柑橘果汁中的苦味物質及脫苦技術研究進展

張娜威，潘思軼，范剛，任婧楠

華中農業(yè)大學食品科學技術學院/環(huán)境食品學教育部重點實驗室，武漢 430070

柑橘類水果是世界上最重要的水果之一，在熱帶和亞熱帶地區(qū)以及許多地區(qū)廣泛種植，年產量約為1.02億t[1]。柑橘類水果中含有黃烷酮、酚酸、檸檬苦素、L-抗壞血酸、類胡蘿卜素、揮發(fā)性萜烯等多種生物活性化合物[2]，因其誘人的顏色、令人愉悅的風味和香氣而受到世界各地消費者的歡迎。近年來，隨著產量的增加、存儲和加工技術的進步以及全年供應的實現，柑橘類水果現已成為中國人重要的飲食營養(yǎng)來源[3]，它們可以鮮食，也可以加工成果汁、果醬或甜點。目前，飲料生產是柑橘類水果加工的主要方向[4]。柑橘在經過榨汁、殺菌、貯藏等加工過程后，會出現苦味增強的現象，進而影響柑橘汁的口感，導致產品質量和經濟價值的下降，降低消費者可接受度，制約柑橘汁加工業(yè)的發(fā)展[5]。研究表明，柑橘榨汁后的苦味源自兩方面：(1)柑橘(柚子、苦橙和葡萄柚)自身所含有的類黃酮及其衍生物所造成的苦味；(2)由無苦味的化合物轉化成苦味物質所造成的苦味，即榨汁過程中的“延遲苦味”[6]。當前基于化學、物理和生物技術方法已經開發(fā)了許多脫苦技術，然而，如何在提高消費者的接受度的同時保持果汁的風味物質和營養(yǎng)價值，更科學地進行脫苦一直是柑橘加工研究者們的重點課題。

1 引起苦味物質的化合物

柑橘類水果中存在不同類型的植物營養(yǎng)素，分為黃烷酮、黃酮、黃酮醇、黃烷、異黃酮、三萜、檸檬苦素類苷元、芥子油苷(有機硫化合物)和異硫氰酸鹽等，具有特定的功能性和實用性[7]。這些化合物是否呈苦味取決于其糖苷鏈的類型[8]。柑橘類水果中存在多種苦味代謝產物，如柚皮苷、枸桔苷、新橙皮苷、檸檬苦素、諾米林、宜昌橙苦素、諾米林酸等，如表1所示。其中，以柚皮苷為代表的黃烷酮糖苷類化合物和以檸檬苦素為代表的三萜類化合物是造成柑橘汁苦味的2種主要化合物[9]，柚皮苷苦味閾值較高，水溶液中閾值為20 mg/L，檸檬苦素在水溶液中苦味閾值為1.0 mg/L，果汁中苦味閾值3.4 mg/L，約為柚皮苷苦味閾值的20倍[10]，如在柑橘中的含量超過6 mg/kg，則柑橘汁已苦得不宜飲用。引起苦味的化合物含量可能因水果的品種、部位、成熟期、生長條件而不同。柑橘類水果中的檸檬苦素和柚皮苷含量通常在幼果或果實膨大階段積累相對較高，成熟過程中會逐步降低[11]。對金諾果實不同部位的分析表明[12]，果皮中柚皮苷含量最高，為0.422 mg/g，其次為果汁(0.230 mg/mL)和種子(0.134 mg/g);檸檬苦素含量最高的是種子(9.52 mg/g)，其次是果皮(4.69 mg/g)和果汁(0.218 mg/mL)。

表1 柑橘中主要的苦味物質 Table 1 Main bitter substances in citrus

1.1 柚皮苷

柚皮苷(4,5,7-三羥基黃烷酮-7-鼠李糖苷)為類黃酮化合物(flavonoids)，是葡萄柚和柚子中主要的類黃酮苦味成分，同為類黃酮的新橙皮苷(neohesperidin)和枸桔苷(poncirin)也很苦，但它們在柑橘汁中的含量相對較低。柚皮苷具有抗氧化、抗?jié)冏饔煤涂寡谆钚訹18]，也是在水果隔膜和柑橘的白色內果皮中發(fā)現的主要的水溶性苦味成分[19]，在榨汁的過程中被提取至果汁當中，是果汁苦味的主要原因。柚皮苷(分子式：C27H32O14，相對分子質量：580.5)具有8個氫鍵供體、14個氫鍵受體和6個可旋轉鍵，拓撲極性表面積為225?2[20]，柚皮苷易溶于甲醇、 乙醇、 丙酮、 醋酸、 稀堿溶液及熱水，不溶于乙醚、氯仿、苯等非極性溶劑。柑橘中柚皮苷含量與果實成熟度有關，在未成熟的果實中含量很高。隨著果實的成熟，柚皮苷被α-L-鼠李糖苷酶水解為L-鼠李糖和櫻桃苷，苦味程度是柚皮苷33%的櫻桃苷會進一步水解為無苦味的柚皮素和D-葡萄糖，從而進一步降低苦味，如圖1所示[21]。

圖1 柚苷酶對柚皮苷的水解過程

1.2 檸檬苦素

檸檬苦素類化合物(limonoids)是一類高度氧化的四環(huán)三萜類次生代謝產物，主要存在于蕓香科(Rutaceae)、楝科(Meliaceae)植物組織中[22]，具有抗癌、抗人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)、抗炎、抗氧化、抗菌、鎮(zhèn)痛、除蟲、調節(jié)血糖等作用[23]。檸檬苦素類化合物的最初前體——脫乙酰諾米林酸(角鯊烯，squalene)在柑橘屬植物莖的韌皮部由乙酸、甲羥戊酸等合成[24]，放射性示蹤實驗發(fā)現，韌皮部的脫乙酰諾米林酸轉化成諾米林[25]，然后轉移到植物的其他組織中，如葉、果實、種子等，在種子和果實中諾米林經過氧化、異構化、乙?；?、甲基化和水解等次級修飾最終產生檸檬苦素類化合物[26]。

檸檬苦素類化合物是以檸檬苦素的化學結構為基本單位的一系列化合物，主要包括2種：類檸檬苦素苷元和類檸檬苦素糖苷，類檸檬苦素糖苷的結構均是苷元在C17位與一分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結合，苷元又可分為中性的A環(huán)內酯和酸性的D環(huán)內酯2種類型。苷元與糖苷結構的差別導致了其性質的差異：苷元的水溶性差且具有明顯苦味，而糖苷具有良好的水溶性且?guī)缀鯖]有苦味[27]。

具有強烈苦味的檸檬苦素類化合物有檸檬苦素、諾米林、宜昌橙苦素和諾米林酸4種，通常情況下檸檬苦素是最重要的苦味源，諾米林次之，而宜昌橙苦素和諾米林酸因其含量較低而作用不明顯[28]。檸檬苦素又稱檸堿，是類檸檬苦素苷元的衍生物，它是蕓香科家族水果中存在的一種重要的檸檬苦素類化合物。檸檬苦素(分子式：C26H30O8；相對分子質量：470.52)，具有8個氫鍵受體，1個具有拓撲極性表面積105?2的可旋轉鍵和1個共價鍵合單元。檸檬苦素是一種白色化合物，在化學上屬于呋喃內酯，微溶于水，易溶于無水乙醇和冰醋酸。

柑橘類水果榨汁后產生的苦味通常是由于物理破壞(如機械損傷)或冰凍損害等外界脅迫而引發(fā)的。中晚熟的完整鮮果幾乎不含檸檬苦素，檸檬苦素的非苦味前體檸檬苦酸A環(huán)內酯(LARL)，內源性存在于細胞質中，最可能在中性至微堿性的膜囊，在果汁加工過程中，當這些囊泡破裂后，LARL遇到果汁的凈酸性pH值，逐漸催化環(huán)閉合形成檸檬苦素[29]，研究表明，非苦味形式向苦味形式的轉化是通過檸檬苦素D環(huán)內酯水解酶催化的反應[30]，它在酸性條件下發(fā)生，反應速率取決于LARL的可利用性，如圖2所示[31]。

圖2 “延遲”苦味形成機制

在成熟階段，檸檬苦素葡萄糖基轉移酶基因(CitLGT)的表達開始增加，檸檬苦素葡萄糖苷轉移酶會將類檸檬苦素苷元轉化為幾乎沒有無苦味的糖苷，類檸檬苦素糖苷濃度增加，LARL的含量下降[32]，故成熟后的柑橘榨汁后較未成熟的苦味顯著降低。研究表明，檸檬苦素被酶解為無苦味衍生物主要是通過3種途徑實現[33]，如圖3所示[34]，具體轉化程度取決于水果成熟程度和酶水解代謝的水平。

圖3 檸檬苦素轉化為其非苦味代謝物的分解代謝途徑

2 脫苦方法

為減少柑橘類水果在發(fā)育和成熟過程中苦味化合物的積累，研究人員已經做出了許多努力，使用化學噴霧、農藝方法和采后處理來減少水果中富集的苦味物質。目前，基于物理、化學和生物技術方法開發(fā)了很多脫苦技術，減少苦味的機制主要包括：(1)除去苦味化合物(如漂燙、吸附、超濾膜過濾)；(2)除去富含苦味成分的部分(如白色內果皮和種子)；(3)添加苦味化合物清除劑(如堿處理、環(huán)糊精處理)；(4)酶促轉化；(5)利用基因工程技術調節(jié)苦味化合物的合成途徑。

2.1 物理方法脫苦

榨汁方式會直接影響果汁的苦味程度，有研究表明，與未處理的同類產品相比，輕柔地擠壓水果可將果汁中的苦味降至最低[35]。Sandhu等[36]對比不同榨汁處理方式對果汁理化指標的影響，結果表明使用螺旋式榨汁機可以有效減少果汁中的苦味；現代榨汁機雖然可以更快地從水果中提取果汁，但是在提取過程中，將富含苦味物質的種子與多汁囊一起壓碎可能會給果汁帶來苦味；在榨汁之前，從水果中手動去除種子可減少果汁中的苦味。Thakur等[37]研究表明從無核果汁中提取的汁液中引起苦味的成分(柚皮苷和檸檬苦素)的含量最少。

漂燙是一種熱處理過程，應用于水果和蔬菜行業(yè)，以使內源酶失活，影響其感官和營養(yǎng)價值以及貨架期。Zid等[38]對苦橙皮進行水和蒸汽熱燙，結果顯示在95 ℃和85 ℃時，水燙可分別去除38%和48%的苦味黃烷酮(柚皮苷和新橙皮苷)，而蒸汽熱燙對苦味化合物含量無顯著影響，研究發(fā)現，其脫苦機制是通過固液萃取，熱水進入富含苦味物質的白色內表皮使其中的糖苷類黃烷酮溶解，然后將其轉移到固體基質的外部，再從外表面轉移到水溶液中。黃烷酮糖苷的這種流出依賴于諸如時間和溫度之類的變化，但較高的溫度必然會破壞柑橘果實的組織結構。為了在保持柑橘組織結構的同時實現較好的脫苦效果，Jagannath等[39]在65 ℃下對柑橘進行反復熱燙，然后進行滲透脫水。在此過程中，柚皮苷含量降低了50%，而且隨著貯藏時間延長，柚皮苷含量又進一步降低。

此外，使用特定的設備(壓濾機)和膜(中空纖維膜)通過超濾也可以將苦味成分與提取的果汁分離開來。超濾去除苦味的機制是：超濾膜具有截留大尺寸分子的能力，較小的分子可以通過膜，進而產生特定的滲透性。Wethern[40]研究表明使用超濾法澄清葡萄柚汁的過程可降低果汁的苦味。鹽和糖分子可順利透過超濾膜[41]，諸如微生物、維生素之類的大分子則被超濾膜截留，因此，過膜后所得的滲透物被微生物污染的風險也大大降低。Ilame等[42]證明，超濾膜組件(基于聚砜的膜，分子質量30 ku)有潛力在不添加添加劑的情況下延長金諾果汁的保質期至60 d。由于在低溫下進行膜處理，可以避免熱處理，因此可以忽略揮發(fā)性香氣化合物的損失。

利用聚酰胺選擇性地從臍橙汁中大量吸附檸檬苦素的研究已取得成功[43]。類似地，各種吸附劑(如醋酸纖維素、尼龍基質、多孔聚合物和離子交換劑)的使用也被用于減少葡萄柚汁的苦味和酸性[44]。吸附是將溶液中的溶質選擇性地轉移到固體物質(吸附劑)表面的一種物理化學過程，該過程在達到平衡后保持溶質的熱力學平衡，不再吸收。這些吸附劑既可以單獨使用，也可以與其他吸附劑結合使用，由于它們的選擇性吸附，不同吸附劑對苦味的去除程度也有所差別，柚皮苷和檸檬苦素的去除率取決于吸附劑的交聯程度和表面積，單個基質或多個基質的組合使用能夠實現不同程度的脫苦。

2.2 化學方法脫苦

Kore等[5]使用堿處理對果汁進行脫苦，在82～83 ℃下用氫氧化鈉處理水果40～60 s，然后用已知濃度的檸檬酸沖洗并在自來水中洗滌以除去過量的氫氧化鈉。堿液處理過程中，去皮果實富含苦味物質的乳白色外層與羥基和羧基發(fā)生反應形成親水性衍生物，并在水洗過程中得以去除，但堿液處理會改變果汁中的成分，導致果汁的回收率稍有降低。Sogi等[45]觀察到，在堿液處理過程中，所用氫氧化鈉的濃度對苦味的脫除起到決定性作用。當氫氧化鈉達到特定的濃度能夠有良好的脫苦效果，但是超過特定的限度反而會造成負面效果。

關于環(huán)糊精在柑橘汁脫苦中應用的報道相當有限。環(huán)糊精是含有(α-1,4)連接的α-D-吡喃葡萄糖單元的環(huán)狀寡糖，形成親脂性中心腔和親水性外表面，在水溶液中形成親水錐，與極性小于水且具有合適大小以適合親脂性空腔的化合物形成包合物[46]。Konno等[47]用可溶性β-環(huán)糊精單體包封柑橘汁中的檸檬素和柚皮苷，隨著β-環(huán)糊精的加入，柚皮苷和檸檬苦素的溶解度增加，使用0.5%的β -環(huán)糊精可以降低柑橘汁最初苦味的58%。Shaw等[48]用不溶性β-環(huán)糊精聚合物去除臍橙和葡萄柚中檸檬苦素和柚皮苷。研究表明，β-環(huán)糊精聚合物能將苦味類黃酮和類檸檬苦素降低約30%～50%，雖然柚皮苷、7-β-蕓香糖苷、香豆素和類黃酮等成分也被去除，但可溶性固形物、酸度和抗壞血酸含量保持不變[49]。β-環(huán)糊精與柚皮苷或檸檬苦素形成不溶性絡合物，用有機溶濟萃取工藝處理絡合物使β-環(huán)糊精再生，也提高了其在大規(guī)模試驗中的應用。

目前用于脫苦的物理化學方法還存在其局限性。物理、化學脫苦法是以果汁的營養(yǎng)品質、質地、風味、口感為代價來進行脫苦，吸附或化學反應一定程度上會改變果汁的化學成分。這些方法在本質上是非特異性的，因此存在效率低下的缺陷，還會由不可監(jiān)控的變化而導致批次間的差異，在去除苦味成分的過程中由于所需的營養(yǎng)成分的部分損失而降低了產量[50]。此外，所用到的化學品不能夠重復使用，而且最棘手的問題是，這些化學品缺乏合理處理方式，因此這些化工產物的排放會對環(huán)境生態(tài)造成一定的影響。綜上，物理化學法的脫苦技術不適宜大規(guī)模應用，所以研究人員正開發(fā)可持續(xù)和更環(huán)保的脫苦技術。

2.3 生物技術方法脫苦

如今，在“生物技術時代”，尋找一種高效、省時、低成本的技術，從小規(guī)模工業(yè)到大規(guī)模工業(yè)都可以使用，實現定向、靶向地去除果汁中的苦味成分，是完全有可能的，而且在果汁加工中引入生物技術可以克服理化加工的局限性。

近年來越來越多研究學者開始對酶法脫苦產生興趣，與化學試劑相比，酶法對果汁中的苦味成分的去除作用要大得多，且處理條件溫和，專一性強。針對檸檬苦素的脫苦酶主要有：檸檬苦素環(huán)氧酶、檸檬苦素脫氫酶、檸檬苦醇脫氫酶、反式消除酶、乙?；呀饷傅萚34]，其脫苦機制為控制檸檬苦素的合成或是將檸檬苦素轉化為其他不具苦味的化合物，如圖3所示。作用于柚皮苷的脫苦酶為柚苷酶，柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶組成的混合酶，具有α-L-鼠李糖苷酶和β-D-葡萄糖苷酶的活性[51]，其脫苦機制如圖1所示。用于產生柚苷酶的菌株有米曲霉、黑曲霉、黃曲霉、大腸桿菌、蠟狀芽孢桿菌，通常用于產生α-L-鼠李糖苷酶的真菌和細菌菌株是盧氏梭狀芽胞桿菌、黑曲霉、曲霉，但相比于細菌菌株，優(yōu)先使用真菌菌株，因為它們具有在最少水存在下生長的能力。常用的篩菌底物有桔皮、米糠、麥麩、玉米芯、甘蔗渣、大豆殼、稻草等[52-57]。酶處理需要在較溫和的條件下進行，因為高溫下酶很容易失活，故會限制其在工業(yè)化上的應用，因此，關于提高酶的耐熱性、催化活性的研究對于擴大酶在實際生產中的應用價值很有必要。

固定化酶是目前工業(yè)上的趨勢，它能夠保持并延長酶的活性，促進其重復使用。固定化可以通過多種方式實現，包括:(1)使用惰性材料來固定化酶；(2)用聚合凝膠晶格包裹酶；(3)用多功能試劑交聯酶中的活性蛋白；(4)酶與不溶性支撐材料上的共價結合。但固定成功率取決于不同pH和溫度下酶的活性、特定的修復基團和功能基團的存在、分子質量和酶純度。Lei等[58]將柚皮苷酶通過交聯劑戊二醛吸附到中孔二氧化硅MCM-41上，用于白葡萄柚脫苦，重復性試驗數據表明，其水解度約為44.57%，果汁中柚皮苷的轉化率高達95%。共價酶固定過程產生了一種不溶且相當穩(wěn)定的酶形式，同時保留了催化特性，使酶可以在很寬的溫度范圍內發(fā)揮其作用。目前，固定化酶的趨勢是利用納米結構的材料作為酶的載體，包括納米孔材料、納米顆粒和納米纖維[59]。與傳統載體相比，納米結構材料具有高比表面積的內在特征，有利于提高固定效率[60]。Huang等[61]將帶正電荷的柚皮苷酶和帶負電荷的藻酸鹽交替逐層涂在帶負電荷的靜電紡絲醋酸纖維素納米纖維上，通過吸附和水解作用從柚子汁中去除22.72%的柚皮苷和60.71%檸檬苦素，且固定的柚皮苷酶的活性隨涂層的增加而增加。Ladole等[62]首次報道了使用生態(tài)友好型生物催化劑單罐解決柑橘汁澄清和脫苦問題，通過使用氧化的殼聚糖作為大分子交聯劑，將果膠酶和柚皮苷酶共同固定在殼聚糖包被的磁性納米顆粒(chitosanMNPs)上，采用將共固定的酶對西柚汁進行單罐澄清和脫苦的評估，發(fā)現混濁度降低了約52%，柚皮苷含量降低了約85%，與游離酶相比，共固定化酶在高溫下穩(wěn)定，并顯示出優(yōu)異的熱穩(wěn)定性，半衰期延長了近1.8倍，儲存穩(wěn)定性長達30 d。

另一種具有吸引力和挑戰(zhàn)性的方法是利用基因工程技術。轉錄組學和基因組學方法的使用對于分析復雜的網狀代謝途徑非常有幫助，通過生物信息學分析，可以假設進一步修飾的目標，最終使代謝物發(fā)生預期的變化[63]。早前，關于轉基因柑橘樹的研究工作已經開展[64-65]。目前基因工程目標之一的酶是：(1)諾米林脫乙酰基酶；(2)檸檬酸脫氫酶；(3)葡萄糖基轉移酶。在柑橘類水果中插入諸如諾米林脫乙?；钢惖奶囟妇幋a基因，可以調節(jié)檸檬苦素的合成途徑，通過自然生物轉化將檸檬苦素等苦味物質轉化成非苦衍生物，解決柑橘類果汁的苦味問題。Li等[66-67]對黑曲霉JMU-TS528所產的α-L-鼠李糖苷酶使用定向進化技術和定點誘變開發(fā)了具有熱穩(wěn)定性的V529A突變體和K406R-K573R突變體，這兩種突變體在65 ℃處理30 min后，仍然能保留其原始活性的50%以上，可以實現在橙汁生產的預熱過程中水解柚皮苷，將其含量降至苦味閾值以下?；诘鞍踪|結構模擬的相互作用分析和分子動力學計算分析推測，突變體酶熱穩(wěn)定性的提高可能是由于增加了其氫鍵、陽離子-π的相互作用和相對致密的構象。熱穩(wěn)定性突變體酶的開發(fā)，或許有望推動酶法脫苦在食品加工行業(yè)中的應用。

雖然生物技術脫苦有特異性強、靶向精準脫苦等優(yōu)勢，但其仍處于實驗室階段。酶的穩(wěn)定性差、易變性失活、成本較高，需要選育優(yōu)質高產酶的菌株，而且酶的純化和固定化是一個繁瑣的過程，不便于工業(yè)連續(xù)化生產。此外，人們對柑橘風味形成的分子機制認識還處于研究階段，分子遺傳工具和生物技術仍需進步。

3 總結與展望

在脫苦研究中，我們得知其實這些苦味物質是具有多種生物活性的，在當代注重膳食營養(yǎng)的大環(huán)境下，如何既不損失原有果汁的風味和營養(yǎng)成分又能實現高效脫苦、既簡便又低成本地消除柑橘果汁中的苦味物質是大勢所趨。從上述對物理、化學和生物技術脫苦方法的研究可以看出，目前還沒有任何一種物理、化學或生物技術方法可以在不影響果汁的自然特性的情況下，使苦味果汁達到可口的品質。若以操作簡便、重現性好、保存其天然營養(yǎng)特性、消費者易接受性為評判標準，與傳統的物理化學方法相比，采用生物技術方法進行脫苦在這些方面表現出其獨特的優(yōu)勢，其在處理果汁時不會造成變色、風味改變和稠度變化等問題。食品和藥物管理局(FDA)規(guī)定“不得在果汁中添加或去除任何東西”，生物技術方法初步滿足了該標準要求。

近年來，國內外已報道了較多的利用酶處理去除柑橘類果汁苦味的研究，利用基因工程技術對酶進行改性，將酶固定化處理，以期提高酶的催化活性和穩(wěn)定性，拓寬其適用條件，降低其使用成本。但整體而言，酶法脫苦目前還缺乏一定的實用性，要實現工業(yè)化生產還需要大量的工作。此外，隨著人們對柑橘風味形成的分子機制認識的不斷加深，以及分子遺傳工具和生物技術的不斷進步，柑橘育種技術有望快速發(fā)展，如通過基因工程技術改良品種從而實現脫苦，從根本上解決柑橘果汁的苦味問題，這將具有更加廣闊的應用前景。