng)

該評(píng)估系統(tǒng)由熒光成像系統(tǒng)和組織測(cè)氧儀組成，見圖3(a)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)供肝的實(shí)時(shí)功能評(píng)估。熒光成像系統(tǒng)基于肝細(xì)胞可攝取代謝ICG并由膽汁排出的特性，通過785 nm近紅外光激發(fā)，產(chǎn)生830 nm更長(zhǎng)波段的近紅外光而實(shí)現(xiàn)定位，通過觀察灌注過程中肝臟及膽道系統(tǒng)成像的變化可評(píng)估微循環(huán)灌注效果及肝細(xì)胞代謝功能。熒光成像系統(tǒng)包括：激發(fā)器，在距離肝臟8～12 cm處發(fā)射激光，激發(fā)灌注液中的ICG；體外圖像處理單元，CCD相機(jī)捕捉肝臟組織的熒光圖像，通過傳像束組件將圖像傳輸至數(shù)據(jù)處理中心，并在顯示器中顯示肝臟熒光圖像。激發(fā)器和CCD相機(jī)集成于手持式探頭中。組織測(cè)氧儀（OxyLiteTM，英國(guó)Oxylite公司）包括：光纖氧微傳感器，利用光學(xué)熒光技術(shù)實(shí)現(xiàn)組織氧分壓的定量測(cè)定及溫度測(cè)定；信號(hào)采集器，將采集到的生物學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)；顯示屏，可實(shí)時(shí)顯示組織氧分壓及溫度。將傳感器插入肝組織，可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)肝組織中的氧分壓及溫度變化，見圖3(b)。熒光成像系統(tǒng)和組織測(cè)氧儀分別為兩套獨(dú)立系統(tǒng)，各自配有顯示器，ICG成像結(jié)果，見圖3(c)。

圖3 供肝評(píng)估系統(tǒng)Fig.3 Assessment system of donor liver

3 肝臟灌注實(shí)驗(yàn)

利用屠宰場(chǎng)獲取的豬DCD肝臟（n=10）進(jìn)行設(shè)備的可行性驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，每個(gè)供肝離體灌注時(shí)間為6 h。在屠宰場(chǎng)獲取豬肝并行門靜脈及肝動(dòng)脈插管，灌注生理鹽水沖出肝臟內(nèi)殘留血液及血栓，同時(shí)行膽總管插管以方便留取膽汁。灌注液為稀釋豬全血（乳酸鈉林格液稀釋，灌注液成分配比仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整），運(yùn)行過程順利，關(guān)鍵參數(shù)門靜脈流量可維持在1 000～1 200 mL/min，肝動(dòng)脈流量維持在200～400 mL/min，肝動(dòng)脈壓力維持在65～75 mmHg(1 mmHg=133.32 Pa)。在開始灌注20 min內(nèi)即可見膽汁生成，并持續(xù)引流，膽汁生成量約（10.2±8.7）mL/h。對(duì)于供肝的評(píng)估，在灌注初始，灌注液中加入20 g ICG，通過熒光成像系統(tǒng)和組織測(cè)氧儀可實(shí)時(shí)觀察肝臟表面熒光變化及組織氧供變化情況。圖3(c)所示為一例供肝離體灌注時(shí)的情況，隨著灌注的進(jìn)行，豬DCD供肝逐漸顯影，灌注22 s時(shí)肝門部顯影，52 s時(shí)左外葉大部分顯影，至10 min 7 s時(shí)全肝呈顆粒狀花斑顯影。說明供肝的微循環(huán)通暢，并具備代謝功能。將氧分壓感受器探頭插入肝組織中，可見隨著灌注時(shí)間的延長(zhǎng)，組織溫度維持在37oC左右且氧分壓逐漸升高，說明肝臟常溫氧合機(jī)械灌注效果良好（圖3(b)）。由此證明本系統(tǒng)離體灌注DCD肝臟具備一定可行性并且安全有效。

4 小結(jié)

目前國(guó)外已報(bào)道用于臨床試驗(yàn)的肝臟常溫機(jī)械灌注系統(tǒng)主要有：OrganOx metra[5](英國(guó)OrganOx公司)，Organ Care System (OCS) Liver[8](美國(guó)Andover公司)，Liver Assist?[4]（荷蘭Assist公司）和Cleveland NMP[9]設(shè)備（美國(guó)Cleveland Clinic公司）。這些設(shè)備不僅價(jià)格昂貴，且多數(shù)實(shí)驗(yàn)中心難以購(gòu)入，限制了供肝保護(hù)修復(fù)方向的研究。國(guó)內(nèi)亦有中心自主研發(fā)相關(guān)設(shè)備。本團(tuán)隊(duì)研發(fā)的灌注系統(tǒng)不僅可實(shí)現(xiàn)離體肝臟的常溫氧合機(jī)械灌注，并且可實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)灌注壓力及流量，通過反饋系統(tǒng)自動(dòng)控制，及時(shí)調(diào)整泵速，將灌注壓力及流量維持在設(shè)定范圍內(nèi)，具備一定的自動(dòng)化。與此同時(shí)，本系統(tǒng)配有熒光成像系統(tǒng)及組織測(cè)氧儀，實(shí)現(xiàn)了肝臟部分代謝功能的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)。通過對(duì)灌注液的生化學(xué)檢查，可在移植前進(jìn)一步評(píng)估供肝功能。

現(xiàn)有研究中，NMP在保護(hù)DCD肝臟中表現(xiàn)突出。NASRALLA團(tuán)隊(duì)[4]臨床隨機(jī)對(duì)照研究發(fā)現(xiàn)與傳統(tǒng)靜態(tài)冷保存相比，NMP可顯著降低移植術(shù)后肝酶的峰值水平，同時(shí)供肝損傷率降低50%，平均離體保存時(shí)間延長(zhǎng)54%。國(guó)內(nèi)中山大學(xué)何曉順團(tuán)隊(duì)[10]利用 NMP提出無(wú)缺血肝移植概念，術(shù)后 30 d總體生存率達(dá)100%。但是，目前灌注過程中對(duì)供肝“生存能力”及“可移植性”的評(píng)估，主要都集中在灌注液AST、ALT、LDH水平，或肝臟大體形貌，缺少直接證據(jù)和對(duì)供肝的實(shí)時(shí)評(píng)估。本系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了在灌注過程中即對(duì)供肝進(jìn)行肝功能的評(píng)估，ICG熒光成像不僅可以評(píng)估微循環(huán)通暢程度，還可以通過觀察膽汁的熒光強(qiáng)度來(lái)評(píng)估肝細(xì)胞的代謝分泌功能，未來(lái)這一評(píng)估可以做到定量評(píng)估，更加準(zhǔn)確。同時(shí)，肝臟組織氧分壓的測(cè)定可以評(píng)估肝組織耗氧情況，反映肝細(xì)胞功能恢復(fù)水平。實(shí)時(shí)評(píng)估系統(tǒng)有望指導(dǎo)DCD供肝的使用，明確灌注修復(fù)時(shí)間，避免過度灌注情況的發(fā)生，以及預(yù)測(cè)預(yù)后，早期指導(dǎo)用藥。系統(tǒng)現(xiàn)可以穩(wěn)定運(yùn)行并實(shí)現(xiàn)上述評(píng)估功能，其有效性還需進(jìn)一步移植實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證。