海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)與細胞干性的捕獲

岑 衛(wèi), 胡夢珠, Rinkevich Baruch, 胡國斌

海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)與細胞干性的捕獲

岑 衛(wèi)1, 2, 胡夢珠1, 2, Rinkevich Baruch3, 胡國斌1, 2

(1. 中國海洋大學(xué), 海洋生命學(xué)院, 山東 青島 266003; 2. 中國海洋大學(xué), 海洋生物多樣性與進化研究所, 山東 青島 266003; 3. 以色列國家海洋研究所, 海洋和湖沼學(xué)研究所, 海法 31080 以色列)

細胞系的構(gòu)建在生物學(xué)領(lǐng)域具有重要意義, 與其他動物(如昆蟲)不同, 經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展, 海洋無脊椎動物細胞研究仍停留在原代培養(yǎng)水平, 沒有建立起克隆化的永生細胞系。本文主要介紹了近年來海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)的研究進展, 還介紹了一個基本原理, 即海洋無脊椎動物永生細胞系的建立, 可以通過捕獲細胞的干性而實現(xiàn)。捕獲細胞干性的第一條途徑是利用轉(zhuǎn)錄因子等直接由體細胞制備海洋動物的誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)。第二條途徑是獲取海洋動物的成體干細胞(ASC)。這些細胞在維持機體活性、再生、無性克隆、體內(nèi)增殖等方面起重要作用。當(dāng)培養(yǎng)條件正確時, 海洋無脊椎動物iPS細胞和ASC將會保持其原始狀態(tài), 利用干細胞自我復(fù)制的固有能力、不分化地進行增殖而形成永生細胞系。

海洋無脊椎動物; 細胞培養(yǎng); iPS細胞; 干細胞; 永生細胞系

海洋無脊椎動物門類繁多, 150多年來為研究再生、應(yīng)激反應(yīng)、環(huán)境適應(yīng)等生物過程的調(diào)節(jié)機制提供了大量生物材料, 被用作模式生物解釋各種生物學(xué)問題做出了重要貢獻。原代培養(yǎng)一般通過酶分解含有特定細胞的組織, 或剪碎組織后使細胞從組織碎片遷移出來而獲得培養(yǎng)物。盡管絕大多數(shù)原代培養(yǎng)產(chǎn)生的細胞群增殖能力有限, 但在極少數(shù)情況下, 原代細胞會連續(xù)復(fù)制而形成細胞系[1]。節(jié)肢動物可能最好地說明了細胞系對生物學(xué)研究的重要性。目前已建立了940多種昆蟲細胞系[2], 大多數(shù)擁有完善的模型系統(tǒng), 在眾多領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用, 已遠超出昆蟲學(xué)范疇。細胞系在闡明復(fù)雜生理過程, 推進分子生物學(xué)以及功能基因組學(xué)等方面起著關(guān)鍵作用[3]。目前已經(jīng)建立了淡水和陸生無脊椎動物(水螅、線蟲)的細胞系, 并報道海葵()和對蝦()細胞的長期(>1個月)原代培養(yǎng)[4], 但仍沒有得到海洋無脊椎動物的永生細胞系。

本文對近年來海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)的研究進展進行了綜述, 整理了哺乳動物領(lǐng)域幾種代表性的干細胞, 包括成體干細胞、腫瘤干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞(iPS), 它們都有一個共同的特征: 具備無限增殖能力和分化能力, 即具備細胞干性; 介紹了通過獲得細胞干性建立海洋無脊椎動物細胞系的兩途徑: 第一種是針對靜止?fàn)顟B(tài)的體細胞, 利用在哺乳動物細胞中成功誘導(dǎo)的iPS 細胞的方法; 第二種是以生物體內(nèi)的成體干細胞作為建系靶細胞。

1 細胞靜止

海洋無脊椎動物細胞通常在離體培養(yǎng)24~72小時后進入靜止?fàn)顟B(tài)。細胞靜止是指細胞的不分裂狀態(tài), 例如細胞分化后退出細胞周期的狀態(tài)(如神經(jīng)元和心肌細胞), 它類似于孢子的休眠狀態(tài)[5]。這種靜止?fàn)顟B(tài)存在不同類型和深度, 例如在肌肉干細胞中存在著不同深度的細胞靜止?fàn)顟B(tài), 細胞可以響應(yīng)某些環(huán)境信號而進入一種特殊的“靜止”, 并且這些細胞對觸發(fā)退出靜止?fàn)顟B(tài)的信號更為敏感。這種中間狀態(tài)例如干細胞中的“G-alert”和T淋巴細胞中的“G0(A)”[6-7]。靜止細胞在新陳代謝上仍然是活躍的, 并且在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境或信號下能夠回到細胞周期。Coller等[8]使用轉(zhuǎn)錄譜分析了人二倍體成纖維細胞在三種獨立信號(無絲裂原、接觸抑制和失去粘附)作用下退出細胞周期的特征, 發(fā)現(xiàn)靜止是由初始信號決定的一組狀態(tài), 每一種狀態(tài)都處于動態(tài)平衡中, 具有可逆性, 并存在一個與靜止有關(guān)的遺傳程序, 不同于其他細胞周期停滯, 如衰老、凋亡和終末分化。這為通過獲取成體干細胞和誘導(dǎo)多能干細胞的方法建立海洋無脊椎動物永生細胞系提供了可能。

2 成體干細胞

干細胞是科學(xué)界最有爭議的術(shù)語之一。一般定義干細胞是一個細胞譜系的起源, 具有自我更新和多能性, 能產(chǎn)生特定組織甚至生物體的所有細胞類型[9]。根據(jù)個體發(fā)育過程中干細胞出現(xiàn)的次序和發(fā)育潛能的不同, 可分為胚胎干細胞(embryonic stem cells, ES細胞)和成體干細胞(adult stem cells)。成體干細胞是指已分化的特定組織中的未分化細胞, 可來源于胎兒或成體組織, 如造血干細胞、神經(jīng)干細胞、精原干細胞等。有些哺乳動物成體干細胞和海洋無脊椎動物一樣, 具有多能性甚至是全能性[10-11]。但海洋無脊椎動物成體干細胞數(shù)量普遍較少, 能夠在體內(nèi)跟蹤成體干細胞的自我更新和行為的無脊椎生物模型也不多, 因此對這些成體干細胞的研究一直沒有取得進展。對哺乳動物的研究表明可以從已分化的體細胞中培養(yǎng)出干細胞, 這一自我更新機制為其在細胞培養(yǎng)方法中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)。

與成體干細胞概念相關(guān)的是腫瘤干細胞(cancer stem cell, CSC)。腫瘤干細胞等同于正常的成體干細胞, 可以看作是成體干細胞特性的一種極端表現(xiàn)。具有自我更新的能力, 可以分裂產(chǎn)生其他的腫瘤干細胞, 同時也可以分化成為其他細胞。例如犬傳染性性病腫瘤(canine transm-issible venereal tumor, CTVT)是一種發(fā)生在狗身上的傳染性疾病, 通過性交傳播。這個細胞系從犬類第一次被馴化到現(xiàn)在已經(jīng)超過了6000年[12], 但其干性依舊存在并且沒有衰弱的跡象。

3 誘導(dǎo)多能干細胞

誘導(dǎo)多能干細胞(iPS細胞)具有自我更新能力, 具有通過分裂產(chǎn)生與母細胞完全相同的子代細胞的“無限”增殖能力; 該細胞還具有多向分化潛能, 能夠分化出多種細胞類型和組織。類似于胚胎干細胞(ES細胞), 哺乳動物多能干細胞在體外和體內(nèi)環(huán)境中均表現(xiàn)出高度可塑性。自2006年 Takahashi 和 Yamanaka 首次培養(yǎng)出小鼠 iPS 細胞[13]以來, 這項技術(shù)已被證明能誘導(dǎo)多種哺乳動物產(chǎn)生 iPS 細胞, 推進了再生醫(yī)學(xué)、基礎(chǔ)發(fā)育生物學(xué)等許多領(lǐng)域的研究。目前哺乳動物 iPS 細胞是通過引入重編碼基因或?qū)⒅亟M蛋白導(dǎo)入細胞。在小鼠和人體細胞中, 可以通過幾個關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子(如OCT4、KLF4、SOX2 和c-MYC)使體細胞去分化成為iPS細胞。iPS 細胞能夠產(chǎn)生可育的嵌合體小鼠, 甚至僅由iPS 細胞派生出完整胚胎[14]。

對于非哺乳動物, 科研人員也通過人類的OCT4/ POU5F1、NANOG、SOX2 轉(zhuǎn)錄因子將鵪鶉()胚胎成纖維細胞去分化為 iPS細胞[15]。而Rosselló 等[16]發(fā)現(xiàn)用于在小鼠和人類中生成 iPS 細胞的一組四個哺乳動物轉(zhuǎn)錄因子可以在其他非哺乳類脊椎動物(鳥類、魚類)和無脊椎動物(果蠅)中誘導(dǎo)部分重編碼的多能干細胞。這些發(fā)現(xiàn)證明了跨系干細胞誘導(dǎo)的可能性, 也表明在廣泛的系統(tǒng)內(nèi)干細胞基因庫可能高度保守(圖1)。關(guān)于干細胞基因庫的保守性研究從十多年前開始, 陸續(xù)發(fā)現(xiàn)一些基因(、和)重編碼的多能干細胞可以在一些高度再生的動物(水螅、扁蟲等)中產(chǎn)生生殖細胞[17]。這些基因在不同物種的多能干細胞中均發(fā)揮著重要作用。保守基因的存在意味著在這類細胞中存在一個潛在通用的控制分裂分化增殖的系統(tǒng)[18]。

雖然關(guān)于哺乳類(如豬、馬、兔等)和非哺乳類脊椎動物(鳥類等)的 iPS 細胞研究日趨成熟[19], 但尚無關(guān)于海洋無脊椎生物的相關(guān)研究。由普通的體細胞產(chǎn)生iPS 細胞是一個人為可重復(fù)操作的過程, 這種方法克服了細胞分離出來后會進入靜止?fàn)顟B(tài)這一阻礙, 為海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)提供了新的思路。

4 干細胞在海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)中的應(yīng)用

海洋無脊椎動物中成體干細胞數(shù)量普遍較少, 但存在較多的多能干細胞(pluripotent stem cells), 這些細胞在維持機體活性、再生和無性克隆中起重要作用。雖然在部分無脊椎動物如扁形動物中多能干細胞相對較少, 只有4%~6.5%, 但是較脊椎動物還是具有非常高的比例[20]。

4.1 海綿動物

海綿動物屬低等、原始的多細胞動物類群, 被認為是理解動物進化和發(fā)展的關(guān)鍵生物。其體內(nèi)含有多種抗性物質(zhì), 近幾十年來, 在海綿中發(fā)現(xiàn)了大量具有抗腫瘤、抗真菌、抗HIV的活性物質(zhì)。海綿動物具有很強的再生能力, 切掉的小塊海綿可以重新長成完整個體, 搗碎的海綿細胞還可以聚合重新形成新個體[21]。

圖1 實驗物種間干細胞基因的同源性系統(tǒng)發(fā)育

注: a: 實驗物種與小鼠的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系: 鳥類(雞和鳴禽)、魚類(斑馬魚)和昆蟲(果蠅); b-e: 四種干細胞誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子假定同源物的一般結(jié)構(gòu)和序列比較[16]

早在1993年Klautau等就建立了海綿細胞的懸浮培養(yǎng)方法, 但是現(xiàn)今海綿細胞培養(yǎng)仍停留在原代培養(yǎng)水平。主要是因為海綿動物多為合胞體, 體外培養(yǎng)的海綿細胞結(jié)構(gòu)與體內(nèi)有很大的不同并且海綿動物體內(nèi)有多種內(nèi)共生微生物, 很難實現(xiàn)無菌培養(yǎng)[22]。海綿動物的多能干細胞數(shù)目非常多, 每個芽體(通常約為直徑0.5 mm)內(nèi)都有數(shù)以千計的原始生殖細胞。孫黎明[23]研究了繁茂膜海綿()的干細胞鑒定分離純化和體外增殖等問題并驗證了海綿干細胞的增殖分裂潛力, 但缺少后續(xù)實驗論證。而Conkling等[24]研究配制了一種氨基酸優(yōu)化的培養(yǎng)基可以刺激9種海綿的細胞快速分裂, 首次實現(xiàn)了海綿細胞分裂速度和數(shù)量的實質(zhì)性提高。實驗中分裂最快的細胞數(shù)量在不到1小時內(nèi)翻倍, 將其中四種海綿的培養(yǎng)物進行3到5次傳代, 傳代后細胞數(shù)量平均達到5.99倍, 壽命為21~35天。

4.2 刺胞動物

刺胞動物是真正的二胚層多細胞動物, 有了組織的分化, 但結(jié)構(gòu)簡單, 體壁僅由內(nèi)、外胚層兩層細胞以及中間無細胞結(jié)構(gòu)的中膠層構(gòu)成, 細胞類型較少。刺胞動物的研究中發(fā)現(xiàn)珊瑚的再生能力會隨其受傷-再生次數(shù)的增加逐漸減弱, 原因可能是再生過程中干細胞數(shù)量不斷消耗。柳珊瑚的變形細胞除具有吞噬細胞類似功能外, 還具有多能干細胞的特性, 可以分裂分化出各種細胞類型[25]。對水母()的研究[26]發(fā)現(xiàn), 分離的單核橫紋肌細胞不僅可以多能轉(zhuǎn)分化, 還能完成完整的體外再生過程。進一步研究表明當(dāng)出芽時, 一種的同源物的表達上調(diào), 由于橫紋肌細胞向平滑肌細胞的轉(zhuǎn)分化也激活了表達, 因此似乎在該物種的細胞干性相關(guān)過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用, 但尚未見進一步嘗試干細胞的體外培養(yǎng)實驗。

4.3 扁形動物

扁形動物擁有強大的再生能力, 即使原始個體的1/279大小的碎片也能再生成完整個體。其中再生能力的關(guān)鍵是被稱為Neoblasts[27]的成體干細胞。這種成體干細胞可以分化產(chǎn)生體細胞和生殖細胞, 用于出芽、缺失部位的再生和體細胞的更新等生理過程。例如受到損傷后扁形動物可以利用成體干細胞分化再生修補損傷的組織, 而這一過程主要受到翻譯后修飾、磷酸化、泛素化以及染色質(zhì)修飾等的調(diào)控[28]。對其他扁形動物的研究表明, 寄生吸蟲的幼蟲可由游離的間充質(zhì)細胞產(chǎn)生[29]; 絳蟲中完整的蚴蟲可由單個細胞再生形成; 淡水渦蟲能夠通過干細胞介導(dǎo)全身再生。這些特性使得扁形動物成為研究干細胞的優(yōu)秀模式生物。

形態(tài)學(xué)上, Neoblasts成體干細胞與其他生物體的干細胞有許多共同特征, 如高核/質(zhì)比、較大的細胞核、高嗜堿性的細胞質(zhì)、胞質(zhì)邊緣有游離核糖體和少量線粒體、沒有或很少有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。Gehrke等[27]的研究表明雖然再生過程中外部刺激不同導(dǎo)致種間的同源性判斷有些困難, 但總體上這一成體干細胞在5.5億年進化過程中具有一定的保守性。目前仍缺乏成體干細胞體外長期培養(yǎng)的相關(guān)研究。

4.4 環(huán)節(jié)動物

環(huán)節(jié)動物多毛類具有優(yōu)秀的再生損傷身體部位的能力。因此可利用多毛類作為模型, 揭示再生過程的基本特征和未知特性。細胞干性研究主要集中在干細胞的形成以及組織再生。Rebscher等[30]研究發(fā)現(xiàn)沙蠶原始生殖細胞(primordial germ cell, PGCs)和中胚層后生長帶(mesodermal posterior growth zone, MPGZ)細胞雖然在形態(tài)上難以區(qū)分, 并且均表達、和, 但經(jīng)5-乙炔基-2′-脫氧尿苷(EdU)標(biāo)記后, MPGZ前方可檢測到一簇特殊的PGCs, 推測多毛類動物早期PGC是預(yù)先形成的。Fischer和Arendt的研究進一步發(fā)現(xiàn)杜氏闊沙蠶()四個原始生殖細胞在胚胎發(fā)生早期由“初級中胚層”第一次分裂產(chǎn)生, 這也是整個軀干中胚層的起源[31]。在多毛類再生的分子基礎(chǔ)方面, Giani等[32]研究了海蠕蟲()頭部再生過程中基因的表達, 證實了的保守性以及在多毛類未分化細胞中的作用。Kozin等[33]研究了、和基因在沙蠶尾部再生過程中的差異表達, 這些基因在維持無脊椎動物原始生殖細胞和多能干細胞的未分化狀態(tài)方面具有重要作用。

4.5 甲殼動物

目前海洋節(jié)肢動物成體干細胞的研究較少, 對根頭目的干細胞研究最為深入, 部分幼蟲組織和器官中的成體細胞可恢復(fù)為干細胞[29]。而甲殼綱作為節(jié)肢動物門中的第3大綱, 物種數(shù)僅次于昆蟲綱和蛛形綱, 幼蟲體內(nèi)有部分干細胞, 選擇性表達堿性磷酸酶[34], 在無性出芽生殖中起重要作用。以對蝦為例, 從Chen等1986年首次嘗試使用L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)對蝦的初級淋巴細胞和卵巢細胞至今已有三十多年的歷史[35]。Claydon和Owens將人乳頭瘤病毒(HPV)E6和E7基因轉(zhuǎn)染到紅螯螯蝦()細胞中[36]。雖然癌基因轉(zhuǎn)染成功且轉(zhuǎn)染后的細胞存活超過150天, 但由于端粒損耗, 細胞增殖停滯。Claydon等[37]利用聚乙二醇(PEG)介導(dǎo)兩種細胞系, 鯉魚上皮細胞系(EPC)和草地貪夜蛾細胞系(Sf9)融合后與斑節(jié)對蝦()的血細胞融合, 首次得到了對蝦雜交細胞, 但在融合細胞中未能觀察到對蝦基因以及蝦類病毒敏感性。Puthu-mana采用猿猴病毒40-T抗原和腺病毒12S-E1A基因兩種癌基因分別轉(zhuǎn)染斑節(jié)對蝦淋巴細胞, 增殖細胞存活90天以上, 但未實現(xiàn)永生化[38]。韓倩等[39]整理研究了對蝦永生性轉(zhuǎn)化的相關(guān)技術(shù), 并就蝦的類淋巴細胞(Oka)的原代和傳代培養(yǎng)進行了部分優(yōu)化, 同時發(fā)現(xiàn)在蝦細胞中, 慢病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移比脂質(zhì)體和逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的方法具有更高的轉(zhuǎn)染效率。目前傳代培養(yǎng)和建立穩(wěn)定或連續(xù)的蝦細胞系相關(guān)問題仍有待解決[40]。培養(yǎng)基方面Sivakumar[41]以南美白對蝦血淋巴的氨基酸組成為基礎(chǔ), 采用5種不同的培養(yǎng)基, 建立了南美白對蝦不同組織和血細胞的體外細胞培養(yǎng)體系。

4.6 軟體動物

軟體動物身體柔軟, 真體腔不分節(jié), 由頭、足、內(nèi)臟團、外套膜和貝殼等五部分組成[42]。軟體動物的體外細胞培養(yǎng)有助于人們了解組織特異性細胞內(nèi)或細胞間發(fā)生的復(fù)雜生理過程, 目前為止只建立了一個細胞系(圖2), 即光滑雙臍螺胚胎細胞系(Bge)[43]。而且?guī)缀鯖]有海洋軟體動物干細胞的相關(guān)研究, 事實上軟體動物身體結(jié)構(gòu)和生活方式的多樣性導(dǎo)致它們在細胞培養(yǎng)以及細胞系的建立中面臨著許多困難。首先由于共生體和體內(nèi)微生物的存在, 軟體動物乃至整個海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)過程中都很難做到無菌培養(yǎng), 實驗中不得不使用大量抗生素或采取其他更為嚴苛的殺菌措施, 但這些操作也會同時對軟體動物細胞造成損傷。其次軟體動物培養(yǎng)所需的等滲條件和pH值更為苛刻, 在實驗中可能需要額外的滲透劑、無機離子或其他螯合劑[44]。還有外植體培養(yǎng)的條件, 水解酶對細胞培養(yǎng)過程造成的損害, 使用胎牛血清對細胞的隱形損傷等問題[1]。

雖然目前還沒能培育出無限傳代成功的細胞系, 但海洋貝類細胞培養(yǎng)的研究也取得了部分進展[45]。陳頡等[46]研究了文蛤()外套膜細胞在不同溫度和鹽濃度條件下細胞的生長情況, 培養(yǎng)的細胞可存活30~35天。You等[47]利用向L-15培養(yǎng)基添加酵母提取物的方法成功培養(yǎng)文蛤消化腺細胞, 并在此基礎(chǔ)上成功開展了RNA干擾實驗。永生性研究方面, 雖然軟體動物體某些部位的快速增殖細胞可以轉(zhuǎn)化為成體干細胞, 但是沒有進一步的支持性實驗論證[48]。

圖2 光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata)胚胎細胞(Bge)貼壁生長形態(tài)[1]

4.7 棘皮動物

棘皮動物體內(nèi)有與消化道分離的真體腔, 體壁有來源于中胚層的內(nèi)骨骼, 屬后口動物, 是無脊椎動物中最高等的類群。棘皮動物具有強大的再生能力, 例如海星只要體盤連著一條腕, 就能長成新個體。有些種類的海參在受攻擊發(fā)生吐腸現(xiàn)象后僅需7天就能完成腸道再生, 而研究認為干細胞是棘皮動物高再生潛能的基礎(chǔ)[1, 49]。Reinardy等[50]檢測到兩個與海膽棘突和管足相關(guān)的干細胞標(biāo)志物(和)的表達, 后續(xù)研究也驗證了干細胞參與棘皮動物體壁的再生過程這一觀點[1, 49]。在細胞培養(yǎng)方面, Wang等[51]整理出一套簡便易行的海參腸細胞培養(yǎng)方案, 并且成功完成了海參腸細胞原代培養(yǎng)以及細胞凋亡誘導(dǎo)與檢測。此方案也廣泛適用于包括棘皮動物、軟體動物和甲殼動物在內(nèi)的其他海洋無脊椎動物。Bene-detto等[52]首次完成了海百合()體內(nèi)與再生過程相關(guān)細胞的體外培養(yǎng), 優(yōu)化了細胞培養(yǎng)條件, 細胞可以至少存活7周。

4.8 尾索動物

尾索動物也稱被囊動物, 是脊索動物門的一個亞門。大多數(shù)實驗以海鞘作為模式動物來進行研究, 為了揭示海鞘的免疫機制, 對于海鞘血細胞的培養(yǎng)研究較多。但是成熟血細胞的壽命較短且體外培養(yǎng)很難保持其活性, 上皮細胞的原代培養(yǎng)也只能在體外存活較短時間。

尾索動物目前已經(jīng)獲得了至少兩個獨立的干細胞系統(tǒng), 即上皮細胞和血細胞的干細胞系統(tǒng)。在菊海鞘中, 從生長的芽中獲得的細胞有多向分化潛能, 可以分化出大部分組織和器官。Voskoboynik 等[53]研究海鞘()時發(fā)現(xiàn)它在整個生命過程中顯示出強大的干細胞介導(dǎo)的再生能力。尾索動物的幼蟲通過有性繁殖發(fā)育而成, 可通過干細胞出芽形成新的個體。個體存活時間很短, 通過大量的細胞凋亡死亡, 可連續(xù)出芽復(fù)制出全新的個體。因此, 他們的干細胞是組織中唯一能自我更新的細胞。但這都是在體內(nèi)表現(xiàn)出的細胞干性, 目前仍沒有體外條件下成體干細胞的相關(guān)研究。

4.9 其他海洋無脊椎動物

苔蘚動物是一類群體營固著生活的海洋無脊椎動物, 約5 000種。幾乎所有的苔蘚動物都通過干細胞來形成模塊集落, 從越冬的囊孢(休眠芽)發(fā)芽或通過“自裂”(自發(fā)地分裂成兩個或兩個以上的碎片)繁殖[54]。新的組織是由芽發(fā)育而來, 可能含有全能干細胞。Shunatova等[55]研究了苔蘚蟲()再生過程中細胞的增殖情況, 測試了苔蘚蟲觸手的再生能力, 在蟲體的纖毛窩和口檢測到干細胞, 而在成蟲的觸手中未檢測到干細胞。有些櫛水母在切成兩半或四分之一時能夠再生出完整的個體, 例如,[56]。許多櫛水母通過斷裂和發(fā)芽的方式進行無性生殖。這些過程是否涉及全能成體干細胞(totipotent adult stem cells)目前尚未研究。其他無脊椎動物如毛顎動物, 腕足動物和紐形動物等主要研究方向尚未涉及干細胞, 細胞學(xué)細節(jié)和遺傳學(xué)基礎(chǔ)至今尚無研究。

5 討論及展望

通過對近年來海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)研究的整理發(fā)現(xiàn), 細胞不能長期培養(yǎng)的原因有以下幾點: 一是對海洋無脊椎動物細胞生長需求以及分裂所需要的促進因子了解甚少; 二是缺乏海洋無脊椎動物細胞生理方面的細致研究, 不同細胞需要的培養(yǎng)條件如滲透壓、pH、無機離子和有機物配比、緩沖液等均有不同, 直接套用或參照脊椎動物或昆蟲的培養(yǎng)基不能取得最佳的培養(yǎng)效果[44]; 三是細胞分類和鑒定的信息還不完備, 很難把握原代和傳代培養(yǎng)過程中的最佳細胞密度; 四是防菌問題, 海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)由于共生微生物的存在, 很難做到無菌培養(yǎng)。在細胞培養(yǎng)中如何處理共生菌與細胞的關(guān)系是關(guān)鍵, 例如海綿的培養(yǎng)過程中如果加入抗生素進行抑菌處理, 同時會抑制海綿細胞的活性, 如果不使用抗生素, 培養(yǎng)又只能維持1~3天[57]; 五是接種方法, 利用外植體直接培養(yǎng)時獲取的分散細胞數(shù)量過少, 同時能從組織塊遷移的細胞種類有限, 極大的限制了接種細胞的數(shù)量和質(zhì)量, 而通過酶(胰蛋白酶、膠原蛋白酶等)水解分散對細胞損傷較大[58]。盡管培養(yǎng)基的組成是決定細胞系建立成功與否的重要因素, 但到目前為止還沒能設(shè)計出專門用于海洋無脊椎動物細胞體外生長的培養(yǎng)基, 這需要我們深入研究海洋無脊椎動物細胞生長所需的生理生化條件。

圖3 利用海洋無脊椎動物成體干細胞和iPS細胞建立細胞系的示意圖[58]

針對海洋無脊椎動物細胞在體外培養(yǎng)24~72小時后會進入靜止?fàn)顟B(tài)這個現(xiàn)象, Rinkevich[58]提出利用海洋無脊椎動物成體干細胞和 iPS 細胞進行細胞培養(yǎng), 將 iPS 細胞和成體干細胞作為兩個獨立的來源培養(yǎng)永生細胞(圖3)。結(jié)合以往研究, 海洋無脊椎動物細胞建系研究可以從干擾細胞周期調(diào)節(jié)基因使細胞脫離靜止?fàn)顟B(tài)、維持端粒穩(wěn)定以及與永生細胞系融合構(gòu)建雜交細胞等方面入手。干擾細胞周期調(diào)節(jié)基因使細胞脫離靜止?fàn)顟B(tài), 必須要了解細胞如何進入和維持靜止?fàn)顟B(tài)。Gulaia等[59]探討了不同分子機制和鄰近細胞如何影響膠質(zhì)瘤干細胞的靜止?fàn)顟B(tài), 包括各種轉(zhuǎn)錄因子、檢查點調(diào)節(jié)因子、蛋白激酶/磷酸酶, 以及外源調(diào)節(jié)因子, 如細胞間相互作用、細胞外基質(zhì)成分等。研究表明 BTG1 和 BTG2(BTG1/2)是調(diào)節(jié)T細胞活化的關(guān)鍵分子, 促進 mRNA 的降解, 使 T 細胞處于靜止?fàn)顟B(tài), 缺少 BTG1/2 的 T 細胞因信使 RNA 豐度增加而激活和增殖[60]。Roche等[61]發(fā)現(xiàn)在裂殖酵母()中, RNAi(RNA interference)是維持細胞靜止?fàn)顟B(tài)的重要調(diào)節(jié)機制。端粒酶活性是限制細胞增殖的因素之一, pRb 和p53 通路失活以及端粒維持機制的激活被認為是體細胞永生化的必要條件[62]。在絕大多數(shù)情況下, 端粒酶被激活, 端粒長度就能維持穩(wěn)定, 從而細胞的壽命得以維持[63]。通過細胞融合構(gòu)建雜交細胞的研究也取得了部分成功, 例如將鯉魚上皮細胞系(EPC)和草地貪夜蛾細胞系(Sf9)融合后與斑節(jié)對蝦()的血細胞融合, 首次得到了對蝦雜交細胞[37], 有望實現(xiàn)對蝦細胞連續(xù)培養(yǎng)。雖然采用傳統(tǒng)方法培養(yǎng)細胞成效甚微, 但是通過轉(zhuǎn)基因和細胞雜交等技術(shù), 捕捉細胞干性, 構(gòu)建活躍增殖的海洋無脊椎動物細胞系無疑是今后研究海洋無脊椎動物細胞培養(yǎng)研究的重要部分。

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Establishment of cell lines from marine invertebrates by inducing cellular stemness

CEN Wei1, 2, HU Meng-zhu1, 2, RINKEVICH Baruch3, HU Guo-bin1, 2

(1. College of Marine Life Science, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 2. Institute of Evolu-tion & Marine Biodiversity, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3. Oceanographic and Limnological Research, National Institute of Oceanography of Israel, Tel-Shikmona, P.O. Box 8030, Haifa 31080, Israel)

Establishment of cell lines is of great significance in the field of biology. Contrary to the field of insect research, in which development of various cell lines has become routine, the marine invertebrate cell culture research has remained at the primary culture stage. Not a single marine invertebrate immortal cell line has been established yet even after decades of research. This paper discusses the research progress in the field of marine invertebrate cell culture in the recent years. It also discusses the basic principle behind the development of immortal cell lines from marine invertebrates through induction of cellular stemness. At first, induced pluripotent stem (iPS) cells of marine animals must be prepared. The technology used for developing iPS cells of mammals and other vertebrates is quite developed and involves dedifferentiation of somatic cells into iPS cells using transcription factors. Another method that can be used for developing iPS cells involves the use of adult stem cells (ASCs) from marine animals. There are a large number of ASCs in marine invertebrates; the ASCs play an important role in many processes, such as organism development and reproduction. Under certain culture conditions, iPS cells and ASCs of marine invertebrates can form immortal cell lines using characteristics of self-generated stem cells.

marine invertebrates; cell cultures; iPS cells; stem cells; immortal cell line

Jun. 13, 2020

Q178.53, Q813.11

A

1000-3096(2021)01-0146-09

10.11759/hykx20200613001

2020-06-13;

2020-09-27

山東省自然科學(xué)基金(ZR2019MC051), 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(201822025)

[Shandong Provincial Natural Science Foundation, No. ZR2019MC051; Fundamental Research Funds for Central Universities, No. 201822025]

岑衛(wèi)(1993-), 男, 山西朔州人, 碩士研究生, 主要從事海洋生物學(xué)研究, E-mail: keykamio@163.com; 胡國斌, 男,通信作者, 教授, E-mail: huguobin@ouc.edu.cn

(本文編輯: 趙衛(wèi)紅)