1株克氏原螯蝦摩氏摩根菌的分離鑒定及聯(lián)合藥敏試驗

董靖，劉永濤，胥寧，劉紹春，楊秋紅，楊移斌，周順，艾曉輝

1.中國水產科學研究院長江水產研究所/湖北省水產品質量安全工程技術研究中心，武漢 430223；2.岳陽漁美康生物科技有限公司，岳陽 414100

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)俗稱小龍蝦，原產于北美洲，1929年自日本傳入中國，現(xiàn)已成為我國水產養(yǎng)殖的重要養(yǎng)殖品種之一。近年來，伴隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大和養(yǎng)殖密度的增加，克氏原螯蝦產業(yè)發(fā)展也遇到了問題和挑戰(zhàn)，如野生資源下降導致的種質退化、養(yǎng)殖模式標準化程度低、病害頻發(fā)等問題[1]?？耸显r傳染性疾病具有暴發(fā)特征，通常會導致大量死亡甚至絕產，成為克氏原螯蝦健康養(yǎng)殖的主要威脅[2]。

摩氏摩根菌(Morganellamorganii)是一種廣泛存在于自然界中的條件性致病菌，能感染動物和人，是一種人獸共患病原菌[3-4]。該菌呈短桿狀，革蘭氏染色陰性，在水產養(yǎng)殖中能導致多動水產動物如中華鱉(Pelodiscussinensis)、大鯢(Andriasdavidianus)、烏鱧(Channaargus)、胡子鯰(Clarisfuscus)等出現(xiàn)內臟充血出血、肌肉充血和皮膚出血潰爛等癥狀，嚴重者甚至出現(xiàn)大量死亡[5-8]。筆者從患病克氏原螯蝦肝胰腺內分離到1株能導致克氏原螯蝦大量死亡的病原菌。筆者對該分離株進行了分離鑒定,并檢測分析了該菌對常見抗菌藥物的敏感性以及抗菌藥物與天然化合物的聯(lián)合抑菌作用，旨在為克氏原螯蝦“五月瘟”病原分析和疾病防控提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

患病克氏原螯蝦從湖北省潛江市某養(yǎng)殖場采集；攻毒用健康蝦由筆者所在實驗室臨床試驗基地提供；藥敏紙片購自杭州微生物試劑有限公司；腦心浸液培養(yǎng)基、MH培養(yǎng)基購自青島海博生物有限公司；天然化合物購自四川維克奇公司；PCR Master Mix、細菌基因組提取試劑盒等分子生物學試劑購自南京諾唯贊公司。

1.2 細菌分離和純化

取患病克氏原螯蝦，在無菌工作臺中用無菌生理鹽水沖洗體表3～5次后剖取其肝胰腺。肝胰腺經無菌生理鹽水沖洗后在勻漿器中勻漿，取勻漿液在腦心浸液(BHI)固體培養(yǎng)基上劃線，28 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)16～20 h。從長好細菌的平板挑取單菌落繼續(xù)劃線2～3次對細菌進行純化，純化好的細菌標記為QJ20190513，并制備甘油菌保存于-80 ℃。

1.3 回歸感染試驗

QJ20190513分離株單菌落在BHI液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數生長中期后采用麥氏比濁法將菌液濃度調整至1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105和1.5×104cfu/mL 5個不同的濃度梯度。將180尾試驗用健康克氏原螯蝦隨機分為6組，試驗組分別在第2腹節(jié)和第3腹節(jié)處注射制備好的菌懸液100 μL，注射無菌生理鹽水的健康蝦作為陰性對照組。感染后的蝦暫養(yǎng)于玻璃缸內，水溫保持23～25 ℃，溶解氧5.5～5.7 mg/mL。感染后觀察8 d，記錄各組臨床癥狀和死亡數。將瀕死蝦的肝胰腺參照本文“1.2”方法進行病原分離，并進行鑒定。試驗結束后采用Bliss法計算該菌株對健康克氏原螯蝦的半致死濃度(LC50)[9]。

1.4 生理生化鑒定

首先取單菌落進行革蘭氏染色后鏡檢，觀察分離株的形態(tài)特征。此外，采用API20E生化鑒定試劑條進行生化鑒定。參照試劑條說明書，從平板上挑取菌落用無菌生理鹽水稀釋至合適濃度后加入試劑條各個孔中，在28 ℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h后判定結果。

1.5 細菌分子鑒定

參照試劑盒說明書提取QJ20190513分離株的全基因組，以其為模板通過PCR的方法擴增分離株16S rRNA片段，PCR上游引物(16S rRNA-F)：5′-AGAGTTTGATCATGGCTC-3′，下游引物(16S rRNA-R)：5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′。擴增后得到的PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后取目的條帶進行凝膠回收并測序。將測序結果用Blast軟件分析同源性并采用MEGA5.1軟件以鄰接法構建進化樹，校正模型為Kimura 2-parameter，通過Bootstraps法自舉數集1 000次。

1.6 藥敏試驗

從BHI平板上挑取QJ20190513分離株的單菌落至BHI液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)至對數生長中期，離心收集菌體。菌體經無菌生理鹽水洗滌3次后采用麥氏比濁法將菌液濃度調整為1.5×108cfu/mL。用無菌玻璃棒將菌液均勻涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基上，然后將藥敏紙片貼于平板上，28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h后測定抑菌圈直徑，判定該菌對不同藥物的敏感性。

1.7 聯(lián)合抑菌試驗

采用棋盤法研究多西環(huán)素和10種不同天然化合物聯(lián)合后對QJ20190513分離株的聯(lián)合抑菌作用[10]。將藥物分別用MH肉湯在離心管中倍比稀釋，分別取50 μL恩諾沙星和天然化合物加入到96孔細胞培養(yǎng)板中，使多西環(huán)素濃度從第2孔到第10孔(從左到右)依次降低，天然化合物濃度從B到H孔(從上到下)依次降低。培養(yǎng)至對數生長中期的菌液經離心和無菌生理鹽水反復沖洗后，采用麥氏比濁法調整至濃度為5×106cfu/mL，取100 μL稀釋好的菌液加入到96孔板中，混合均勻后置于28 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)16～18 h，分別設置陰性和陽性對照。記錄多西環(huán)素與天然化合物單獨使用的最小抑菌濃度(MIC)和聯(lián)合使用以后各自的MIC。聯(lián)合抑菌作用采用抑菌濃度指數FICI評價，計算公式如下：ICI=MICA藥聯(lián)合/MICA藥單獨+MICB藥聯(lián)合/MICB藥單獨。協(xié)同作用 (synergism,SYN；FICI≤0.5)；無關作用 (indifference,IND；0.54)。

2 結果與分析

2.1 分離株的培養(yǎng)特性

從患病克氏原螯蝦肝胰腺純化的優(yōu)勢菌在BHI固體培養(yǎng)基上形成白色半透明的光滑菌落，革蘭氏染色后經顯微鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)該菌株為革蘭氏陰性短桿狀細菌。

2.2 分離株對克氏原螯蝦的毒力

將QJ20190513分離株以注射方式感染健康的克氏原螯蝦，發(fā)現(xiàn)感染后的克氏原螯蝦出現(xiàn)了活力下降等癥狀，且感染蝦出現(xiàn)了不同程度的死亡，死亡率與感染劑量呈正相關，在感染試驗過程中陰性對照組未出現(xiàn)發(fā)病和死亡情況(表1)。進一步剖檢發(fā)現(xiàn)，感染后的克氏原螯蝦肝胰腺發(fā)白甚至水腫，肌肉發(fā)白。此外，從癥狀明顯的感染蝦肝胰腺中分離到了1株優(yōu)勢菌，其培養(yǎng)特性與分離株QJ20190513基本一致。經Bliss法計算得到該菌株對克氏原螯蝦的半數致死濃度LC50為2.8×105cfu/mL。

表1 QJ20190513菌株感染健康克氏原螯蝦后的死亡率 Table 1 Mortality of the QJ20190513 isolate on healthy crayfish

2.3 生化鑒定結果

采用API20E細菌鑒定試紙條和ATB細菌鑒定系統(tǒng)分析了分離株QJ20190513的生化特征，結果如表2所示。經ATB系統(tǒng)判定該菌株的生化特征與系統(tǒng)中摩氏摩根菌的特征相符合，其相似度為99.9%。

表2 分離株QJ20190513的生化特征 Table 2 Biochemical characterization of the QJ20190513 isolate

2.4 分子生物學鑒定

通過PCR方法得到了分離株QJ20190513的16S rRNA片段，其長度約為1.5 kb。將測序結果提交至Blast軟件與GenBank中已知序列比對發(fā)現(xiàn)，該菌株與摩氏摩根菌的同源性大于99%。通過MEGA軟件構建發(fā)育樹(圖1)發(fā)現(xiàn)，分離株QJ20190513(MT890001)與摩氏摩根菌(AY464464.1)親緣關系較近，結合該菌株的生理生化特征將QJ20190513菌株鑒定為摩氏摩根菌。

圖1 QJ20190513菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 藥物敏感性

采用K-B法檢測了QJ20190513分離株對20種化學藥物的敏感性，結果發(fā)現(xiàn)，分離株對妥布霉素、新霉素、亞胺培南等7種藥物敏感，對卡那霉素中度敏感，對慶大霉素、鏈霉素、頭孢唑啉等12種藥物耐藥(表3)。

2.6 協(xié)同抑菌試驗

從表3可見，QJ20190513菌株對多西環(huán)素不敏感，多西環(huán)素對QJ20190513菌株的最小抑菌濃度為64 μg/mL(表4)。受試天然化合物血根堿、和厚樸酚、二氫辣椒堿和異土木香內酯對菌株 QJ20190513的生長均有一定的抑制作用，其MIC分別為16、64、32和64 μg/mL (表4)。而當多西環(huán)素與天然化合物聯(lián)合使用后僅二氫辣椒堿與多西環(huán)素具有協(xié)同抑制QJ20190513菌株的作用，其FICI為0.19，聯(lián)合使用后多西環(huán)素MIC下降了16倍，二氫辣椒堿MIC下降了8倍。

表3 QJ20190513分離株對20種抗菌藥物敏感性 Table 3 Antibiotic susceptibility of QJ20190513 strain to 20 kinds of antibiotics

表4 天然化合物與多西環(huán)素(單獨或聯(lián)合)對QJ20190513菌株的最小抑菌濃度 Table 4 The MIC values of natural products and doxycycline (alone or combination) against QJ20190513 strain

3 討 論

克氏原螯蝦對環(huán)境適應能力較強，可在低氧、多種水溫和水質環(huán)境差的地方生存，是近年來具有較高經濟價值的養(yǎng)殖品種之一[11]。然而近年來由于克氏原螯蝦養(yǎng)殖面積和養(yǎng)殖密度的不斷增加，導致克氏原螯蝦的感染性疾病的報道也越來越多，如白斑綜合征病毒、弗氏檸檬酸桿菌、維氏氣單胞菌、副溶血弧菌和螺旋體等[11-14]。本試驗首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌能夠導致克氏原螯蝦發(fā)病和大規(guī)模死亡，通過回歸試驗發(fā)現(xiàn)該菌株對健康克氏原螯蝦具有較強的致病力，在感染后導致大量感染蝦的快速死亡。此外，人工感染的克氏原螯蝦表現(xiàn)出與天然發(fā)病蝦類似的癥狀，如活動力下降、應激能力差、肝胰腺發(fā)白、肌肉彈性下降和顏色變淺等?？耸显r與其他甲殼類動物類似，缺乏脊椎動物的獲得性免疫力，其抵御病原體主要依靠先天免疫系統(tǒng)[15]。因此，研究病原體對克氏原螯蝦的致病規(guī)律對于減少發(fā)病具有重要意義。

摩氏摩根菌是人類腸道中的正常菌群之一，通常不會導致人類疾病，但在特殊條件下能導致免疫力低下的人發(fā)生感染，在人類醫(yī)學上是一種少見的條件性致病菌[16]。摩氏摩根菌能導致多種不同動物發(fā)病，包括陸生動物和多種水生動物。陸小萏等[17]從患病的錦鯉(CyprinuscarpioLinnae)中分離到1株摩氏摩根菌，經人工感染發(fā)現(xiàn)其對健康錦鯉具有較強的致病力，該研究首次發(fā)現(xiàn)摩氏摩根菌能夠感染魚類。近年來，水產養(yǎng)殖動物感染摩氏摩根菌的報道越來越多，烏鱧、中華鱉、胡子鯰、鱸(Lateolabraxjaponicas)、大鯢等均能在天然條件下感染摩氏摩根菌并引起發(fā)病和死亡[6-8,18]。盡管目前尚無摩氏摩根菌通過水產動物感染人的報道，但水產食品作為人類的主要蛋白質來源之一，極易通過水產品加工、未煮熟的水產食品或發(fā)生污染的水域將病原菌擴散到人類，從而導致嚴重的公共衛(wèi)生問題。因此，加強對水產動物摩氏摩根菌感染的防控不僅有利于降低水產養(yǎng)殖業(yè)因感染造成的損失，對于保障水產動物性食品安全和人類健康也具有重要意義。但目前尚未闡明摩氏摩根菌導致水產動物感染的機制，因此迫切需要深入研究以控制摩氏摩根菌在水產養(yǎng)殖領域的感染。

化學抗菌藥物是目前防治水產養(yǎng)殖動物細菌性疾病的主要手段，但藥物的長期不合理使用導致了病原菌耐藥性的產生，給細菌性病害防控帶來了困難。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源的摩氏摩根菌對抗菌藥物有不同程度的耐藥，如氨基糖苷類、酰胺醇類、β-內酰胺類等[19]。本試驗分離的摩氏摩根菌對受試的7種藥物高度敏感，1種藥物中等敏感，12種藥物耐藥；與以往的研究有一定差異，分析其原因可能與各地區(qū)不同養(yǎng)殖品種的用藥習慣及菌株來源有關。QJ20190513菌株對水產養(yǎng)殖用獸藥新霉素、恩諾沙星和氟苯尼考高度敏感，但對多西環(huán)素耐藥，因此選取了多西環(huán)素篩選能與其有協(xié)同抑菌的天然化合物。結果發(fā)現(xiàn)，受試天然化合物如血根堿等單獨使用時即表現(xiàn)出一定程度的抑菌作用，但僅多西環(huán)素與二氫辣椒堿聯(lián)用后其FICI<0.5，具有協(xié)同抑菌作用。協(xié)同抑菌作用能提高藥物的敏感性，延長藥物的使用壽命，對于耐藥性摩氏摩根菌的防控具有重要意義。