光肩星天牛對(duì)糖槭揮發(fā)物的EAG及嗅覺行為反應(yīng)

馬曉乾，葛 君，王 琪，趙紅盈，孫 妍，高 宇，申國濤，于文喜

(1.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150081；2.東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

光肩星天牛(Anoplophoraglabripennis)屬鞘翅目(Coleoptera)天?？?Cerambycidae)，是一種危害多種闊葉樹的蛀干性害蟲，國內(nèi)外廣泛分布，主要以幼蟲在樹干內(nèi)蛀食坑道阻斷輸送養(yǎng)分和水分而導(dǎo)致樹木衰弱和死亡[1-3]。據(jù)報(bào)道，已有18屬的樹木受到光肩星天牛危害，由于其危害具有隱蔽性強(qiáng)、防治難等特點(diǎn)，給世界林業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-6]。糖槭(Acersaccharum)又名羽葉槭，原產(chǎn)于加拿大，是我國北方城市的主要綠化樹種之一，光肩星天牛對(duì)其危害非常嚴(yán)重[7-8]。

從昆蟲和寄主植物間的化學(xué)通訊出發(fā)，利用寄主植物和非寄主植物揮發(fā)物研制引誘劑或驅(qū)避劑調(diào)控昆蟲的嗅覺行為，配置非寄主植物也是控制害蟲的一種途徑，成為森林保護(hù)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)和重點(diǎn)[9-13]。近年來，已有研究者探討了光肩星天牛對(duì)寄主植物揮發(fā)物的觸角電位(EAG)及行為反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)光肩星天牛感蟲樹種會(huì)釋放較多的酯和萜類物質(zhì)，而抗蟲樹種則釋放較多的醇和醛類物質(zhì)，S-α-蒎烯、S-β-蒎烯、乙酸己酯、R-α-蒎烯、水芹烯、莰烯等對(duì)光肩星天牛有明顯的引誘作用，而羅勒烯、月桂烯、(E)-1-戊烯-3-醇、反-2-己烯醇、trans-香葉基丙酮等對(duì)光肩星天牛具有驅(qū)避作用[6,14-19]。而有關(guān)糖槭揮發(fā)物影響光肩星天牛寄主選擇方面的研究未見報(bào)道。利用觸角電生理及嗅覺行為測(cè)定是目前常用且比較成熟的確定植物揮發(fā)物對(duì)植食性昆蟲寄主選擇影響的有效途徑[20-23]。為此，本研究利用頂空吸附法通過氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)、觸角電位(EAG)及嗅覺行為測(cè)定技術(shù)，分析鑒定糖槭揮發(fā)物組分，解析糖槭揮發(fā)物對(duì)光肩星天牛入侵糖槭過程中產(chǎn)生的觸角電生理及趨性行為影響作用，為光肩星天牛監(jiān)測(cè)預(yù)警及通過引誘劑干擾等防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試植物和昆蟲

試驗(yàn)所用光肩星天牛雌、雄成蟲和糖槭樣樹均采自哈爾濱市南崗區(qū)中山路行道綠化帶，該綠化帶主要栽植有10～20年生糖槭，樹高6～10 m，胸徑9～25 cm，研究期間光肩星天牛危害嚴(yán)重。將采集的每頭光肩星天牛單獨(dú)置于養(yǎng)蟲瓶中饑餓24 h，待用。

1.1.2 植物揮發(fā)物及其配制

糖槭揮發(fā)物組分根據(jù)研究中GC-MS實(shí)驗(yàn)分析結(jié)果，選取購自阿拉丁公司生產(chǎn)的且含量排在前12的揮發(fā)物[23]，分別為乙酸己酯(純度≥99.5%)、己二酸二異丁酯(純度>99%)、鄰苯二甲酸二異丁酯(純度99%)、棕櫚酸甲酯(純度99%)、乙酸葉醇酯(純度98%)、丙酸葉醇酯(純度97%)、十四酸(純度≥99.5%)、月桂酸(純度98%)、羅勒烯(純度>99.5%)、角鯊烯(純度≥99.5%)、順-3-己烯醇(純度98%)、2-己基-1-葵醇(純度98%)。根據(jù)寄主植物揮發(fā)物含量及同類實(shí)驗(yàn)，將各種標(biāo)準(zhǔn)品溶于液態(tài)石蠟中，將每個(gè)標(biāo)樣初步配制成濃度為2 mol/ L 的溶液，待用。

1.2 試驗(yàn)測(cè)定方法

1.2.1 糖槭揮發(fā)物的采集及分析鑒定

在哈爾濱市中山路行道綠化帶，選擇健康的糖槭進(jìn)行采樣，采用頂空吸附法將收集有糖槭揮發(fā)物的蘇瑪罐連接到7100 A預(yù)濃縮儀上(美國ENTECH公司)，濃縮后的樣品采用氣相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用法分析 (gas chromatography/mass spectrum, GC/MS)[24-25]。其色譜柱為DB-5MS，30 m×0.25 mm ×0.25 μm。GC工作條件：升溫程序?yàn)?0 ℃恒溫3 min，然后以10 ℃/min的速度升溫到250 ℃，最后在250 ℃恒溫5 min，溶劑延遲2 min。MS工作條件：離子源溫度230 ℃，電離方式為E1源，離子能70 eV，質(zhì)譜掃描范圍為45～450 (m/z)。3次重復(fù)，1個(gè)空白對(duì)照，比對(duì)分析離子譜圖獲得揮發(fā)物組分。

1.2.2 EAG測(cè)定

參照范麗清等[17]和寧眺等[26]的方法略調(diào)整：以液態(tài)石蠟作為空白對(duì)照，各揮發(fā)物以液態(tài)石蠟為溶劑分別配制成濃度為2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，測(cè)試劑量為20 μL。將光肩星天牛成蟲的雌、雄觸角從基部剪下，并將觸角末端的第1節(jié)切除，然后將觸角兩端分別與參考電極和記錄電極上的導(dǎo)電針相連，調(diào)整氣味管與觸角間的距離。取 20 μL 待測(cè)試樣品溶液滴在濾紙條(1.5 cm × 0.8 cm) 上，立即用鑷子將濾紙條塞進(jìn)干凈的巴斯德管頂部，然后將樣品管的末端連接到氣體刺激裝置，設(shè)定刺激氣流流速為400 mL/min，持續(xù)氣流流速為100 mL/min。待基線平穩(wěn)后給予刺激。每個(gè)樣品刺激時(shí)間為0.5 s，刺激間隔20 s。每個(gè)測(cè)試標(biāo)樣至少重復(fù)5 次，記錄EAG反應(yīng)值。

1.2.3 嗅覺行為反應(yīng)的生物測(cè)定

采用“Y”型嗅覺儀測(cè)定光肩星天牛對(duì)糖槭揮發(fā)物主要成分的嗅覺行為[6,14,27-28]。各揮發(fā)物以液態(tài)石蠟為溶劑分別配制成濃度為2.000 0、0.400 0、0.040 0、0.004 0和0.000 4 mol/L，選取健康完好且活力較強(qiáng)的光肩星天牛成蟲進(jìn)行嗅覺行為測(cè)定，每次取 1 頭進(jìn)行行為選擇測(cè)定，觀察 3 min，對(duì)進(jìn)入引誘臂和對(duì)照臂10 cm 以上且停留超過20 s 的分別記為光肩星天牛對(duì)氣味源具有正趨向性和負(fù)趨向性，否則記為無反應(yīng)。同一揮發(fā)物同一濃度對(duì)光肩星天牛嗅覺行為影響的測(cè)定，記為1組，每測(cè)完1組后，清洗干凈并烘干，同時(shí)將引誘臂和對(duì)照臂互換，以消除實(shí)驗(yàn)環(huán)境對(duì)光肩星天牛嗅覺行為產(chǎn)生的影響，每種揮發(fā)物每個(gè)濃度測(cè)定10頭天牛，重復(fù)5次。

引誘率和驅(qū)避率計(jì)算：引誘率=引誘臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測(cè)試的總蟲數(shù) ×100%，驅(qū)避率=對(duì)照臂內(nèi)的總蟲數(shù)/測(cè)試的總蟲數(shù) ×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 19. 0進(jìn)行分析，利用單因素方差Duncan多重比較法分別分析雌、雄光肩星天牛成蟲對(duì)同種揮發(fā)物不同濃度EAG反應(yīng)的差異顯著性、同一揮發(fā)物不同濃度及同一濃度下不同揮發(fā)物引誘率的差異顯著性，利用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析同種揮發(fā)物在同一濃度下雌、雄光肩星天牛成蟲EAG反應(yīng)的差異顯著性；用卡方檢驗(yàn)分析同種揮發(fā)物在同一濃度分別對(duì)雌、雄光肩星天成蟲嗅覺行為影響的差異顯著性[29-31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 糖槭揮發(fā)物的分析與鑒定

通過GC-MS對(duì)糖槭枝葉揮發(fā)物的分析和鑒定，共鑒定出7類34種揮發(fā)性化合物(表1)。

表1 糖槭揮發(fā)物組分

經(jīng)鑒定，酯類17種、烷烴類5種、醇類4種、酸類4種、烯類2種、醛類1種、酮類1種。其中，酯類占61.67%，烯類占12.99%，酸類占5.58%，醇類占5.02%，烷烴類占1.54%，酮類占0.65%，醛類占0.60%，乙酸葉醇酯占比最高，為33.06%。

2.2 光肩星天牛對(duì)糖槭12種揮發(fā)物的EAG反應(yīng)

經(jīng)測(cè)定，光肩星天牛雌、雄成蟲對(duì)糖槭的12種5個(gè)濃度揮發(fā)物的EAG反應(yīng)，不僅在不同揮發(fā)物間存在差異，在同種揮發(fā)物不同濃度間也存在差異，見表2。

表2 光肩星天牛雌、雄成蟲對(duì)12種糖槭揮發(fā)物的EAG反應(yīng)及t檢驗(yàn)

與對(duì)照相比較，同種揮發(fā)物不同濃度條件下，光肩星天牛雌成蟲對(duì)5個(gè)濃度的乙酸己酯、乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯和月桂酸，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、2-己基-1-癸醇和羅勒烯，0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸和角鯊烯EAG反應(yīng)差異顯著(P<0.05，df=29，12種揮發(fā)物對(duì)應(yīng)12個(gè)F值依次分別為9 046.72、4 058.39、2 321.24、1 695.25、3 3218.99、1 1981.50、5 068.37、4 461.78、1 0481.90、1 731.38、15 148.18和2 943.85)；雄成蟲對(duì)5個(gè)濃度的乙酸己酯、乙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、棕櫚酸甲酯、丙酸葉醇酯和角鯊烯，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的十四酸、月桂酸、羅勒烯和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L己二酸二異丁酯EAG反應(yīng)差異顯著(P<0.05，df=29，12種揮發(fā)物對(duì)應(yīng)12個(gè)F值依次分別為：6 749.35、142.80、1 433.28、5 388.02、11 673.01、5 647.97、624.10、491.76、6 537.75、1 317.82、19 466.74和790.99)。雌、雄成蟲對(duì)同種揮發(fā)物EAG反應(yīng)相比較，在相同濃度下，雌成蟲對(duì)乙酸己酯、己二酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二異丁酯、乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯、月桂酸和順-3-己烯醇EAG反應(yīng)均高于雄蟲，且EAG反應(yīng)與揮發(fā)物濃度呈正相關(guān)關(guān)系，隨揮發(fā)物濃度的增加，EAG反應(yīng)愈加明顯；雄成蟲對(duì)0.000 4和0.004 0 mol/L的羅勒烯和角鯊烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的2-己基-1-癸醇、0.000 4、0.004 0和0.040 0 mol/L的十四酸、0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯EAG反應(yīng)均高于雌蟲，雌、雄成蟲對(duì)0.040 0 mol/L和 0.000 4 mol/L的角鯊烯EAG反應(yīng)值相同，而各揮發(fā)物其余濃度處理的EAG反應(yīng)均為雄蟲低于雌蟲。

獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，同種揮發(fā)物同一濃度條件下，雌、雄光肩星天牛成蟲EAG反應(yīng)存在一定的差異(df=8，每種揮發(fā)物5個(gè)濃度，12種揮發(fā)物對(duì)應(yīng)60個(gè)F值，依次分別為：0.118、0.889、0.057、0.508、1.237、0.257、0.020、2.667、0.227、0.011、2.541、1.419，5.434、0.962、0.411、0.382、0.940、2.909、0.132、0.012、0.008、1.753、0.014、0.158，0.084、0.200、2.400、0.573、7.656、0.400、0.566、0.691、0.159、5.158、0.086、1.455，1.070、4.872、0.364、0.008、0.620、0.311、2.163、0.000、1.185、0.242、0.597、5.333，0.118、1.258、0.117、6.400、1.525、0.311、1.151、2.939、1.455、0.042、7.100、7.692)，雌、雄成蟲對(duì)0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯、乙酸葉醇酯和順-3-己烯醇，0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯、丙酸葉醇酯、月桂酸和2-己基-1-癸醇，0.400 0和2.000 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和羅勒烯，0.004 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯、0.004 0和0.400 0 mol/L的十四酸、2.000 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯EAG反應(yīng)差異極顯著(P<0.01)，對(duì)0.000 4和0.004 0 mol/L的己二酸二異丁酯、0.000 4 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、0.004 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和丙酸葉醇酯、0.040 0和0.400 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、0.040 0 mol/L和2.000 0 mol/L的十四酸、0.0400 0 mol/L的羅勒烯、0.400 0 mol/L的角鯊烯EAG反應(yīng)差異顯著(P<0.05)，對(duì)0.000 4和0.004 0 mol/L的鄰苯二甲酸二異丁酯、月桂酸、羅勒烯和2-己基-1-癸醇、0.000 4 mol/L和0.040 0 mol/L的棕櫚酸甲酯和角鯊烯、0.000 4 mol/L的乙酸葉醇酯、丙酸葉醇酯和十四酸EAG反應(yīng)差異不顯著(P>0.05)。

2.3 光肩星天牛對(duì)12種槭樹揮發(fā)物的嗅覺行為反應(yīng)

經(jīng)測(cè)定，光肩星天牛雌、雄成蟲對(duì)12種5個(gè)濃度糖槭揮發(fā)物的嗅覺行為反應(yīng)，不僅在同一濃度不同揮發(fā)物間存在一定的差異，而且在同種揮發(fā)物不同濃度間也存在著一定的差異(表3)。

表3 光肩星天牛雌、雄成蟲對(duì)12種糖槭揮發(fā)物的嗅覺行為反應(yīng)

表3(續(xù))

從表3可以看出，就光肩星天牛雌成蟲而言，具有引誘作用的揮發(fā)物7種，具有驅(qū)避作用的揮發(fā)物2種，無引誘或驅(qū)避作用的揮發(fā)物3種?？ǚ綑z驗(yàn)(df=4)結(jié)果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、0.400 0和2.000 0 mol/L的己二酸二異丁酯和2-己基-1-葵醇、2.000 0 mol/L的月桂酸均具有較強(qiáng)的引誘作用，引誘率與驅(qū)避率相比較差異極顯著(P<0.01)；0.000 4 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯具有一定的引誘作用，引誘率與驅(qū)避率相比較差異顯著(P<0.05)；0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的羅勒烯和0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯具有較強(qiáng)的驅(qū)避作用，驅(qū)避率與引誘率相比較差異極顯著(P<0.01)。具有引誘或驅(qū)避作用的同一揮發(fā)物，引誘或驅(qū)避作用呈現(xiàn)出隨濃度的增加而增強(qiáng)的現(xiàn)象，具有引誘或驅(qū)避作用的同一濃度不同揮發(fā)物也存在一定的差異。

從表3還可以看出，在實(shí)驗(yàn)選取的5個(gè)濃度測(cè)定范圍內(nèi)，對(duì)光肩星天牛雄蟲具有引誘作用的揮發(fā)物有5種，具有驅(qū)避作用的揮發(fā)物有2種，無引誘或無驅(qū)避作用的揮發(fā)物有5種?？ǚ綑z驗(yàn)(df=4)結(jié)果表明，0.004 0、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸葉醇酯和丙酸葉醇酯、0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的乙酸己酯和順-3-己烯醇、、0.400 0和2.000 0 mol/L的2-己基-1-癸醇，均具有較強(qiáng)的引誘作用，引誘率與驅(qū)避率相比，差異極顯著(P<0.01)。0.040 0、0.400 0和2.000 0 mol/L的羅勒烯和0.400 0和2.000 0 mol/L的角鯊烯具有較強(qiáng)的驅(qū)避作用，驅(qū)避率與引誘率相比較差異極顯著(P<0.01)；0.004 0 mol/L的羅勒烯具有一定的驅(qū)避作用，驅(qū)避率與引誘率相比較差異顯著(P<0.05)。

3 討 論

植物揮發(fā)物通常為分子質(zhì)量為100～200 u的有機(jī)化合物，包括烴類、烯類、酯類、醇類、有機(jī)酸類、酮類及芳香類化合物等物質(zhì)，它們按一定的比例形成混合物對(duì)植食性昆蟲產(chǎn)生嗅覺刺激，在植食性昆蟲寄主選擇過程中扮演者重要的角色[32-35]。本研究對(duì)糖槭揮發(fā)物分析鑒定結(jié)果表明，糖槭揮發(fā)物的主要成分與復(fù)葉槭、五角槭、華北五角槭及挪威槭揮發(fā)物主要成分具有明顯的差異，復(fù)葉槭的主要成分為酯類、醛類、烷烴類和烯類，其中酯類占79.26%、醛類占9.47%、烷烴類占7.41%、烯類占3.2%；五角槭的主要為酯類和醛類，其中酯類占72.1%、醛類占10.15%、醇類占8.45%、烯類占6.55%、烷烴類占2.02%；華北五角槭的主要為酯類、烯類和醇類，其中酯類占62.08%、烯類占12.49%、醛類占11.72%、醇類占11.82%、烷烴類占1.05%；而挪威槭的主要為酯類、醛類和醇類，其中酯類占57.87%、醇類占21.68%、醛類占14.07%、酮類占3.7%、烯類占2.33%。醛類的含量越低，對(duì)光肩星天牛的引誘效果更好，醛類含量從小到大的樹種順序?yàn)椋禾情?復(fù)葉槭<五角楓<華北五角楓<挪威槭[6,14,19]。同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，這些揮發(fā)物成分及其含量的差異是5種槭樹感蟲及其差異的原因[17]。

觸角是昆蟲的主要嗅覺器官，分布有不同類型的感器，不同類型的感器具有不同的功能，以幫助昆蟲適地適時(shí)的完成特定的生物學(xué)行為，如棲息地的選擇、寄主識(shí)別與定位、求偶、產(chǎn)卵等[36-37]。本研究結(jié)果顯示，光肩星天牛雌、雄成蟲對(duì)同一揮發(fā)物的EAG和嗅覺行為反應(yīng)趨勢(shì)基本上是一致的，在實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的濃度范圍內(nèi)，隨濃度的增加EAG和嗅覺行為反應(yīng)也更加明顯；但同濃度下雌、雄成蟲間存在一定的差異，這種差異可能跟光肩星天牛雌、雄成蟲觸角上的感器數(shù)量及功能類別有關(guān)[17,38]。己二酸二異丁酯和月桂酸對(duì)光肩星天牛雌成蟲具有引誘作用，對(duì)雄成蟲無明顯的趨性作用。在自然界，植物釋放的信息化學(xué)物質(zhì)是多種微濃度的氣味物質(zhì)的混合物，植物揮發(fā)物對(duì)植食性昆蟲的引誘、驅(qū)避是多種氣味物質(zhì)協(xié)同作用的結(jié)果[17]。這兩種揮發(fā)物是否與環(huán)境中復(fù)雜的氣味源一起對(duì)雌性光肩星天牛成蟲(有別于雄性光肩星天牛)在寄主植物上的生理功能(如產(chǎn)卵行為等)產(chǎn)生一定的調(diào)控作用，還需進(jìn)一步研究。