叢枝菌根真菌對鹽脅迫下楨楠光合生理的影響

崔令軍,劉瑜霞,林 健,石開明

(生物資源保護與利用湖北省重點實驗室，湖北民族大學(xué)，湖北 恩施 445000)

鹽脅迫是自然界主要的非生物脅迫之一，土壤鹽漬化在農(nóng)林業(yè)領(lǐng)域造成糧食減產(chǎn)、植被減少和森林覆蓋率降低[1]。土壤鹽漬化主要是由于高濃度的鹽離子附著于土壤黏土顆粒表面，不僅造成土壤的pH偏高(pH > 8.5)，還對林木的生長也產(chǎn)生非常不利的影響，如高濃度的鹽離子使?jié)B透物質(zhì)受到損傷，光合色素減少、光合能力降低，進而造成林木生長速度下降[2-3]。光合作用是林木生長發(fā)育的基礎(chǔ)，也是初級代謝過程中一個非常關(guān)鍵的過程。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽漬化土壤中生長的林木，光合色素含量下降，光合生理過程受到抑制，生物量降低[4]，進而導(dǎo)致林木產(chǎn)量和質(zhì)量下降[5-6]。

目前應(yīng)用接種叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi，AMF)來提高植物對鹽堿耐受性的方法日益受到農(nóng)林學(xué)家的廣泛關(guān)注。AMF可以與地球上80%以上的植物根系建立共生關(guān)系[7]并形成叢枝菌根[8-9]，在這種共生關(guān)系中AMF可以緩解生物和非生物脅迫對宿主植物造成的傷害，使得植物的碳素循環(huán)過程和光合作用過程得到加強[10-11]，AMF可以增加葉面積和光合色素含量[12-13]，提高對光能的吸收利用效率[14-15]；同時AMF侵染根系能夠促進植株對土壤中水分和養(yǎng)分的充分吸收[16]，以及其他生理生化等方面的改善[17-18]，進而能夠減輕植物受到鹽脅迫時的不利影響，提高植物的抗鹽能力[19]。

楨楠(Phoebezhennan)，為樟科(Rosaceae)楠屬(Phoebe)常綠大喬木，是亞熱帶常綠落葉闊葉林的重要組成樹種，其木材堅硬、耐腐爛、壽命長，是上等用材樹種和景觀綠化樹種[20]，也是國家二級保護瀕危物種。近年來，以楨楠為材料進行相關(guān)科學(xué)研究，研究成果主要集中在種子萌發(fā)、生長和生理特性研究等方面。前期研究發(fā)現(xiàn)AMF在高鹽濃度下(300 mmol/L)對楨楠根系具有較高的侵染率(41.25%)，且AMF接種能夠顯著地促進楨楠根系生長[21]。但是，目前還沒有關(guān)于鹽脅迫下接種AMF對楨楠光合生理影響的報道。本研究以楨楠為試驗材料，研究在不同濃度鹽脅迫下接種叢枝菌根真菌Funneliformismosseae對葉綠素含量、氣體交換參數(shù)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)等的影響，探討叢枝菌根真菌在改善楨楠耐鹽性方面的作用，以期為楨楠在鹽堿地上造林提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以楨楠為試驗材料，2017年11月上旬于湖北省恩施土家族苗族自治州林業(yè)科學(xué)研究院(109°29′58″E，30°17′51″ N)采集楨楠種子，于室溫下陰干后調(diào)制，置于4 ℃冰箱保存。所用AMF菌種為Funneliformismosseae，購于中國叢枝菌根真菌種質(zhì)資源庫，并以三葉草(Trifoliumrepens)為寄主植株進行擴繁；接種菌劑包含AM真菌侵染的三葉草根段及真菌孢子，每個真菌接種處理接種120 g菌劑(約1 500個孢子)。

1.2 試驗設(shè)計

2018年3月，將種子取出，用10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的碳酸氫鈉溶液浸泡48 h，然后搓洗去除種子表面包被的油脂，經(jīng)70%酒精消毒后用蒸餾水清洗干凈，置于滅菌(0.11 MPa，121 ℃，1 h)的河沙中催芽。將催芽的種子置于人工氣候箱內(nèi)，晝夜溫度設(shè)置為25 ℃/18 ℃，相對濕度80%，光照時間16 h，黑暗8 h。選取高度一致、具有4片真葉的無菌楨楠幼苗移栽到塑料盆中，加入1.5 kg消毒(0.11 MPa，121 ℃，1 h)基質(zhì)(土壤與沙體積比1∶1)。試驗于8—9月在塑料大棚內(nèi)進行，設(shè)AMF接種(+AMF)處理和未接種(-AMF)2組處理，每個處理種植10盆，每盆3株幼苗。接種菌劑包含AMF真菌侵染的三葉草根段及AMF真菌孢子，未接種處理在塑料盆中填充相同質(zhì)量的滅菌物質(zhì)以保持微生物區(qū)系一致。NaCl處理設(shè)計3個水平，分別為100、200和300 mmol/L，以蒸餾水為對照(CK)，每隔2～3 d澆1次鹽水，每次各澆100 mL，缽下放盤，為保持盆內(nèi)鹽濃度，如有滲漏，將滲出液倒回盆中。

1.3 參數(shù)測定方法

1.3.1 光合色素含量測定

光合色素含量采用丙酮浸提法[22]進行測定。采集形狀完好、長勢相近的楨楠葉片，洗凈后剪碎混勻，稱取0.5 g樣品，加入少量的碳酸鈣、石英砂、丙酮進行充分研磨，濾液定容至25 mL。然后取1 mL溶液稀釋至10 mL，用分光光度計測定波長在470、646和663 nm處的吸光度值A(chǔ)470、A646和A663，計算葉綠素a(Chl a)、葉綠素b(Chl b)和類胡蘿卜素(Car)含量。每處理測定5次。

1.3.2 氣體交換參數(shù)測定

采用Li-6400便攜式光合測定儀(LI-COR Inc,USA)，在天氣晴朗的上午測定氣體交換參數(shù)，測定時光照強度設(shè)定為1 000 μmol/(m2·s)，溫度為(25±1) ℃，選取長勢一致的完全展開葉進行測定，每處理測定5次。測定指標(biāo)有：凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。

1.3.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定

采用Li-6400便攜式光合測定儀進行葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定。葉片經(jīng)過30 min充分暗適應(yīng)，照射測量光后得到初始熒光(Fo)，隨后給一個飽和脈沖光后得到暗適應(yīng)下的最大熒光(Fm)，當(dāng)熒光產(chǎn)量從Fm降回Fo時，打開葉綠素?zé)晒?，恒定后測得穩(wěn)態(tài)熒光(Fs′)，打開飽和脈沖光得到光化學(xué)作用下的最大熒光(Fm′)；隨后關(guān)閉作用光使葉片暗適應(yīng)5 s后打開遠紅光，測光適應(yīng)葉片的最小熒光(Fo′)，然后計算最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、實際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(qP)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(NPQ)。每處理測定5次。

1.4 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)通過Excel 2016和SPSS 22.0軟件進行不同處理間差異的比較和雙因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽脅迫下AMF對楨楠光合色素含量的影響

光合色素主要有Chl a、Chl b和Car，它們以色素蛋白復(fù)合體的形式存在于葉綠體中。由鹽脅迫和AMF處理對楨楠光合色素含量的影響(表1)可知，在同一濃度NaCl脅迫下，AMF接種處理顯著提高了楨楠光合色素含量，AMF接種與未接種處理呈顯著差異(P<0.05)。雙因素方差分析顯示，AMF接種對Chl a、Chl b和Car有顯著影響，鹽脅迫對葉綠素a與葉綠素b含量比值(Chl a/Chl b)有顯著影響，接種與鹽脅迫的交互作用僅對Car影響顯著(表2)。

表1 鹽脅迫和AMF處理對楨楠光合色素含量的影響

表2 接種、鹽脅迫和二者交互作用對楨楠光合特性參數(shù)的影響

2.2 鹽脅迫下AMF對楨楠光合作用的影響

2.2.1 楨楠凈光合速率的變化

凈光合速率(Pn)體現(xiàn)了植物光合作用積累的有機物，凈光合速率越高，表明植物在單位時間內(nèi)積累的有機物的數(shù)量也就越多。由鹽脅迫下AMF對楨楠氣體交換參數(shù)的影響(圖1A)可知，在不同NaCl濃度下(P<0.05)，接種AMF后Pn顯著高于未接種處理;在NaCl濃度為100、200和300 mmol/L時，接種處理Pn比對照減少2.67%、17.62%和32.56%，而未接種處理Pn則比對照降低8.73%、48.66%和49.91%。雙因素方差分析顯示接種對Pn無顯著影響，鹽脅迫及兩者的交互作用對Pn影響均顯著(表2)。

注：不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。下同。Lowercase letters in the data label indicate significant differences at the 0.05 level. The same below.圖1 鹽脅迫和AMF處理對楨楠主要光合參數(shù)的影響Fig.1 Combinative effects of AMF and salt stress on photosynthesis parameters in P. zhennan

圖2 鹽脅迫和AMF處理對楨楠葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.2 Combinative effects of the AMF and salt stress on chlorophyll fluorescence parameters in P. zhennan

2.2.2 楨楠氣孔導(dǎo)度的變化

植物氣孔是控制葉片水蒸氣和CO2擴散的通道，植物的光合作用過程直接受到氣孔的影響。由圖1B可以看出，AMF接種處理后氣孔導(dǎo)度(Gs)顯著高于未接種處理，除了NaCl濃度為100 mmol/L外，其余接種與未接種處理Gs均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。在NaCl濃度為100、200和300 mmol/L時，接種處理Gs比對照減少10.42%、25.66%、36.81%，而未接種處理Gs則比對照降低了16.67%、39.68%、57.94%。雙因素方差分析表明，接種對Gs無顯著影響，鹽脅迫及兩者交互作用對Gs影響均顯著(表2)。

2.2.3 楨楠胞間CO2濃度的變化

胞間CO2濃度(Ci)是植物細胞間的CO2濃度，當(dāng)氣孔關(guān)閉后，植物進行光合作用所需要的CO2就從細胞間來獲取。由圖1C可知，AMF接種處理后Ci顯著高于未接種處理，除了NaCl濃度為300 mmol/L外，其余AMF接種與未接種處理Ci均呈現(xiàn)顯著差異(P< 0.05)。NaCl濃度為100、200和300 mmol/L時，AMF接種處理Ci比對照減少3.57%、16.08%、49.55%，而未接種處理Ci則比對照降低了8.52%、29.15%和54.26%。雙因素方差分析表明，接種對Ci無顯著影響，鹽脅迫及兩者交互作用對Ci影響均顯著(表2)。

2.2.4 楨楠蒸騰速率的變化

蒸騰作用是植物體內(nèi)的水分以氣體形式從植物體內(nèi)散失到外界大氣間的過程，是促進水分在植物體內(nèi)輸送的主要動力。由圖1D可以看出，AMF接種處理后蒸騰速率(Tr)顯著高于未接種處理，接種與未接種處理Tr均呈現(xiàn)顯著差異(P<0.05)。在NaCl濃度為100、200和300 mmol/L時，AMF接種處理Tr比對照減少3.48%、16.04%和27.23%，而未接種處理Tr則比對照降低了16.59%、40.81%和62.33%。雙因素方差分析表明，接種對Tr無顯著影響，鹽脅迫及兩者交互作用對Tr影響均顯著(表2)。

2.3 鹽脅迫下AMF對楨楠葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)可以檢測逆境下植物的光合生理狀況，能夠反映植物對干旱、鹽堿等逆境脅迫的忍受能力。鹽脅迫下，AMF接種后楨楠Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP沒有顯著變化，而未接種處理的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP均顯著降低(圖2A、2B、2C)。在對照和NaCl濃度為0、100和200 mmol/L時，AMF接種處理Fv/Fm、ΦPSⅡ均顯著高于未接種，而接種處理qP在對照和NaCl濃度為100 mmol/L時和未接種無顯著差異，但在200、300 mmol/L時差異顯著；隨著鹽濃度升高，在NaCl濃度為300 mmol/L時，未接種處理NPQ顯著升高，而接種處理NPQ沒有顯著變化(圖2D)。NPQ在NaCl濃度為0、100和200 mmol/L時，AMF接種與未接種差異不顯著，在300 mmol/L時未接種NPQ顯著高于AMF接種。雙因素方差分析顯示AMF接種對ΦPSⅡ有顯著影響，鹽脅迫對ΦPSⅡ和qP影響顯著，兩者交互作用僅對Fv/Fm有顯著影響(表2)。

3 討 論

鹽脅迫對植物的影響在最初階段主要表現(xiàn)為對植物光合作用的影響，鹽離子濃度的升高抑制了葉綠素合成過程中必需元素的吸收，降低葉片中葉綠素含量[23]，而葉綠素含量的多少又影響植物對光能的吸收、轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)換。研究發(fā)現(xiàn)鹽脅迫條件下，接種AMF顯著增加了(ZeamaysL.)[24]和(RobiniapseudoacaciaL.)[25]葉片的葉綠素含量。本試驗結(jié)果表明，鹽脅迫下AMF接種處理的光合色素含量均顯著高于未接種處理。隨著NaCl濃度增加，接種處理的Chl a、Chl b和Car含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，這是由于在輕度鹽脅迫下接種AMF促進了楨楠對礦質(zhì)營養(yǎng)元素的吸收，從而增加了合成光合色素酶的活性，提高了植株中的葉綠素含量和光合能力；同時試驗發(fā)現(xiàn)未接種AMF處理的Chl a、Chl b和Car含量均呈下降趨勢，表明在鹽脅迫下植物光合色素合成酶的活性受到抑制，進而降低了未接種葉片的葉綠素含量。

植物的光合作用是植物初級代謝過程中一個十分關(guān)鍵的過程，AMF能夠提高鹽脅迫下植物的光合能力是由于在接種植株中氣體交換能力和光合酶活性增強。研究發(fā)現(xiàn)在鹽脅迫下接種幼套近明囊酶(C.etunicatum)后增加了(OryzasativaL.)的光化學(xué)效率和氣孔導(dǎo)度，提高了二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶的活性[26]。本試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)鹽脅迫下AMF接種處理的Pn、Gs、Ci、Tr均顯著高于未接種處理，尤其是未接種處理的Pn和Tr在高鹽濃度下顯著低于AMF接種處理。可能在這個過程中植物葉片部分氣孔關(guān)閉，使得氣孔對CO2的通過性降低，限制了外界CO2進入葉片內(nèi)部，導(dǎo)致植物體內(nèi)可以利用的CO2減少，而接種AMF提高了葉片氣孔對CO2的通過性，使得可以利用的CO2增加，從而增加了植株的光合作用。

光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)可以反映植物的光合能力和能量利用效率，且對鹽脅迫非常敏感。鹽脅迫能夠使植物的葉綠體結(jié)構(gòu)受到損傷，進而降低植物的光合效率[27]。本研究中，鹽脅迫下接種AMF能夠提高楨楠的Fv/Fm、ΦPSⅡ、qP，表明接種后PSⅡ光化學(xué)量子效率和電子傳遞的能力升高。而NPQ增加是植物自身對鹽脅迫產(chǎn)生的一種光保護機制，這種機制同時也會導(dǎo)致光化學(xué)量子效率降低。本研究發(fā)現(xiàn)AMF接種處理NPQ在鹽脅迫下無顯著變化，而未接種處理在高鹽脅迫下NPQ則顯著升高，這意味著接種AMF后楨楠將吸收的光能更多地用于光合作用，從而增加了對光能的利用效率。

綜上所述，本試驗結(jié)果證實楨楠在鹽脅迫下接種AMF具有較強的增抗作用，AMF能夠增強楨楠的光合色素含量、凈光合速率、氣孔導(dǎo)度、葉綠素?zé)晒鈪?shù)等光合特性，提高對光能的吸收利用效率，從而減輕了鹽分對楨楠造成的傷害，表明AMF能夠增強楨楠的耐鹽性，進而能夠促進楨楠在鹽堿性土壤中生長。