氟苯尼考對(duì)太平洋牡蠣(Crassostrea gigas)早期發(fā)育的影響

張鶯臍, 張羨宇, 郭慶芳, 許文豪, 馬 崢, 石 碩, 張 倩, 劉 鷹

氟苯尼考對(duì)太平洋牡蠣()早期發(fā)育的影響

張鶯臍1, 2, 張羨宇1, 2, 郭慶芳1, 許文豪1, 馬 崢1, 石 碩1, 張 倩1, 2, 劉 鷹1, 2

(1. 大連海洋大學(xué), 海洋科技與環(huán)境學(xué)院, 遼寧 大連 116023; 2. 設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 大連海洋大學(xué), 遼寧 大連 116023)

氟苯尼考作為氯霉素的替代物, 理化性質(zhì)穩(wěn)定, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中被廣泛使用, 致使其在多種水體環(huán)境中大量殘留。本研究分析了氟苯尼考(0.1、1.0和10 mg/L)對(duì)牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)能力、免疫抗性的影響。結(jié)果表明, 氟苯尼考暴露24 h后, 隨著暴露濃度的增加, 牡蠣幼蟲的存活量呈升高趨勢(shì), 而幼蟲殼高和殼寬顯著降低; 氟苯尼考暴露不會(huì)引起牡蠣幼蟲移動(dòng)速度的變化, 1 mg/L氟苯尼考暴露后, 牡蠣幼蟲移動(dòng)距離呈顯著性增加(<0.05)。氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲存活量及水體細(xì)菌總數(shù)之間呈顯著性相關(guān), 但水體細(xì)菌總數(shù)的變化并不是造成牡蠣幼蟲發(fā)育、生長(zhǎng)狀態(tài)不同的主要原因。牡蠣幼蟲在不同濃度氟苯尼考的暴露下,、和等生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因的表達(dá)受到影響, 進(jìn)而影響其生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)能力。另一方面, 高濃度氟苯尼考的暴露, 引起牡蠣幼蟲和基因相對(duì)表達(dá)量上調(diào), 積極地參與抵抗氟苯尼考暴露引起的應(yīng)激反應(yīng)。養(yǎng)殖水環(huán)境中抗生素殘留可能會(huì)影響水生動(dòng)物早期發(fā)育階段的生長(zhǎng)發(fā)育及免疫抗性, 需提高對(duì)養(yǎng)殖水體中抗生素殘留危害的認(rèn)識(shí)及監(jiān)測(cè), 進(jìn)一步加強(qiáng)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的凈化。

氟苯尼考; 牡蠣幼蟲; 生長(zhǎng)發(fā)育; 運(yùn)動(dòng)行為; 免疫抗性

隨著抗生素的大量生產(chǎn)和廣泛使用, 抗生素可通過(guò)多種途徑進(jìn)入環(huán)境, 包括制藥和醫(yī)療廢水的排放、畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中疫病的治療和預(yù)防用藥等[1]。因部分抗生素具有生物利用性低及不易降解的特性, 導(dǎo)致其常在多種類型的環(huán)境介質(zhì)中被檢測(cè)到[2-4]。水環(huán)境中殘留的抗生素會(huì)對(duì)水生動(dòng)物產(chǎn)生較大的影響, 包括生長(zhǎng)發(fā)育異常、繁殖功能紊亂、生理功能和氧化應(yīng)激水平變化等[5-6]。環(huán)境濃度的磺胺嘧啶暴露斑馬魚胚胎()96 h后, 會(huì)引起胚胎畸形率增多、心跳速率加快、自主運(yùn)動(dòng)增強(qiáng)等現(xiàn)象[7]。利用不同濃度(0、5、10 mg/L)的恩諾沙星浸泡眼斑雙鋸魚幼魚()發(fā)現(xiàn), >5 mg/L的恩諾沙星浸泡24 h后, 對(duì)眼斑雙鋸魚幼魚的消化酶、免疫酶活性和氧化產(chǎn)物含量產(chǎn)生顯著影響[8]。

氟苯尼考(Florfenicol, FFC)屬于聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(FAO)批準(zhǔn)可用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的抗生素之一。作為動(dòng)物專用的氯霉素類廣譜抗生素[9], 氟苯尼考對(duì)氣單孢菌()、鏈球菌()、弧菌()和愛(ài)德華氏菌()等病原菌引起的魚類疾病有明顯的防治效果[10-11], 其理化性質(zhì)穩(wěn)定、不易被水解和生物降解, 大量連續(xù)地向水環(huán)境中排放導(dǎo)致其在水生環(huán)境中呈“假”持久性存在, 常在多種水域生態(tài)環(huán)境中被檢出。有調(diào)查顯示, 我國(guó)江蘇省某規(guī)?；a(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)和丹麥某漁場(chǎng)附近水域中氟苯尼考的殘留量分別為937.21 ng/L和8 ng/L[12-13]。在沿海水域、沉積物及生物體內(nèi)均檢測(cè)到不同濃度的氟苯尼考?xì)埩鬧15], 在大連市的大連灣養(yǎng)殖場(chǎng)周邊的水域檢測(cè)到氟苯尼考?xì)埩魸舛雀哌_(dá)11 mg/L[14]。對(duì)長(zhǎng)江下游的環(huán)太湖流域的養(yǎng)殖區(qū)域進(jìn)行調(diào)查發(fā)現(xiàn), 該流域內(nèi)的養(yǎng)殖生物體內(nèi)幾乎均檢測(cè)出氟苯尼考?xì)埩鬧16]。與早期的氯霉素類藥物相比, 氟苯尼考不會(huì)引起再生障礙性貧血, 但能夠可逆性地抑制紅細(xì)胞生成, 且具有胚胎毒性[17]。氟苯尼考暴露會(huì)抑制虹鱒魚()體內(nèi)吞噬作用、淋巴細(xì)胞增殖等過(guò)程[18], 對(duì)南美白對(duì)蝦()無(wú)節(jié)幼蟲有較高的毒性[19]。

太平洋牡蠣()是我國(guó)重要的海水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)貝類之一, 因其生長(zhǎng)速度快、適應(yīng)能力強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高等特點(diǎn), 在我國(guó)乃至全球大量培育, 具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[20]。水生生物的早期發(fā)育階段對(duì)外源性污染物具有較高的敏感性[21-22], 被認(rèn)為是指示各種污染物毒性的前哨生物[23]。低濃度的抗生素殘留對(duì)成體生物未造成明顯毒性作用時(shí), 卻可能會(huì)引起胚胎和幼蟲的中毒反應(yīng)[24]。

為探究養(yǎng)殖水環(huán)境中氟苯尼考?xì)埩魧?duì)水生動(dòng)物早期生命階段的影響, 本研究以太平洋牡蠣受精卵為研究對(duì)象, 分析不同濃度的氟苯尼考(0.1、1.0和10 mg/L)對(duì)牡蠣幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)能力、免疫抗性等方面的影響, 進(jìn)一步探討氟苯尼考?xì)埩舻臐撛陲L(fēng)險(xiǎn)及其使用的安全濃度范圍。本研究將為水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中抗生素的科學(xué)合理使用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 牡蠣體外人工授精

太平洋牡蠣()于2019年6月購(gòu)自大連市長(zhǎng)興海鮮市場(chǎng), 低溫運(yùn)輸至實(shí)驗(yàn)室, 于海水中暫養(yǎng)一天, 控制水溫為(24 ± 1)℃。挑選健康性腺飽滿的牡蠣用于實(shí)驗(yàn), 使用無(wú)菌解剖針挑取牡蠣性腺進(jìn)行涂片, 在光學(xué)顯微鏡(745T/SMZ1000, Nikon)下觀察, 通過(guò)鑒定生殖細(xì)胞種類確定牡蠣性別, 選擇生殖細(xì)胞活力較好的個(gè)體用于后續(xù)體外授精。

牡蠣親本通過(guò)解剖取卵、人工授精的方法進(jìn)行繁殖。取5只雌性牡蠣和3只雄性牡蠣, 分別剝離牡蠣性腺, 使其通過(guò)400目的篩絹以去除多余的生殖腺組織雜質(zhì), 再使用200目篩絹分別收集卵母細(xì)胞和精子, 于24℃海水中活化20 min, 使卵母細(xì)胞形體趨于飽滿, 激活精子。將卵母細(xì)胞與精子以1︰10的比例混合受精, 保持較暗的光照條件, 不定時(shí)攪動(dòng)水體, 受精15 min后, 利用光學(xué)顯微鏡觀察, 確保受精成功。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

太平洋牡蠣受精卵胚胎毒性的測(cè)定參考Quiniou等人[25]方法。取約300個(gè)/mL受精卵于220×150× 180 mm的玻璃缸中孵化, 加入3 L相應(yīng)濃度的氟苯尼考暴露溶液。受精卵于黑暗條件下培養(yǎng)24 h, 水溫控制在(24 ± 0.5)℃, 持續(xù)微量曝氣。參考氟苯尼考在環(huán)境中檢出的濃度以及養(yǎng)殖過(guò)程中的投喂?jié)舛萚26], 設(shè)置氟苯尼考終濃度為0、0.1、1和10 mg/L, 每組設(shè)置三個(gè)重復(fù)。從牡蠣受精卵開(kāi)始暴露24 h后, 收集樣品, 進(jìn)行下一步分析。

利用高效液相色譜儀(HPLC, SPD-20A, 島津)測(cè)定10 mg/L氟苯尼考暴露液的實(shí)際濃度。流動(dòng)相為乙腈(A)和超純水(B), 流動(dòng)相比例為40︰60(v︰v), 保留時(shí)間為4.2 min。檢測(cè)暴露液中氟苯尼考實(shí)際濃度約為標(biāo)稱濃度的96.2%, 與標(biāo)稱濃度差異性較小, 因此將使用標(biāo)稱濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)計(jì)算。

1.3 水體中細(xì)菌總數(shù)的測(cè)定

測(cè)定不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總數(shù)[27]。取10 mL暴露組水樣, 進(jìn)行等比例稀釋, 制成1︰1、1︰10、1︰100、1︰1 000的樣品勻液。吸取1 mL樣品勻液于瓊脂培養(yǎng)平板中, 涂布均勻, 每個(gè)稀釋度的樣品勻液做三個(gè)平行。在37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后對(duì)菌落進(jìn)行計(jì)數(shù), 選取平板菌落個(gè)數(shù)在30~300個(gè)之間的平板進(jìn)行計(jì)數(shù), 并計(jì)算不同濃度處理組的菌落平均值。

1.4 牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育

氟苯尼考暴露24 h后從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)收集1 mL暴露溶液, 置于細(xì)胞培養(yǎng)皿中于4倍光學(xué)顯微鏡(N-10E, Novel)下統(tǒng)計(jì)牡蠣幼蟲存活量。從各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)挑選20只D型幼蟲, 加入2%的戊二醛進(jìn)行固定, 在顯微鏡下觀察牡蠣幼蟲形態(tài), 并利用NIS-Elements圖像軟件統(tǒng)計(jì)幼蟲的殼高、殼寬。

1.5 牡蠣幼蟲運(yùn)動(dòng)行為檢測(cè)

對(duì)氟苯尼考暴露24 h后牡蠣D型幼蟲的運(yùn)動(dòng)行為進(jìn)行追蹤分析。各實(shí)驗(yàn)組隨機(jī)選取15只牡蠣幼蟲置于48孔微板中, 適應(yīng)5 min后, 使用體視顯微鏡(P-DSL32, Nikon)于16倍鏡下進(jìn)行垂直拍攝5 min。利用視頻追蹤系統(tǒng)(EthoVision XT, Nodus)對(duì)牡蠣幼蟲運(yùn)動(dòng)行為軌跡進(jìn)行分析, 計(jì)算幼蟲游泳距離、移動(dòng)速度。

1.6 熒光定量PCR基因表達(dá)

取氟苯尼考暴露24 h后的牡蠣D型幼蟲置于液氮中冷凍, 于–80℃保存。使用RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取牡蠣幼蟲總RNA, 利用超微量核酸蛋白檢測(cè)儀(IN0311, Monad)檢查RNA濃度(260 nm)和純度(260/280 nm)。使用Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (AG11705, 湖南艾科瑞生物工程有限公司)將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。使用TransStart TOP Green qPCR SuperMix試劑盒(Transgen Biotech)進(jìn)行熒光定量PCR(Lightcycle 96, Roche)。選擇與牡蠣幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)的基因,和, 根據(jù)太平洋牡蠣幼蟲基因組設(shè)計(jì)引物, 序列如表1所示[28]。qPCR反應(yīng)參數(shù)設(shè)置為: 94℃預(yù)變性30 s, 94℃變性30 s, 退火30 s, 72℃延伸60 s, 共30個(gè)循環(huán), 循環(huán)完成后72℃延伸5 min。各引物序列及優(yōu)化的退火溫度如表1所示。選擇核糖體蛋白L7()為管家基因用于標(biāo)準(zhǔn)化其他目標(biāo)基因的表達(dá)水平, 該基因在各處理組間未顯示差異性, qRT-PCR數(shù)據(jù)采用2–ΔΔCt法進(jìn)行分析。每個(gè)樣品測(cè)量進(jìn)行三次檢測(cè)。

表1 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS18.0 統(tǒng)計(jì)軟件和Origin Pro軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析, 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean ± SE)表示。采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)對(duì)對(duì)照組和處理組間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)差異分析, 采用LSD檢驗(yàn)或Duncan法進(jìn)行事后檢驗(yàn)。當(dāng)<0.05時(shí), 認(rèn)為具有顯著性差異, 當(dāng)<0.01時(shí), 認(rèn)為具有極顯著性差異。對(duì)氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲生存量和水體細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析, 選擇分別選擇線性回歸(2)和皮爾遜相關(guān)系數(shù)作為計(jì)算類型, 利用相關(guān)系數(shù)的大小判斷變量間相關(guān)關(guān)系的密切程度。

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲的胚胎毒性

不同濃度氟苯尼考暴露24 h對(duì)牡蠣幼蟲存活量的影響如圖1所示。隨著氟苯尼考暴露濃度的增加, 牡蠣幼蟲的存活量呈上升趨勢(shì), 在10 mg/L的 FFC實(shí)驗(yàn)組中, 牡蠣幼蟲的存活量達(dá)到最高, 約為(122.9± 5.3)個(gè)/mL, 顯著高于對(duì)照組和0.1 mg/L氟苯尼考濃度組(109.9±3.8和101.1±3.6個(gè)/mL), 與1 mg/L氟苯尼考濃度組中的存活量無(wú)顯著性差異。

進(jìn)一步對(duì)氟苯尼考暴露24 h后各實(shí)驗(yàn)組養(yǎng)殖水體中的細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 對(duì)照組水體中細(xì)菌總數(shù)為(214.2±35.3) CFU/mL, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考的實(shí)驗(yàn)組水體內(nèi)細(xì)菌總數(shù)分別為(304.2±58.7) CFU/mL、(296.8±50.4) CFU/mL, 各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組水體中的細(xì)菌總數(shù)并無(wú)顯著性差異。

圖1 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲存活量的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示處理組間具有差異性顯著(<0.05)。

對(duì)氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性進(jìn)行分析(表2)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示, 氟苯尼考暴露濃度與牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)間具有線性關(guān)系, 且水體細(xì)菌總數(shù)與氟苯尼考暴露濃度、幼蟲存活量之間顯著性相關(guān)(0.5<||≤0.8), 氟苯尼考暴露濃度與幼蟲存活量間呈高度相關(guān)性(0.8<||≤1)。

表2 氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲24 h存活量、水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性分析

2.2 氟苯尼考暴露對(duì)牡蠣幼蟲生長(zhǎng)的影響

太平洋牡蠣受精卵在培養(yǎng)24 h后, 進(jìn)入D型幼蟲期, 開(kāi)始早期外殼的發(fā)育。與對(duì)照組相比, 高濃度氟苯尼考(≥1 mg/L)暴露24 h后, 牡蠣幼蟲的大小顯著性降低(圖2)。在1 mg/L、10 mg/L氟苯尼考暴露后, D型幼蟲的殼高顯著降低(<0.05), 殼高的均值分別為(62.95 ± 0.19) μm、(52.83 ± 0.93) μm, 與對(duì)照組相比, 平均殼高分別減少5.50%、20.69%。不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后, D型幼蟲殼寬的變化程度較小, 其中10 mg/L氟苯尼考暴露組對(duì)殼寬(48.49 ± 0.76) μm的抑制作用顯著高于其他實(shí)驗(yàn)組(<0.05), 與對(duì)照組相比降低16.55%。

圖2 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲生長(zhǎng)的影響

注: 不同小寫字母表示不同處理組間殼寬具有差異性顯著(<0.05), 不同大寫字母表示不同處理組間殼高具有差異性顯著(<0.05)。

2.3 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲運(yùn)動(dòng)行為的影響

氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲自主運(yùn)動(dòng)行為的影響如圖3所示。不同濃度的氟苯尼考暴露對(duì)D型幼蟲的移動(dòng)速度均未產(chǎn)生明顯的影響, 但在1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼蟲的移動(dòng)速度呈上升趨勢(shì)(圖3a)。氟苯尼考對(duì)D型幼蟲移動(dòng)距離的影響如圖3b所示, 低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)暴露24 h后, 幼蟲的移動(dòng)距離并無(wú)明顯變化, 在1 mg/L濃度組中D型幼蟲的移動(dòng)距離顯著增加(<0.05), 相比于對(duì)照組(5.80 ± 0.53) cm, 1 mg/L組的移動(dòng)距離增加了53.20%。10 mg/L氟苯尼考暴露后, 對(duì)牡蠣幼蟲的移動(dòng)距離、移動(dòng)速度并未產(chǎn)生明顯影響。

2.4 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

、、和基因參與牡蠣的細(xì)胞發(fā)育和殼的生長(zhǎng)過(guò)程。如圖4所示,、基因的相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)明顯變化(<0.05) (圖4a, b), 而和的轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相似(圖4c, d)。相較于1 mg/L濃度組, 在0.1 mg/L氟苯尼考暴露下, 牡蠣幼蟲中的相對(duì)表達(dá)量顯著增加1.13倍, 高于對(duì)照組、10 mg/L氟苯尼考濃度組, 但無(wú)顯著性差異。各實(shí)驗(yàn)組中牡蠣幼蟲基因的表達(dá)水平與對(duì)照組相似, 但1 mg/L濃度組中基因的表達(dá)水平顯著低于0.1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考濃度組(<0.05), 分別降低為0.47和0.38倍?；蚝偷幕虮磉_(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而下調(diào), 但無(wú)顯著性差異。的表達(dá)水平在10 mg/L氟苯尼考暴露組出現(xiàn)上調(diào)現(xiàn)象, 高于其他實(shí)驗(yàn)組。

圖3 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲移動(dòng)行為的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間差異性顯著(<0.05)

圖4 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間具有顯著性差異(<0.05)。

、和基因與牡蠣的免疫功能相關(guān)。如圖5所示, 氟苯尼考暴露組中基因表達(dá)水平與對(duì)照組相比呈升高趨勢(shì), 但無(wú)顯著性差異。牡蠣幼蟲體內(nèi)基因表達(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而增加, 呈劑量依賴效應(yīng)。與對(duì)照組相比, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露組中基因表達(dá)水平顯著性升高, 分別增加1.41和0.90倍。低濃度氟苯尼考(<1 mg/L)對(duì)基因表達(dá)水平無(wú)明顯影響, 1 mg/L和10 mg/L氟苯尼考暴露組中表達(dá)水平呈下降趨勢(shì)。

圖5 氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲免疫功能相關(guān)基因表達(dá)的影響

注: 不同上標(biāo)字母表示不同處理組間具有顯著性差異(<0.05)。

3 討論

抗生素廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物疾病的預(yù)防和治療, 大量未被吸收利用的抗生素通過(guò)多種途徑最終進(jìn)入到水環(huán)境介質(zhì)中?？股氐臍埩舨粌H會(huì)引起耐藥性的產(chǎn)生, 還會(huì)打破生態(tài)平衡, 影響生物多樣性等。水生動(dòng)植物對(duì)抗生素的富集現(xiàn)象會(huì)導(dǎo)致抗生素沿食物鏈進(jìn)行傳遞并放大, 對(duì)人類健康造成影響。大量研究表明, 高濃度氟苯尼考暴露對(duì)微藻[29-31]、甲殼類水生動(dòng)物[32]等的生長(zhǎng)產(chǎn)生顯著的抑制作用, 但較低濃度的氟苯尼考會(huì)對(duì)微藻生長(zhǎng)產(chǎn)生刺激作用。已有研究利用牡蠣探究農(nóng)藥等污染物的毒性[33-34], 而關(guān)于抗生素對(duì)雙殼類動(dòng)物毒性作用的研究較少。本研究結(jié)果顯示, 牡蠣幼蟲的存活量隨著氟苯尼考暴露濃度的增加而增大。然而, 高濃度的氟苯尼考(>1 mg/L)暴露對(duì)牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生顯著的抑制作用, 牡蠣D型幼蟲的殼高和殼寬均顯著降(<0.05)。牡蠣幼蟲早期發(fā)育階段對(duì)外源性化學(xué)污染物較為敏感, 與殼發(fā)育相關(guān)的生理、生化功能易受到影響, 進(jìn)而影響牡蠣幼蟲后期的附著變態(tài)發(fā)育等過(guò)程。

在水產(chǎn)動(dòng)物人工育苗過(guò)程中, 水體中的細(xì)菌含量與養(yǎng)殖生物胚胎能否健康地生長(zhǎng)和發(fā)育密切相關(guān)[35]。通常認(rèn)為, 添加抗生素會(huì)抑制細(xì)菌病毒的繁殖, 促進(jìn)養(yǎng)殖生物的生長(zhǎng)。本研究中, 不同濃度的氟苯尼考暴露牡蠣幼蟲24 h后, 各處理組的養(yǎng)殖水體中細(xì)菌總數(shù)無(wú)顯著性差異。這可能由于牡蠣幼蟲培育時(shí)間較短, 水體中細(xì)菌總數(shù)含量較低有關(guān)。本研究培育水體中細(xì)菌總數(shù)比其他魚類、貝類養(yǎng)殖水體中細(xì)菌總數(shù)低2~3個(gè)數(shù)量級(jí)[36-37]。根據(jù)氟苯尼考暴露濃度、牡蠣幼蟲存活量及水體細(xì)菌總數(shù)之間的相關(guān)性分析結(jié)果提示水體中氟苯尼考的添加會(huì)對(duì)水體中細(xì)菌的總數(shù)產(chǎn)生影響, 但并不是造成牡蠣幼蟲發(fā)育、生長(zhǎng)狀態(tài)不同的主要原因, 可能還與抗生素種類、作用方式、暴露時(shí)間有關(guān)。

行為反應(yīng)是水生動(dòng)物對(duì)環(huán)境適應(yīng)的直接結(jié)果, 行為學(xué)參數(shù)的研究是識(shí)別和評(píng)估環(huán)境壓力的有效工具[>38]。牡蠣幼蟲的泳動(dòng)能力是貝類浮游幼蟲階段重要的行為表現(xiàn)。不同濃度的氟苯尼考暴露24 h均未引起牡蠣幼蟲移動(dòng)速度的顯著性變化, 牡蠣幼蟲的移動(dòng)距離隨著暴露濃度的增加呈倒“U”型, Guo等[39]研究發(fā)現(xiàn)氟苯尼考暴露會(huì)影響牙鲆初孵仔魚()的自發(fā)性游泳能力, 與本研究結(jié)果相似。低濃度的氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲的移動(dòng)距離無(wú)明顯的影響, 1 mg/L氟苯尼考暴露會(huì)顯著增加牡蠣幼蟲的移動(dòng)距離, 可能由于氟苯尼考會(huì)引起牡蠣幼蟲的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)興奮, 導(dǎo)致其靜止的時(shí)間比例降低。而高濃度的氟苯尼考(10 mg/L)可能會(huì)對(duì)牡蠣幼蟲產(chǎn)生神經(jīng)毒性, 導(dǎo)致其自由泳動(dòng)能力下降。Gamain等人[40]發(fā)現(xiàn)銅和S-異丙甲草胺暴露后, 牡蠣幼蟲直線型運(yùn)動(dòng)軌跡與對(duì)照組無(wú)顯著差異, 但圓形軌跡的百分比顯著增加, 提示10 mg/L氟苯尼考暴露對(duì)牡蠣幼蟲的移動(dòng)能力產(chǎn)生脅迫, 可能導(dǎo)致其游泳多呈圓形軌跡, 使得移動(dòng)距離出現(xiàn)下降趨勢(shì)。

雙殼貝類的早期發(fā)育時(shí)期對(duì)各種環(huán)境壓力較為敏感, 不僅表現(xiàn)在形態(tài)、生理功能改變, 同時(shí)對(duì)細(xì)胞中基因和蛋白質(zhì)水平產(chǎn)生影響。類胰島素生長(zhǎng)因子系統(tǒng)在無(wú)脊椎動(dòng)物生長(zhǎng)、發(fā)育、繁殖等過(guò)程中起著重要作用。胰島素多肽受體基因()在貝類早期發(fā)育過(guò)程中表達(dá)量較高, 負(fù)責(zé)向細(xì)胞內(nèi)傳遞不同配體的信號(hào), 使貝類發(fā)育順利進(jìn)行[41]。本研究中隨著氟苯尼考暴露濃度的升高表達(dá)水平呈先升高后降低趨勢(shì), 可能是由于低濃度的氟苯尼考會(huì)對(duì)牡蠣幼蟲產(chǎn)生的毒性興奮效應(yīng), 激活表達(dá)水平升高, 而高濃度的氟苯尼考暴露抑制表達(dá), 影響細(xì)胞內(nèi)配體的信號(hào)傳遞, 進(jìn)而可能會(huì)影響牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育?；蚺c軟體動(dòng)物的非鈣化殼的形成有密切的關(guān)系, 參與貝殼角質(zhì)層的形成[42], 在1 mg/L氟苯尼考的暴露下,基因水平出現(xiàn)顯著性下降(0.05), 提示氟苯尼考暴露可能會(huì)抑制牡蠣幼蟲殼的生成與鈣化, 這與前文D型幼蟲的生長(zhǎng)結(jié)果相一致?；騾⑴c細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和細(xì)胞解毒等過(guò)程, 10 mg/L氟苯尼考的暴露引起基因表達(dá)水平的上調(diào), 可能是氟苯尼考參與了細(xì)胞內(nèi)催化氧化反應(yīng), 促進(jìn)官能團(tuán)與極性分子結(jié)合, 使得其水溶性增加進(jìn)而促進(jìn)排泄, 對(duì)氟苯尼考起到解毒的功能[43]。牡蠣幼蟲內(nèi)鐵蛋白參與牡蠣幼蟲纖毛功能的發(fā)育, 氟苯尼考暴露降低了基因的表達(dá)水平, 進(jìn)而影響牡蠣幼蟲的自主運(yùn)動(dòng)能力。

牡蠣在面對(duì)生物或非生物壓力時(shí), 可催化細(xì)胞內(nèi)羥基自由基的形成, 細(xì)胞受到氧化脅迫的影響。在氟苯尼考的暴露下, 牡蠣幼蟲的基因、免疫功能基因變化較小。參與保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[44]。隨著氟苯尼考暴露濃度的增加,基因相對(duì)表達(dá)量出現(xiàn)上升趨勢(shì), 提示其可能參與機(jī)體抵御氟苯尼考暴露引起的氧化脅迫。在牡蠣血細(xì)胞內(nèi)特異性表達(dá), 與早期造血細(xì)胞的形成相關(guān), 在誘導(dǎo)造血活性的雙殼軟體動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中起作用。Auffret等[45]人研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)多環(huán)芳烴暴露濃度超過(guò)100 μg/L時(shí), 歐洲扇貝()血細(xì)胞數(shù)量增加, 這是面對(duì)環(huán)境脅迫時(shí)一種常見(jiàn)的反應(yīng)。本研究中基因表達(dá)水平隨著氟苯尼考暴露濃度的升高而顯著上升, 說(shuō)明基因積極參與氟苯尼考暴露引起的機(jī)體免疫排斥反應(yīng)。家族在細(xì)胞凋亡途徑中對(duì)凋亡信號(hào)的誘導(dǎo)、轉(zhuǎn)導(dǎo)和增殖起著重要的作用, 通過(guò)對(duì)靶蛋白的水解, 導(dǎo)致程序性細(xì)胞死亡[46]。隨著暴露濃度的升高,相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著性變化, 提示氟苯尼考暴露雖然會(huì)對(duì)牡蠣幼蟲產(chǎn)生氧化脅迫作用但不會(huì)引起牡蠣幼蟲發(fā)生細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。

綜上, 本研究結(jié)果提示處理濃度的氟苯尼考雖然會(huì)提高牡蠣幼蟲的存活量, 但對(duì)牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生了顯著的抑制作用, 隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng), 可能會(huì)導(dǎo)致牡蠣幼蟲外殼的畸形與鈣化, 影響牡蠣幼蟲后期變態(tài)發(fā)育及附著。此外, 高濃度的氟苯尼考(10 mg/L)暴露會(huì)造成纖毛功能的損傷, 影響牡蠣幼蟲的自主運(yùn)動(dòng)能力, 可能會(huì)對(duì)其攝食產(chǎn)生影響。因此, 在養(yǎng)殖育苗過(guò)程中, 需密切注意養(yǎng)殖水體的水質(zhì)狀態(tài), 提高對(duì)養(yǎng)殖水體中抗生素殘留危害的認(rèn)識(shí)及監(jiān)測(cè), 進(jìn)一步加強(qiáng)養(yǎng)殖水體水質(zhì)的凈化。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以太平洋牡蠣幼蟲為實(shí)驗(yàn)對(duì)象, 研究不同濃度的氟苯尼考暴露24 h后對(duì)牡蠣幼蟲早期生命階段生長(zhǎng)發(fā)育的影響, 探討氟苯尼考對(duì)牡蠣幼蟲的作用機(jī)理, 得到以下結(jié)論:

1) 高濃度氟苯尼考(10 mg/L)暴露顯著增加牡蠣幼蟲的存活量。低濃度的氟苯尼考暴露(0.1 mg/L)對(duì)牡蠣幼蟲的大小未產(chǎn)生顯著性影響, 當(dāng)暴露濃度高于1 mg/L時(shí), 牡蠣幼蟲的殼高、殼寬顯著降低。

2) 氟苯尼考暴露對(duì)牡蠣D型幼蟲的移動(dòng)速度影響較小, 明顯影響牡蠣幼蟲的移動(dòng)距離。1 mg/L氟苯尼考的暴露后, D型幼蟲的移動(dòng)速度有上升的趨勢(shì), 移動(dòng)距離顯著性增加(<0.05)。

3) 氟苯尼考通過(guò)影響牡蠣幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)基因和的表達(dá), 進(jìn)而對(duì)牡蠣幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育、運(yùn)動(dòng)能力等產(chǎn)生影響;

4) 氟苯尼考暴露會(huì)對(duì)牡蠣幼蟲產(chǎn)生氧化脅迫作用,和基因參與保護(hù)細(xì)胞免受氟苯尼考引起的氧化應(yīng)激損傷。

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Effects of florfenicol on the development ofduring the early developmental stage

ZHANG Ying-qi1, 2, ZHANG Xian-yu1, 2, GUO Qing-fang1, XU Wen-hao1, MA Zheng1, SHI Shuo1, ZHANG Qian1, 2, LIU Ying1, 2

(1. College of Marine Science and Environment, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China; 2. Key Laboratory of Environment Controlled Aquaculture, Ministry of Education, Dalian Ocean University, Dalian 116023, China)

Florfenicol, the alternative of chloramphenicol, is the most commonly used antibiotic in aquaculture. Its residues are widely distributed in the aquatic environment because of its low degradability. In the present research, the effects of florfenicol (0.1, 1.0, and 10mg/L) on the growth and development, motor behavior, and immunity oflarvae during the early developmental stage were investigated. The results showed that the survival of larvae increased with increasing florfenicol concentration, whereas the shell height and shell width of the larvae considerably decreased after exposure for 24h. Further, there was little effect on moving velocity, and the moving distance considerably increased when exposed to florfenicol at the concentration of 1mg/L.The correlations among the concentration of florfenicol, survival of the larvae, and total number of bacteria were observed, In contrast, the total numbers of bacteria may not be the main reason for the differences in growth and development. Florfenicol affected the mRNA expression of,and, which further influenced the growth and development as well as the motor ability of the larvae. On the other hand, the high concentration of florfenicol induced oxidative stress in the larvae, the levels ofandwere upregulated, and they participated in the immune stress response. The antibiotic residues in aquaculture may affect the growth and immunity of animals during the early developmental stage. Thus, it is necessary to improve the understanding and monitoring of antibiotic residues in the aquatic environment and to strengthen the water purification efforts.

florfenicol; oyster larvae; growth and development; motor behavior; immune resistance

Jun. 29, 2020

R994.6

A

1000-3096(2021)01-0100-10

10.11759/hykx20200629002

2020-06-29;

2020-08-01

廣東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2019B020215001); 遼寧省自然基金計(jì)劃項(xiàng)目(2019-BS-035); 遼寧省高水平創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)境外培養(yǎng)項(xiàng)目(201818); 工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)放課題(KLIEEE-17-12)

[the Key R&D Program of Guangdong Province, No. 2019B020215001; the PhD Research Funds of Liaoning Province, No. 2019–BS-035; Overseas Training Program for Innovation Team of Liaoning Province, No. 201818; Foundation of Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering, Ministry of Education, No. KLIEEE-17-12]

張鶯臍(1995?), 女, 遼寧省盤錦, 學(xué)士學(xué)位, 在讀研究生, 主要從事水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素相關(guān)研究, 電話: 15504177520, E-mail: 1430152168@qq.com; 張倩,通信作者, 講師, E-mail: qianzhang@ dlou.edu.cn

(本文編輯: 楊 悅)