‘紅葉’杜仲葉色轉(zhuǎn)變過程中葉片生理指標變化

路買林，陳夢嬌，張嘉嘉，趙建霞，朱景樂，杜紅巖*

(1. 國家林業(yè)和草原局泡桐研究開發(fā)中心，河南 鄭州 450003；2. 河南林業(yè)職業(yè)學(xué)院，河南 洛陽 471002；3. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，河南 鄭州 450002；4.鄭州植物園，河南 鄭州 450042；5. 經(jīng)濟林種質(zhì)創(chuàng)新與利用國家林業(yè)和草原局重點實驗室，河南 鄭州 450003)

植物葉片顏色由葉綠素、類胡蘿卜素和花色苷三大類色素共同決定，而顏色變化的直接原因就是葉片中的色素種類和含量發(fā)生變化，其中對葉片產(chǎn)生紅色作用最大的是花色苷[1-3]。花色苷合成途徑屬于類黃酮代謝途徑，是植物重要的次生代謝途徑，其中苯丙氨酸裂解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)在花色苷合成中起到重要作用。

‘紅葉’杜仲(Eucommiaulmoides‘Hongye’)是中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟林研究開發(fā)中心選育的藥用觀賞兼?zhèn)涞膬?yōu)良品種，在園林綠化及保健品開發(fā)等領(lǐng)域均具有廣闊的應(yīng)用前景[4]?！t葉’杜仲葉片暗紅色，顏色指數(shù)和花色苷含量與已知品種差異顯著，而葉片pH、可溶性糖的種類及含量均無顯著差異[5]，葉片呈色組織是柵欄組織[6]。自展葉后‘紅葉’杜仲葉片在強光下逐步變成紫紅色并保持至落葉，但是目前關(guān)于‘紅葉’杜仲葉色變化過程中葉片的色差值、色素含量及酶活性變化規(guī)律，以及上述指標間的關(guān)聯(lián)性的研究報道。筆者以‘紅葉’杜仲和與其色素含量差異最大的‘小葉’杜仲(E.ulmoides‘Xiaoye’)為材料，通過對葉片顏色轉(zhuǎn)變過程中色素含量、酶活性及葉片色差值的測定，探尋形態(tài)指標和生理生態(tài)指標間的變化規(guī)律及相關(guān)關(guān)系，以期為揭示‘紅葉’杜仲葉片典型呈色機理提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 研究材料

供試杜仲材料取自原陽杜仲良種繁育圃(113°46.24′～113°47.59′E，34°55.30′～34°56.45′N)。砧木2011年播種，行距40 cm，株距5 cm左右；當年7月中旬分別嫁接‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲；2012年春季剪砧，后期管理中保留1個優(yōu)勢芽。

1.2 研究方法

1.2.1 取樣方法

在試驗林內(nèi)選擇‘紅葉’杜仲和‘小葉’杜仲各5株并記錄新葉完全展開的日期。2013年7月3日10：00—11：00，從頂端第3片葉子開始，依次向下取樣，每隔3片葉取樣1次，每個單株為1個生物學(xué)重復(fù)。待測定的葉片從上而下完全展葉后時間分別是6 d(6月26日展葉)、14 d(6月19日展葉)、22 d(6月12日展葉)、30 d(6月5日展葉)及38 d(5月29日展葉)。

1.2.2 葉片色素含量測定

采用Fadeel[7]的方法測定葉綠素和類胡蘿卜素含量。稱量剪去葉脈后成熟葉片0.10 g(精確到0.01 g)，加入90%丙酮10 mL黑暗研磨后(4 000 r/min)離心10 min，然后取上清液分別測定445、644和662 nm處的吸光值；每次以相同波長下2個吸光值的平均值進行光合色素含量計算[8]。

1.2.3 葉片花色苷含量測定

花色苷含量測定根據(jù) Rabino等[9]的方法并加以改進。將新鮮葉片用清水洗凈，準確稱量剪去葉脈的葉片 0.10 g(精確到 0.01 g)，研磨加入體積分數(shù)1% HCl-甲醇溶液 10 mL，于32 ℃恒溫培養(yǎng)箱中 5 h，不時搖蕩，取出過濾。1%HCl-甲醇溶液稀釋5倍后作為待測液。以1% HCl-甲醇溶液為對照，分別測定 530、657 nm 處吸光值(記為A530與A657)；每個品種重復(fù) 5 次，每次以相同波長下的 2 個吸光值的平均值進行花色苷含量(CA)計算，CA=(A530-0.25×A657)V/(W×1 000)。具體操作見文獻[10]。式中:A為在一定波長下的吸光值；C為色素含量，mg/g;V為提取液體積，mL;W為樣品鮮質(zhì)量，g 。

1.2.4 類黃酮含量測定

提取樣品，采用三氯化鋁顯色法測定類黃酮，以蘆丁作標準品代替樣品作標準曲線，配制50 μg/mL蘆丁標準溶液，得到回歸方程Y=209.32x+1.58(R2=0.999)，繪制黃酮標準曲線，具體實驗參照蘇東海等[11]的方法。

1.2.5 葉片色差值測定

使用CR2500型色差計(日本MINOLTA公司)測定L(明度值)，a*(變紅度值)及b*(變黃度值)，每個葉片在避開葉脈處隨機選擇10個點，以其平均值作為該葉片的平均值。利用a*和b*可以計算出色澤飽和度(chroma，C*)和色調(diào)角(hur angle，h)，其中C*=(a*2+b*2)/2，h=arctan(b*/a*)。計算葉片顏色指數(shù)(color index)，顏色指數(shù)=(180-h)/(L+C*)。采用紅色葡萄果實顏色指數(shù)的方法來評價果實的外觀色澤：顏色指數(shù)<2為黃綠、2≤顏色指數(shù)<4為粉紅、4≤顏色指數(shù)<6為深紅、顏色指數(shù)≥6為藍黑[12]。

1.2.6 酶提取方法及測定

苯丙氨酸裂解氨酶(PAL)和查爾酮異構(gòu)酶(CHI)提取方法：在避開葉脈處取0.50 g葉片凍樣，加入0.05 mol/L Na2HPO4(pH 7.0)的提取液5 mL，0.05 mol/L抗壞血酸，0.02 mol/L琉基乙醇，冰浴勻漿，4 ℃ 15 000 g離心20 min，上清液為PAL酶和CHI酶的粗提液。每個品種重復(fù)5次。PAL酶活性測定參照王惠聰?shù)萚13]的方法，CHI酶活性測定參照Lister等[14]的方法進行。

1.3 統(tǒng)計分析

利用SPSS16.0對數(shù)據(jù)進行方差分析及相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜仲2個品種葉片色差值隨時間的變化規(guī)律

2個杜仲的葉片色差值在不同時期測定結(jié)果如表1所示。

表1 杜仲2個品種葉片變化過程中的色差值

由表1可知，‘紅葉’杜仲的L由32.89降至28.44，a*由-8.70升至1.03，b*由13.35降至2.51，L、a*及b*在不同階段間均存在極顯著差異；‘小葉’杜仲的L、a*及b*在不同階段間亦存在極顯著差異；雖與‘紅葉’杜仲變化規(guī)律相似，但2品種各指標的初始值及變化幅度均存在顯著差別。‘小葉’杜仲顏色指數(shù)始終屬于黃綠級，而‘紅葉’杜仲第1、2階段屬于黃綠級，第3、4階段屬于粉紅級，第5階段達到深紅級。從葉色隨生長時間的變化情況(圖1)可知，小葉杜仲始終為綠色，葉片中沒有紅色物質(zhì)積累。顯微鏡下觀察紅葉杜仲發(fā)現(xiàn)，從第14天葉片中開始有紅色物質(zhì)積累；直接觀察葉片表面發(fā)現(xiàn)葉片最終轉(zhuǎn)為暗紅色。

圖1 杜仲兩品種葉色隨生長時間的變化情況Fig.1 Changes of leaf color with growth times of two Eucommia ulmoides cultivars

2.2 杜仲兩品種葉片色素含量、酶活性隨時間的變化規(guī)律

兩杜仲品種的葉片色素含量在不同時期測定結(jié)果如圖2所示，兩品種各種色素含量均為逐步上升，其中比較‘紅葉’杜仲第38天相對于第6天的增幅，Ca(葉綠素a含量)、Cb(葉綠素b含量)、CT(總?cè)~綠素含量)、CCar(類胡蘿卜素含量)、Cf(類黃酮含量)和CA(花色苷含量)分別為64.57%、102.42%、73.72%、21.93%、57.00%和748.96%；‘小葉’杜仲第38天相對于第6天的Ca、Cb、CT、CCar、Cf和CA增幅分別為24.93%、20.18%、23.50%、9.44%、24.40%和135.20%。雖然各種色素含量具有相同的變化趨勢，但在上述幾種物質(zhì)中，與葉片顏色變紅中最關(guān)鍵的是花色苷含量，而‘紅葉’杜仲的CA增幅則是‘小葉’杜仲的553.96%。

注：小寫字母代表同一品種在不同時期差異顯著(P<0.05)。The lowercase letters represent the significant differences among different times in the same cultivar.圖2 杜仲兩個品種葉片色素含量隨生長時間的變化規(guī)律Fig.2 Changes in leaf pigment content of two Eucommia ulmoides cultivars with growth times

由兩品種酶活性隨生長時間的變化情況(圖3)可知，無論‘小葉’杜仲還是‘紅葉’杜仲，不同取樣時間的PAL酶活性無顯著差異，且各取樣時間兩品種的酶活性大小相近。而‘紅葉’杜仲CHI酶活性隨著葉色的轉(zhuǎn)變直線上升，第38天相對于第6天可達306.14%，差異達到極顯著水平；‘小葉’杜仲CHI酶活性隨著葉色轉(zhuǎn)變也有逐步升高的趨勢，但是增幅較小，不同取樣時間的酶活性無顯著差異?！∪~’杜仲CHI酶活性僅為‘紅葉’杜仲同期的30.66%～59.41%，且隨著‘紅葉’杜仲葉色轉(zhuǎn)變，二者之間差距逐步增大，因此認為CHI酶在‘紅葉’杜仲典型葉色轉(zhuǎn)變過程中起到重要作用。

注：小寫字母代表‘小葉’杜仲在不同時期差異顯著(P<0.05)，大寫字母代表‘紅葉’杜仲在不同時期差異顯著(P<0.05)。The lowercase letters represent the significant differences in the E. ulmoides ‘Xiaoye’ among different times and the capital letters represent the significant differences in the E. ulmoides ‘Hongye’ among different times.圖3 杜仲兩品種PAL酶活性和CHI酶活性在不同時期的變化Fig.3 Changes of PAL enzyme activity and CHI enzyme activity of two Eucommia ulmoides cultivars in different periods

2.3 不同時期形態(tài)指標和生理指標間的相關(guān)性

由形態(tài)指標和生理指標間的相關(guān)性分析結(jié)果(表2)可知，L、a*及b*與類胡蘿卜素含量、花色苷的含量及類黃酮含量呈極顯著相關(guān)，而與葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素含量及葉綠素a與葉綠素b含量比(Ca/Cb)無顯著相關(guān)關(guān)系。CHI酶活性和杜仲葉片L、a*、b*、類胡蘿卜素含量、花色苷含量及類黃酮含量間均存在顯著或者極顯著的相關(guān)關(guān)系，而PAL與葉片色差值間則無顯著相關(guān)性。進一步說明CHI酶活性差異在‘紅葉’杜仲葉片顏色變化中的影響程度。

表2 葉色轉(zhuǎn)變過程中葉色指標、色素含量及酶活性的相關(guān)關(guān)系(n=10)

3 討 論

葉色是個綜合指標，常用的是通過對比標準比色卡進行定性分類，或通過表色系統(tǒng)法測定葉片的L、a*及b*。兩種方法均有不足，前者無法進行量化比較，后者則參數(shù)太多，單一指標間的比較也不全面。在葡萄果皮顏色研究中常用到顏色指數(shù)這一指標，即將表色系統(tǒng)法中的3個指標通過計算一個綜合指標[15]。本研究參考上述方法，計算杜仲兩品種葉片的顏色指數(shù)，得到‘小葉’杜仲顏色始終為“黃綠”級，而‘紅葉’杜仲的葉片則由“黃綠”級—“粉紅”級—“深紅”級變紅，說明了‘紅葉’杜仲葉片顏色性狀從量變到質(zhì)變的過程。前人將春季葉色呈紅色稱春色葉類型，秋季葉色呈紅色稱秋色葉型，兩個以上季節(jié)葉色呈紅色稱常色葉型[16]；彭少兵等[16]報道‘紅葉’杜仲葉片8—10月顏色均為紅色，本研究得到6月12日及之前展葉的葉片，在7月3日已經(jīng)變成紅色，因此應(yīng)將‘紅葉’杜仲分為常色葉類型。顏色指數(shù)這一指標在葉片顏色研究中應(yīng)用較少，本研究也為加速該指標在葉色研究領(lǐng)域中的推廣有一定積極意義。

葉片的顏色取決于葉綠素含量、花色苷含量及二者的比值[17]，當花色苷所占比例較高時呈現(xiàn)紫紅色。春色葉類型的變化規(guī)律為葉綠素增加，花色苷減少，如紅葉石楠等[18]；秋色葉類型的變化規(guī)律為葉綠素減少，花色苷增加，如黃櫨、紅楓等[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著杜仲葉片生長時間的延長，兩個品種的花色苷和葉綠素含量均逐步增加，但‘紅葉’杜仲葉片葉綠素含量的增幅小于花色苷含量的增幅，‘小葉’杜仲雖然也是同樣逐步增加的趨勢，但是花色苷增加幅度小于‘紅葉’杜仲的增加幅度，所以最終呈現(xiàn)出‘紅葉’杜仲葉片由綠變紅，而‘小葉’杜仲葉片始終為綠色。本研究結(jié)果豐富了常色葉類型的紅葉植物葉片色素的變化規(guī)律。

花色苷合成屬于類黃酮代謝途徑的分支，是植物重要的次生代謝途徑之一，在代謝途徑中各種酶起到重要的作用。本研究得到CHI酶活性在兩個品種葉色轉(zhuǎn)變過程中，CHI酶活性的變化與花色苷含量存在極顯著的正相關(guān)關(guān)系，不同時期的酶活性均存在顯著差異，且‘紅葉’杜仲的CHI酶活性增加幅度顯著高于‘小葉’杜仲；而PAL酶在兩個品種葉色轉(zhuǎn)變過程中變化趨勢一致，同一品種不同時期及不同品種相同時期的差異均不顯著，且PAL酶活性與花色苷含量無顯著相關(guān)性。所以認為不同品種間CHI酶活性的差異是‘紅葉’杜仲特殊葉色轉(zhuǎn)變的主要原因。本研究結(jié)果并不是說PAL酶對花色苷合成不重要，而是說PAL酶活性在兩個品種間無顯著差異，PAL酶是位于CHI酶之前的酶，是下游生產(chǎn)底物的保障，兩個杜仲品種在各階段PAL酶活性沒有顯著差異，說明為下游提供同樣的底物，但最終差異的產(chǎn)生是在于下游酶活性的差異。關(guān)于PAL酶活性和CHI酶活性對花色苷合成的作用存在爭議[13]，部分學(xué)者認為PAL對花色苷無顯著作用[21]，也有部分學(xué)者認為其與花色苷緊密相關(guān)[10]；普遍認為CHI酶對花色苷合成起關(guān)鍵作用。筆者認為PAL酶和CHI酶均是花色苷合成前期的關(guān)鍵酶，缺失一個均能導(dǎo)致代謝途徑的中斷，其對合成花色苷的意義均非常重要，不能分開而論。但如果從比較不同品種間合成花色苷能力的角度出發(fā)，則能分析其中哪個酶活性是影響花色苷合成能力高低的關(guān)鍵因子，從而反向推導(dǎo)上游基因功能差異，對揭示不同品種葉色差異起到參考作用。

‘紅葉’杜仲色差值在不同階段間差異明顯，且其葉色各指標的變化幅度遠高于‘小葉’杜仲，最終從視覺上呈現(xiàn)紅色。造成色差值指標變化的直接原因是花色苷含量在‘紅葉’杜仲中的增加幅度遠大于‘小葉’杜仲中，其中不同品種CHI酶活性的差異是主要原因之一。