柑橘黃龍病藥物防治策略

韓鶴友，程帥華，宋智勇，丁芳，徐強

1.農(nóng)業(yè)微生物學國家重點實驗室/華中農(nóng)業(yè)大學生命科學與技術學院，武漢430070；2.華中農(nóng)業(yè)大學理學院，武漢430070；3.湖北省作物病害檢測和安全控制重點實驗室/華中農(nóng)業(yè)大學植物科學技術學院，武漢430070；4.園藝植物生物學教育部重點實驗室/華中農(nóng)業(yè)大學園藝林學學院，武漢430070

柑橘黃龍病(citrus Huanglongbing)或青果病(citrus greening disease)是柑橘生產(chǎn)上最具破壞力的病害之一，在全球范圍內(nèi)造成了重大的經(jīng)濟損失[1]。早在20世紀，國內(nèi)外科學家針對黃龍病病原體的演化過程開展了相關研究，最初的研究認為黃龍病是由水害引起[2]，直到林孔湘的嫁接試驗認為其是由病毒感染所致[3]。1979年柯沖使用電子顯微鏡觀察到類立克次體(RLO)[4]，1994年Jagoueix等[5]對黃龍病病原的非洲株系和亞洲株系的16S rDNA 基因進行測序比對分析后，才最終確認黃龍病病原為革蘭氏陰性細菌。病原體Candidatusliberibacter因只在柑橘韌皮部中生存，所以稱之為韌皮部限制性細菌，通過帶病苗木和媒介木虱Diaphorinacitri( Kuwayama)、Triozaerytreae(Del Guerci)、Cacopsyllacitrisuga(Yang & Li) 傳播蔓延，屬于α-變形菌綱，包括3個暫定種，分別是亞洲種‘Ca.L.asiaticus’(CLas)，非洲種‘Ca.L.africanus’(CLaf)，美洲種‘Ca.L.americanus’(CLam)[1,6]。

現(xiàn)有的商業(yè)化柑橘品種均易被黃龍病菌感染[7]，病癥在幼苗期主要表現(xiàn)為植株矮小化、抽梢困難、葉片斑駁黃化；成熟期則表現(xiàn)為黃梢、果皮綠化、果肉苦澀，嚴重影響商業(yè)價值[1]。通常在病發(fā)后的幾年內(nèi)黃化枯萎，給果農(nóng)帶來巨大經(jīng)濟損失。由于黃龍病癥狀的復雜性，通過癥狀表型來診斷黃龍病較為困難。盡管高靈敏度qPCR技術可用于疑似患病柑橘的診斷，但繁瑣的樣品準備過程、高昂的檢測成本、依賴訓練有素的檢驗人員以及診斷后柑橘樹被挖除造成的經(jīng)濟損失等，都促使研究人員開發(fā)新型快速簡便的黃龍病菌診斷技術和高效防控策略。

“三板斧”被認為是目前最有效的黃龍病防控策略，即選用無病苗木、及時挖除病株、大面積連片防治木虱。但是在實際的防控過程中，“三板斧”仍然存在以下問題：(1)大規(guī)模挖除病株造成了巨大的經(jīng)濟損失；(2)木虱成蟲易感染CLas且繁殖能力極強，同時，由于受到“感染柑橘”物理因素和化學因素的誘導[8]，要實現(xiàn)對木虱遷徙和繁殖的完全控制存在許多困難；(3)農(nóng)藥的長期使用誘導了耐藥性木虱的產(chǎn)生[9-10]。而從目前黃龍病防控效果來看，“三板斧”策略雖可有效地控制和預防黃龍病規(guī)模性傳播，但是無法徹底解除黃龍病的潛在威脅。

針對CLas基因組的研究結果表明，該菌基因組相對較小，缺少某些細菌生長發(fā)育所必需的持家基因，同時也缺乏合成多種氨基酸的能力，不能還原硫酸鹽，這可能是CLas限于韌皮部位生長和難于在體外培養(yǎng)的原因[11]；模擬韌皮部環(huán)境體外培養(yǎng)CLas也未能完成科赫氏法則驗證，極大地阻礙了黃龍病菌防治藥物的研發(fā)速度和進程[12-13]。基于上述原因，包括抗生素藥物、窄譜靶向藥物、免疫誘導制劑、納米制劑在內(nèi)的多類抗菌劑受到廣泛關注。

抗生素具有抗菌生理活性，可在短期內(nèi)降低柑橘樹體內(nèi)的CLas濃度,控制黃龍病的病情[14-15]，是當前治療黃龍病最有效的化學藥物。窄譜高效的小分子靶向藥物不易引起細菌耐藥性,安全性高，但CLas無法體外純培養(yǎng)，導致靶向小分子藥物的篩選只能依賴于CLas的模式親緣細菌，其研究進展也慢于常規(guī)農(nóng)作物病害藥物的篩選[16-18]。此外，小分子柑橘免疫誘導物(例如ROS等)可激活柑橘自身的免疫系統(tǒng)和抗性蛋白基因抵抗病原菌的感染，被認為是目前化學藥物控制黃龍病的綜合措施之一[19-20]。而利用納米技術的獨特優(yōu)勢在改善抗菌劑溶解濃度、植物傳質(zhì)和新型抗菌金屬制劑等方面也有極大的應用前景，是當前農(nóng)業(yè)病害保護領域最具前景的研究領域，或可取代當前鋅、銅制劑作為有效的抗菌農(nóng)用藥劑抑制果園黃龍病的病情[20-23]。

1 抗生素療法

抗生素對細菌感染的植物有著極強的療效，在40多種抗生素當中，農(nóng)業(yè)領域商業(yè)化使用的抗生素只有10種，包括中國、美國、墨西哥、歐洲、中東等地都曾使用抗生素對抗植物細菌性病原，其中僅有鏈霉素和四環(huán)素被廣泛應用在蘋果、番茄、梨樹等農(nóng)作物疾病的治理[24-25]。早在20世紀70年代，人們對黃龍病發(fā)病原因還未完全探明之前，抗生素就已經(jīng)被證明具有治療黃龍病的作用[1]。圍繞鹽酸四環(huán)素防控黃龍病，我國開展了相關研究，隨著黃龍病病原菌的發(fā)現(xiàn)，包括中國、印度、南非在內(nèi)的許多國家和地區(qū)都開始使用四環(huán)素來治療黃龍病，通過無病接穗培育無病苗，進一步抑制果園黃龍病病情[26-27]。然而，四環(huán)素只是一種抑菌劑，在使用過程中，仍需對柑橘樹重復治療，且四環(huán)素的反復使用對柑橘樹產(chǎn)生了較大的生理毒性，限制了其在果園中的廣泛使用。

研究者們圍繞抗生素藥物抗黃龍病開展了系列研究。在抗菌活性和生理毒性研究方面，將感染黃龍病的柑橘接穗用抗生素浸泡1～2 h后，嫁接至健康的柑橘砧木上生長4～6個月，根據(jù)砧木上黃龍病菌的濃度、柑橘生長情況，將處理結果分成高效組、低效組、無效組3組(表1)。結果表明，青霉素、鹽酸土霉素、磺胺類抗生素處理后黃龍病菌濃度均低于qPCR的檢測閾值，柑橘接穗生長速率、存活率與對照組相當[15]；除此之外，目前采用樹干注射青霉素、磺胺二甲氧嘧啶鈉、鹽酸土霉素制劑治療黃龍病的效果也表明這3類抗生素是當前最有效的治療藥物[14,28-29]。圍繞如何減小抗生素的使用量和增強黃龍病治療效果，科研人員開展了抗生素混合制劑的研究。例如，單獨使用鏈霉素不能達到抑制CLas的效果[14]，但混合鹽酸土霉素后注射染病的甜橙樹，治療后癥狀的恢復度明顯優(yōu)于單獨使用鹽酸土霉素[14]；類似的研究結果也表明青霉素和鏈霉素的聯(lián)合使用增強了青霉素抑制CLas的效率[30-31]。由于抗生素抑制黃龍病的效果本質(zhì)上依賴于藥物被柑橘吸收、轉運至細菌生長部位的效率，因此，抗生素在柑橘內(nèi)部吸收和傳質(zhì)的動力學行為，作為改善抗生素治療黃龍病的重要方面，受到研究者的極大重視。我國早期黃龍病的研究表明，土壤肥料中加入抗生素的方式對黃龍病無治療效果；傳統(tǒng)葉面噴施受到蠟質(zhì)層的限制使抗生素傳質(zhì)效率低下，而注射法相對于葉面噴灑法，可以直接將抗生素分子遞送至木質(zhì)部，并分配至植物的各個器官。例如，樹干注射的土霉素從注射點轉運至莖、葉等各器官組織中。據(jù)測算，即使是在不利于莖下傳質(zhì)的根部，土霉素濃度都足以抑制CLas[32]；改進的輸液滴干法使用青霉素和四環(huán)素也減輕了葉片黃化癥狀[33]。

如表2所示，抗生素治療黃龍病的研究雖然取得了顯著的成效，可以作為無病接穗的處理藥物，但由于藥劑傳質(zhì)至韌皮部和根部的效率差以及CLas分布不均一等原因，導致抗生素無論在根、莖、葉等部位均未能完全殺滅病菌，尤其是根部CLas更是難以徹底清除，致使抗生素治療后病情易反復。藥劑混配、傳質(zhì)方式改變等策略為解決當前抗生素生物利用效率低、傳質(zhì)效率差等問題提供了新的思路。

表1 抗生素對黃龍病菌的抗菌活性和對柑橘的生理毒性[15] Table 1 Activity of antibiotics against huanglongbing pathogen and their physiological toxicity to citrus reference[15]

表2 抗生素對柑橘黃龍病治療效果的試驗評估 Table 2 Evaluation of the effection of antibiotics on citrus Huanglongbing

續(xù)表2 Continued Table 2

2 窄譜靶向藥物

尋找高效黃龍病菌靶向藥物，是當前柑橘黃龍病綜合防控研究的一個熱點。鑒于CLas難于離體純培養(yǎng)的特性，目前藥物的靶標設計主要依賴于CLas親緣菌，包括Sinorhizobiummeliloti和LiberibactercrescensBT-1等模式菌型均被用于CLas基因功能研究和小分子靶向藥物活性的初步體外鑒定[11-12]。黃龍病菌靶向藥物研究雖然開展多年，但仍缺乏可以用于治療和標記示蹤的靶向小分子藥物。本文依據(jù)黃龍病菌的靶向藥物研究歷程進行梳理，為后續(xù)的相關研究提供借鑒和指導。

2.1 靶標：ABC轉運系統(tǒng)

靶標蛋白原則上要求具有重要的生理功能，例如，細菌分泌的毒力因子、基因表達所必需的轉錄調(diào)控因子、應激酶等，藥物分子在與靶標結合后要達到抑制細菌生長和影響浸染活性的效果。而CLas具有唯一確定的ABC運輸分泌系統(tǒng)，在細菌浸染植物的過程中會釋放分泌蛋白，包括外分泌毒素因子和細菌信號分子。這些蛋白與細菌的有效感染密切相關，因此，分泌相關蛋白可以作為黃龍病治療中一類重要的潛在藥物靶標[35]。SecA是存在于CLas細胞膜上的外分泌蛋白轉運酶，可與SecY、SecE等相互作用，介導著CLas外分泌蛋白的菌體外分泌[36-37]。因此，缺乏SecA會導致細菌功能和感染能力的紊亂。Akula等[36-37]基于SecA的結構特征，通過分子結合的方法設計了能夠結合SecA蛋白ATP活性結構域的小分子藥物 (圖1， 1～5)。體外試驗表明，這5種小分子藥物對Agrobacteriumtumefaciens展示出較強的抗菌能力。

2.2 靶標：轉錄調(diào)控因子

CLas的基因轉錄調(diào)節(jié)系統(tǒng)較為簡單，LdtR、PrbP單一轉錄調(diào)節(jié)因子活性變化會影響到整個基因組的轉錄，這使得它們可以作為潛在的藥物靶標[16,35,38]。基因CLIBASIA_01510的編碼蛋白PrbP與黃龍病病菌致病機制、細菌感染能力以及環(huán)境脅迫抵抗力有關[38]，托芬那酸(圖2-1)作為PrbP配體，可破壞PrbP-RNAP和PrbP-DNA的相互作用，進而破壞開放復合物形成，影響細菌的轉錄水平[38]。試驗表明，托芬那酸根部浸泡和葉面噴霧劑處理黃龍病病苗，可抑制70%細菌。治療效果顯示，染病幼苗根部可被快速治療，因此，托芬那酸是極具潛力的黃龍病治療藥物[38]。轉錄調(diào)控因子LdtR，被認為是細菌感受環(huán)境變化的傳感器，可以感受糖水平的變化，降解植物免疫化合物，影響細菌耐藥性。植物韌皮部滲透壓變化幅度較大，而感受滲透壓變化對細菌在韌皮部的生長極為重要。研究發(fā)現(xiàn)，在CLas中LdtR有感受和調(diào)節(jié)細胞滲透壓的能力，而LdtR對CLas在韌皮部的生存能力有著較大的影響[39]。同時，LdtR對LdtP的啟動子還有高親合性，能夠結合并激活LdtP基因的轉錄，起到調(diào)節(jié)細胞壁肽聚糖修飾的功能，影響細胞壁合成及細菌響應滲透壓變化[39]。利用靶向化學藥物對體外Sinorhizobiummeliloti和LiberibactercrescensBT-1進行篩選，發(fā)現(xiàn)根皮素(Phloretin)和苯溴馬隆(Benzbromarone)(圖2-2，2-3)可以結合LdtRLcr和LdtRSmc，抑制L.crescens和S.meliloti的生長，導致細菌形態(tài)萎縮，減弱細菌耐高滲透壓的能力。與對照組相比，根皮素和苯溴馬隆顯著降低了LdtRCLas的活性，影響了細菌的形態(tài)，顯示出潛在的黃龍病治療效果[39]；進一步的研究表明，苯溴馬隆處理的模式細菌樣本，其RNA轉錄本中252個基因表達程度發(fā)生了變化(CLas同源基因182個)，其中LdtRCLas具有調(diào)控基因表達的功能，影響生理代謝過程，主要包括轉錄調(diào)節(jié)、細胞壁合成、能量代謝、細胞運動等[17]。

2.3 其他靶點

YbeY具有RNA核酸內(nèi)切酶活性，失活后會導致細菌感染、環(huán)境響應、糖類化合物利用能力的下降，所以YbeY被認為是目前治療黃龍病最有效的潛在靶點。Zuo等[18]通過基因組比對分析發(fā)現(xiàn)CLIBASIA_01560基因與大腸桿菌YbeY基因存在著42%的序列同源性，體外試驗證實YbeYCLas具有16S rRNA 3’和5’內(nèi)切酶活性；采用靶點口袋結合的方法篩選到小分子藥物木犀草素(Luteolin)(圖2-4)。研究表明，在感染黃龍病菌的植株中，木犀草素可有效抑制YbeY的RNA酶活性，干擾CLas的生理活動活性，因此，可作為潛在黃龍病的靶向藥物。

圖1 SecA靶點治療小分子藥物

圖2 黃龍病病菌PrbP、LdtR、YbeY靶點治療化合物

3 免疫誘導治療

系統(tǒng)性獲得抗性(system acquired resistance，SAR)是植物受外來病原體入侵而誘導的抗性機制，涉及到特殊的防御信號轉導途徑，是植物重要的主動防御機制。當病原體感染植株或使用植物誘導物后，植株在全株表現(xiàn)出系統(tǒng)性的抗性。水楊酸SA(salicylic acid)和水楊酸甲酯是柑橘SAR途徑的重要信號傳遞分子，參與植物的抗病調(diào)控。柑橘受到CLas感染后，水楊酸甲酯的表達水平明顯上升，在葉綠體水楊酸甲基轉移酶的作用下，MeSA轉化為SA，并誘導轉錄因子結合物還原并進入細胞核，結合轉錄調(diào)節(jié)因子提升病原體相關蛋白(pathogenesis-related protein，PR)的表達，行使自我免疫功能[40-41]。但SA誘導的免疫在抵抗黃龍病菌時有一定的缺陷，CLas、Clam、CLaf測序表明，黃龍病菌含有潛在的水楊酸羥基化酶基因 (CLIBASIA_00255)[35,42-43]，能夠合成水楊酸羥基化酶，將SA和其天然代謝變體轉化為活性較低的羥基水楊酸[44]，SA的降解致使免疫途徑受阻，PR蛋白的轉錄水平大幅度下降，這不僅降低了柑橘樹對外來病原體的抗性，同時還降低了對外源SA的感受能力[44]。

研究發(fā)現(xiàn)，使用低分子質(zhì)量的化學制劑可代替SA，起到同樣的效果。通常這些免疫誘導物具有以下特征：(1)自身不具有殺菌能力；(2)能夠激活植物SAR免疫途徑；(3)對細菌的抑制酶不敏感[20]。在柑橘潰瘍病治療中發(fā)現(xiàn)，免疫誘導物吡蟲啉、苯并噻二唑、2，6-二氯異煙肼、β-氨基丁酸等可激活柑橘SAR，大幅度提升PR-2基因的表達，抑制致病菌Xanthomonascitrisssp.對柑橘樹的感染[45-47]。Palmer等[20]根據(jù)SA結構，設計的結構類似物在擬南芥葉片中同樣增強了PR蛋白的表達，表明這些小分子具有潛在的柑橘免疫誘導活性，可作為潛在的黃龍病防治藥物。

當前，已證實部分小分子誘導物可用于柑橘黃龍病的治療。例如，在新梢抽發(fā)之季噴灑誘導物β-氨基丁酸、2,1,3-苯并噻二唑、2，6-二氯異煙肼、抗壞血酸、2-脫氧-D-葡萄糖后，PR類蛋白的表達量會大幅度提升，黃龍病的典型癥狀如葉片黃化斑駁在治療期間也會得到有效緩解，但治療效果受到柑橘樹齡的影響很大，幼年柑橘苗的恢復效果明顯優(yōu)于成熟的柑橘樹[48]。染病柑橘樹干注射草酸、磷酸二氫鉀、苯并噻二唑、β-氨基丁酸、2，6-二氯異煙酸同樣也降低了黃龍病菌的濃度，其中苯并噻二唑可顯著提升PR-1、PR-2蛋白的表達量，草酸能夠顯著提升PR-15蛋白的表達達到植物免疫的目的[14]。雖然免疫誘導物具有治療黃龍病的效果，但其使用受到主體植物的表型、氣候、營養(yǎng)、土壤等條件的影響很大[14]；除此之外，誘導免疫反應對營養(yǎng)的競爭還會導致植株生長受限，因此，改善營養(yǎng)條件對于誘導物黃龍病治理效果有很大的影響。Li等[19]聯(lián)合熱療法、肥料施用、堆肥等控制黃龍病的策略，在田間對誘導物的黃龍病治療效果進行了評估，旨在發(fā)現(xiàn)一種實際有效的田間誘導治療黃龍病的方法。其中，β-氨基丁酸和抗壞血酸在施用氮肥后不僅治療效果顯著，而且柑橘產(chǎn)量有很大的提升，因此，改善土壤、施用肥料的措施可以與誘導物一起形成黃龍病綜合治理的有效方法。雖然免疫誘導物在黃龍病的免疫治療當中起到了一定的作用，但仍然存在不足：(1)常規(guī)誘導物的免疫誘導作用弱于天然誘導物水楊酸；(2)單獨使用誘導物并不能有效控制黃龍病病情等。因此，圍繞免疫誘導物，如何結合其他藥物達到共同治療黃龍病的目的，是免疫誘導物研究今后關注的重點內(nèi)容。

4 柑橘黃龍病的納米藥物防治策略

納米技術在農(nóng)業(yè)領域被認為是一項有助于控制作物病蟲害增加作物產(chǎn)量的新技術，包括：(1)應用納米傳感器對植物病害進行診斷；(2)納米制劑減小農(nóng)藥的使用量；(3)使用金屬納米制劑控制植物病害。在黃龍病化學藥物治療領域當中，面臨的最大難題是柑橘葉片表面的超疏水蠟質(zhì)層導致藥物傳遞效率極低，而納米粒子具有較小的尺寸(1～100 nm)和巨大的比表面積以及可在其表面修飾不同的化合物等特性，可改變藥物疏水性質(zhì)、增加柑橘葉片對藥物的吸收。例如， Yang等[34]合成的阿莫西林-Brij-35納米乳(液滴尺寸5.26 ± 0.04 nm 和94 ± 1.48 nm)不僅增強了抗生素在水中的溶解度，還提高了抗生素進入柑橘葉片的有效濃度，“突破”了蠟質(zhì)層對藥物分子運抵韌皮部的屏障，藥物傳遞效率提升了3.3倍，治療效果相對于非納米乳制劑有顯著提升。Hu等[49]利用以N-甲基-2-吡咯烷酮和二甲亞砜為溶劑和助溶劑，聚氧乙烯蓖麻油、聚亞烷基二醇和聚氧乙烯十三烷基醚磷酸酯為表面活性劑合成了具有治療功能的納米乳劑。結果表明，包括Agrobacteriumtumefaciens、Escherichiacolistrain DH5α、Liberibactercrescens、Xanthomonascitrisubsp.citri、Rhizobiumetli、Bradyrhizobiumjaponicum、Mesorhizobiumloti和Sinorhizobiummeliloti在內(nèi)的8種細菌，靶向藥物納米乳劑(圖1，6～16)的最小殺菌濃度都幾乎相當于鏈霉素，相對于常規(guī)的靶向藥物，藥效得到了顯著提升。

鋅制劑在植物病害保護中有重要的作用，而氧化鋅一直被視作農(nóng)業(yè)肥料，但其較低的溶解度限制了其在黃龍病防治中的應用，而納米技術為提高其生物利用度提供了新的思路。納米級金屬制劑具有較高的溶解度和巨大的比表面積，可以催化產(chǎn)生單線態(tài)氧，表現(xiàn)出強大的殺菌能力[22]。二維結構的納米氧化鋅在控制柑橘潰瘍病方面比銅金屬抗菌劑更強的作用，研究表明，噴灑0.56 kg/hm2的納米氧化鋅治療感染潰瘍病的重癥柑橘，幼苗的感染率平均下降了40%，而成熟柑橘樹的感染率下降15%，同時，在治療期間并沒有觀察到顯著的生理毒性[50]。330 mg/L(1∶1)二硫白蛋白-納米氧化鋅(4 nm)復合溶液，樹干注射感染黃龍病的嫁接柑橘甜橙，在1-3月中抑菌效果高達97%，細菌濃度相對于水控制組減小了21～43倍[21]。除鋅納米粒子外，銀納米粒子也被廣泛地應用于抗菌制劑的開發(fā)，銀膠(50 mg/L)(10～100 nm)和氫氧化鋁(200 mg/L)浸泡過的患黃龍病嫁接柑橘樹6個月后的綜合指數(shù)顯示，治療效果是對照處理(水/DMSO)的2.5～5倍，氫氧化鋁處理過的柑橘癥狀基本恢復正常[51]。Zhang等[23]通過3 a的田間試驗，對3年生的黃龍病陽性柑橘葉面噴灑200 mg/L硝酸銀和福賽特鋁(5.60 kg/hm2)進行聯(lián)合熱處理，結果表明，二者對黃龍病治療效果良好。這些試驗都證實，金屬納米藥物可有效地清除黃龍病或通過設計完成對黃龍病的治療。

5 展 望

柑橘黃龍病作為世界上危害柑橘生產(chǎn)的主要病害，目前仍無根除柑橘黃龍病的有效方法，嚴重制約著柑橘產(chǎn)業(yè)的高質(zhì)量發(fā)展。納米技術的出現(xiàn)為柑橘黃龍病的防治提供了新思路、新方法和新技術。利用納米技術創(chuàng)制高效、低殘留的納米農(nóng)藥已成為綠色農(nóng)藥領域的研究熱點，以防治柑橘黃龍病的有效性與安全性為目標，開展多學科交叉的聯(lián)合攻關，探究納米農(nóng)藥與病菌及植物間的互作原理，解析納米藥物的靶向遞送機制，推動納米技術在包括柑橘黃龍防控在內(nèi)的農(nóng)業(yè)領域中的應用研究。