油用牡丹‘鳳丹’種子層積過程中營養(yǎng)物質(zhì)的代謝變化研究

孫海燕,李 強(qiáng), 朱銘瑋,李永榮, 李淑嫻*

(1.南京林業(yè)大學(xué)，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2. 南京綠宙薄殼山核桃科技有限公司，江蘇 南京 210014)

油用牡丹是集油用、觀賞、藥用等多種用途于一體的重要經(jīng)濟(jì)植物，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值[1]。‘鳳丹’(Paeoniaostii‘Feng Dan’)是油用牡丹兩大品種群之一[2]，由楊山牡丹演化而來，原產(chǎn)于安徽銅陵、亳州，籽油中不飽和脂肪酸含量高達(dá)90%以上，其中α-亞麻酸占42%，顯著高于大豆、花生、橄欖油等食用油[3-4]。‘鳳丹’不僅結(jié)實(shí)性強(qiáng)，還具有耐寒、耐旱、耐瘠薄等特點(diǎn)[5]。

生產(chǎn)中‘鳳丹’通常以播種繁殖為主，但是種子存在休眠習(xí)性，自然條件下種子發(fā)芽歷時(shí)較長且出苗率較低，嚴(yán)重制約了油用牡丹的栽培與推廣[6]。多位學(xué)者對(duì)牡丹種子休眠的研究發(fā)現(xiàn)，上胚軸、下胚軸是造成種子休眠的主要原因，并且上胚軸休眠程度更深[7-8]；也有研究表明，‘鳳丹’種子內(nèi)存在的內(nèi)源抑制物是造成種子休眠的一個(gè)重要原因[9]；一些學(xué)者采用激素處理對(duì)打破上胚軸休眠的方法進(jìn)行了研究[10]，但未開展種皮對(duì)種子休眠的影響、休眠解除過程中胚形態(tài)變化的研究，對(duì)休眠解除過程中種子營養(yǎng)物質(zhì)的變化及其與休眠關(guān)系的研究鮮見報(bào)道。筆者以‘鳳丹’種子為材料，通過對(duì)層積過程中種皮結(jié)構(gòu)、種子大小、種胚形態(tài)以及相應(yīng)生理生化指標(biāo)的測(cè)定，進(jìn)一步探究‘鳳丹’種子的休眠特性，為解除種子休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

‘鳳丹’種子于2018年8月采自南京六合綠宙油用牡丹研究所基地內(nèi)，人工剝出種子后，將其與濕沙按體積比1∶3的比例混合，在10 ℃冷庫中層積2個(gè)月，胚根突破種皮后，再在5 ℃冷庫中層積至上胚軸露出床面。隨機(jī)數(shù)取40粒以上層積0 d(Ⅰ階段)、層積30 d(Ⅱ階段)、胚根剛突破種皮(Ⅲ階段，層積45 d)、胚根伸長1～3 cm(Ⅳ階段，層積60 d)、5%的種子上胚軸露出床面(Ⅴ階段，層積130 d)等5個(gè)階段的種子，清水洗凈后做好標(biāo)記，放入-80 ℃冰箱保存待用。

1.2 種子吸水特性研究

隨機(jī)數(shù)取30粒自然晾干的種子(含水率在10%左右)，重復(fù)3次，稱質(zhì)量(M0)后將其置于燒杯中浸種，每8 h 取出種子，用吸水紙吸干表面水分，再次稱質(zhì)量(M1)，直至種子質(zhì)量不再增加為止。參照文獻(xiàn)[10]計(jì)算種子的吸水率，并繪制吸水曲線。

1.3 層積過程中種子大小及種胚形態(tài)觀察

隨機(jī)數(shù)取上述5個(gè)層積階段的種子各30粒，重復(fù)3次，用游標(biāo)卡尺分別測(cè)量種子的橫徑和縱徑。縱切種子，露出胚，在體視顯微鏡下觀察種胚形態(tài)的變化，并對(duì)各階段種胚進(jìn)行拍照。

1.4 種皮結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

隨機(jī)數(shù)取干種子和層積30 d的種子各10粒，參照朱莉偉等[12]的方法，借助S-3000掃描電鏡(SEM)對(duì)種臍、合點(diǎn)端、種子中間部位種皮的縱切面進(jìn)行觀察，挑選合適的視野進(jìn)行拍照。

1.5 層積過程中種子生理生化指標(biāo)的測(cè)定

采用索氏提取法[13]測(cè)定粗脂肪含量，具體為：分別從上述5個(gè)不同層積階段的種子中隨機(jī)取30粒，重復(fù)3次，將其切碎后置于-70 ℃超低溫條件下預(yù)凍1 h，然后置于真空冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥至恒質(zhì)量(干燥條件：真空度7.2～8.0 Pa，冷凝溫度-45 ℃以下)，將種子研磨成粉末，稱取3g樣品置于脫脂濾紙上(已于105 ℃下烘至恒質(zhì)量，質(zhì)量為M0)，將其包裹嚴(yán)密后再次稱質(zhì)量(M1)，在研缽中將其碾碎；以石油醚為浸提液，在65 ℃的水浴鍋中反復(fù)抽提24 h；取出浸提后濾紙包并放入通風(fēng)櫥，待石油醚揮發(fā)后，在65 ℃的烘箱內(nèi)烘至恒質(zhì)量(M2)。按下式計(jì)算粗脂肪含量：

隨機(jī)數(shù)取供試材料中5個(gè)不同層積階段的種子各30粒，重復(fù)3次，去除種皮后用剪刀將種子剪成小塊，混合后研磨成粉末，稱取0.5 g，采用考馬斯亮藍(lán)-G250法[13]測(cè)定種子中可溶性蛋白的含量，采用蒽酮比色法[13]測(cè)定可溶性糖、淀粉的含量。

分別稱取上述5個(gè)層積階段種子的粉末各0.3 g，重復(fù)3次，采用愈創(chuàng)木酚法[13]測(cè)定過氧化物酶(POD)活性。采用試劑盒法(購于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)測(cè)定酸性磷酸酶(APA)活性[14]。

1.6 數(shù)據(jù)處理

圖表繪制采用Excel 2010和Origin 2017，數(shù)據(jù)處理運(yùn)用SPSS 22進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘鳳丹’種子的吸水特性

‘鳳丹’種子的吸水曲線見圖1。從圖1可知，‘鳳丹’種子的吸水速度較快，浸種72 h 后吸水率已達(dá)50. 6%，隨后達(dá)到吸水平衡。由此可以推論，‘鳳丹’種子的種皮具有較好的透水性，透水性不是限制種子萌發(fā)的重要原因。

圖1 ‘鳳丹’種子的吸水曲線Fig.1 The water absorption curve of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds

2.2 層積過程中種子大小的變化

由層積過程中‘鳳丹’種子大小的變化(表1)可知，層積30 d后(Ⅱ階段)，種子縱徑由8.97 mm顯著增加至10.44 mm，增加了16.4%；橫徑由6.42 mm顯著增加至8.87 mm，增加了15.0%。之后種子大小增加緩慢，直至上胚軸出現(xiàn)的第Ⅴ階段，種子大小基本保持不變。

2.3 層積過程中種胚形態(tài)的變化

5個(gè)不同層積階段的‘鳳丹’種子，縱切后種胚的形態(tài)變化見圖2。層積處理前的成熟種子(Ⅰ階段)，種胚較小(圖2 A)；層積30 d(Ⅱ階段)的種子，兩片子葉略有增大，下胚軸略有增粗(圖2B)；胚根突破種皮即剛萌動(dòng)的種子(Ⅲ階段)時(shí)，子葉進(jìn)一步增大，胚根、下胚軸明顯伸長和增粗(圖2C)；胚根伸長1～3 cm時(shí)(Ⅳ階段)，可觀察到隨著胚根的不斷伸長，子葉繼續(xù)變大，但上胚軸仍然沒有伸長(圖2D)；第Ⅴ階段時(shí)才能夠觀察到上胚軸明顯的伸長(圖2E)。

表1 層積過程中‘鳳丹’種子大小變化

A.成熟種子matured seeds；B.層積30 d seeds stratified for 30 d；C.露白期radicle appeared；D.胚根伸長1～3 cm radicle elongated to 1～3 cm；E.上胚軸伸長且子葉露出The epicotyl is elongated and the cotyledons are exposed outside the seeds.圖2 ‘鳳丹’種子休眠解除不同階段種胚的形態(tài)變化Fig.2 Changes of embryos at different stratification stages of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds

2.4 ‘鳳丹’種皮結(jié)構(gòu)的掃描電鏡觀察

層積處理前后‘鳳丹’種皮剖面超微結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖3可知，種臍、中間部位及合點(diǎn)端3個(gè)部位的種皮結(jié)構(gòu)均無明顯差異，種皮均由3層結(jié)構(gòu)組成，由外而內(nèi)分別是角質(zhì)層(cutile layer)、柵欄層(palisade layer)和薄壁細(xì)胞層(parenchymatous layer)(圖3A、3C、3E)。角質(zhì)層位于最外側(cè)，較薄，表面被一層蠟質(zhì)所覆蓋。與角質(zhì)層緊挨著的是柵欄層，柵欄層占種皮結(jié)構(gòu)絕大部分，由單層長柱狀縱向排列的大石細(xì)胞構(gòu)成，長軸一般與角質(zhì)層相垂直。這些長柱狀細(xì)胞排列整齊緊密，細(xì)胞間雖有一定空隙，但空隙不大(圖3A、3C、3E中白色箭頭所示)；最里面是由很多細(xì)胞堆疊而成的薄壁細(xì)胞層，薄壁細(xì)胞間也有較多的空隙(下圖中紅色箭頭所示)。低溫層積30 d后，角質(zhì)層與柵欄層間出現(xiàn)了明顯的孔洞，使種皮透性進(jìn)一步加大，薄壁細(xì)胞層中各細(xì)胞間的空隙也變得更大(圖3B、3D、3F，圖中黑色箭頭所示)。由此可以推測(cè)，低溫層積可以進(jìn)一步軟化種皮，增加種皮的透性，有利于種子的萌發(fā)。

A.成熟種子種臍部位種皮(300×)the seed coat structure of matured seed at hilar region(300×)；B.處理組種臍部位種皮(80×) the seed coat structure of seeds stratified for 30 d at hilar region(80×)； C.干種子中間部位種皮(300×)the seed coat structure of dried seed at middle part(300×)；D.處理組中間部位種皮(300×) the seed coat structure of seeds stratified for 30 d at middle part(300×)； E.干種子子葉末端種皮(300×)the seed coat structure of dried seed at the bottom of cotyledon(300×)；F.處理組子葉末端種皮(300×) the seed coat structure of seeds stratified for 30 d at the bottom of cotyledon (300×). Cu.角質(zhì)層cuticle player; Pl.柵欄層palisade player; P. 薄壁細(xì)胞層parenchymatous layer。白色箭頭表示柵欄層中的空隙 White arrows indicate that there is a crack in the palisade layer; 紅色箭頭表示薄壁細(xì)胞層中的空隙 Red arrows indicate that there is a crack in the parenchymatous layer; 黑色箭頭表示角質(zhì)層與柵欄層間出現(xiàn)了孔洞Black arrows indicate that there is a hole between the cuticle and palisade layers.圖3 層積處理前后‘鳳丹’種皮剖面結(jié)構(gòu)觀察Fig.3 Observation on the seed coat structures of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ before and after stratification

圖4 休眠解除不同階段‘鳳丹’種子營養(yǎng)物質(zhì)及其酶活性的變化Fig.4 The dynamic changes of nutrient contents and enzyme activity during the different stratification stages of Paeonia ostii ‘Feng Dan’ seeds

2.5 層積過程中種子生理生化指標(biāo)的變化

2.5.1 粗脂肪含量的變化

‘鳳丹’種子含油率一般在30%左右，因此粗脂肪是胚乳中的主要貯藏物質(zhì)，在種子休眠解除與萌發(fā)過程中，在相關(guān)酶的作用下，粗脂肪逐漸被轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)，為種子萌發(fā)提供能量和物質(zhì)基礎(chǔ)。由種子營養(yǎng)物質(zhì)變化情況(圖4A)可以看出，層積過程中，粗脂肪含量一直呈下降的趨勢(shì)：層積處理前粗脂肪含量占種子鮮質(zhì)量的32.3%；層積過程中，粗脂肪含量顯著下降，胚根突破種皮之后(Ⅲ—Ⅳ階段)，下降速度尤其快，這可能是由于胚根伸出后，需要消耗更多的能量物質(zhì)；隨著層積時(shí)間的延長，上胚軸開始伸長，粗脂肪含量下降的速度有所變緩。第Ⅴ階段時(shí)種子中脂肪含量僅為開始時(shí)的11.3%，說明大多數(shù)脂肪物質(zhì)已被消耗用于種子的萌發(fā)、生長。

2.5.2 淀粉含量的變化

種子中的淀粉主要以淀粉粒的形式存在，是植物組織中最普遍的貯藏物質(zhì)，也是種子中最重要的多糖之一。層積過程中，淀粉在淀粉酶的作用下逐漸分解為易吸收的小分子物質(zhì)，并參與萌發(fā)過程中的代謝作用。由圖4A可知，淀粉含量總的來說呈逐漸降低的趨勢(shì)：層積處理前，淀粉含量最高，為26.7 mg/g；至第Ⅲ階段時(shí)，淀粉含量顯著下降至17.8 mg/g；但至第Ⅳ階段時(shí)，淀粉含量有小幅增加，為18.4 mg/g，但與第Ⅲ階段相比差異不顯著。隨著胚根的不斷伸長，上胚軸也開始延伸，淀粉含量又繼續(xù)緩慢下降，第Ⅴ階段時(shí)，達(dá)到最低值14.7 mg/g，與Ⅰ階段相比，下降了45.2%。

2.5.3 可溶性蛋白含量的變化

隨著層積時(shí)間的延長，‘鳳丹’種子中可溶性蛋白的含量也呈逐漸下降的趨勢(shì)(圖4B)，只是開始階段下降的速度較為緩慢，含量由層積處理前的93.4 mg/g下降至87.8 mg/g(Ⅱ階段)，并且二者差異不顯著；但隨后的幾個(gè)階段，可溶性蛋白含量下降速度較快，特別是Ⅱ—Ⅲ階段，下降速度尤其快。這可能是由于胚根伸長需要較多的能量和營養(yǎng)物質(zhì)，并且這些營養(yǎng)物質(zhì)和能量更主要的是由可溶性蛋白的降解來提供；隨后可溶性蛋白含量的下降速度略有減慢，但各階段仍差異顯著。至第Ⅴ階段時(shí)，可溶性蛋白含量下降至整個(gè)層積過程的最低值39.3 mg/g，與第Ⅰ階段的種子相比，下降了57.8%。

2.5.4 可溶性糖含量的變化

層積過程中，‘鳳丹’種子中可溶性糖含量總體呈現(xiàn)下降—上升—下降的變化趨勢(shì)(圖4B)。層積前(第Ⅰ階段)的種子內(nèi)可溶性糖含量為63.4 mg/g；層積30 d后，可溶性糖含量顯著下降至53.8 mg/g；但隨著層積時(shí)間的延長，至Ⅲ階段時(shí)，可溶性糖含量反而增加到65.5 mg/g，并且顯著高于層積前的含量，這可能是由于種子內(nèi)貯藏物質(zhì)如淀粉大量分解轉(zhuǎn)化成可溶性糖的原因；胚根突破種皮后，由于胚根以及胚軸的生長，可溶性糖被大量消耗，含量又開始不斷下降，到Ⅳ階段時(shí)，可溶性糖含量下降到52.5 mg/g，與第Ⅰ階段相比下降了17.3%；隨后由于胚根、子葉以及上胚軸的生長，可溶性糖被繼續(xù)利用，至第V階段時(shí)，含量顯著降低到44.6 mg/g，比第I階段下降了29.8%。

2.5.5 過氧化物酶(POD)活性的變化

以往研究表明，POD在調(diào)控種子休眠和胚根不斷伸長等方面起著重要作用，其活性越高對(duì)種子萌發(fā)的促進(jìn)作用越明顯[14]。圖4C的結(jié)果表明，層積前種子(第I階段)內(nèi)POD酶活性較低；隨著層積處理時(shí)間的延長，POD酶活性呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，至第Ⅲ階段時(shí)，POD酶活性顯著增強(qiáng)，達(dá)到整個(gè)休眠解除過程的最大值52.1 μmol/(min·g)。隨后，POD的活性略有下降，至第Ⅳ階段時(shí)，POD酶活性降低至36.9 μmol/(min·g)；至第V階段時(shí)，POD酶活性又開始緩慢回升，仍顯著低于Ⅲ階段。

2.5.6 酸性磷酸酶(APA)活性的變化

大多數(shù)植物種子中都存在APA，該酶可以促進(jìn)種子中貯藏物質(zhì)如粗脂肪的分解，在其他營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化中也起著重要作用[15-16]，因此該酶的活性會(huì)伴隨著代謝活動(dòng)的進(jìn)行而不斷變化。本研究發(fā)現(xiàn)，層積過程中，APA逐漸被活化，其活性也不斷提高(圖4C)，尤其是在胚根突破種皮之后的伸長階段(Ⅲ—Ⅳ)，APA酶活變化幅度最大，達(dá)到了22.3 nmol/(min·mg)，之后，酶活性增加的速度變慢，在上胚軸伸長的第Ⅴ階段達(dá)到最高值25.1 nmol/(min·mg)。

3 討 論

3.1 ‘鳳丹’種子休眠的原因

種子休眠是指在適宜的條件下具有生活力的種子不能發(fā)芽或延遲發(fā)芽的現(xiàn)象，是植物本身為了適應(yīng)環(huán)境而進(jìn)化的一種生存對(duì)策[17]。研究表明，導(dǎo)致種子休眠的原因有很多，通常與種皮結(jié)構(gòu)、種胚發(fā)育狀況和種子中存在萌發(fā)抑制物等有關(guān)[18-19]。賈書果[20]通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，秤錘樹(Sinojackiaxylocarpa)種子外部結(jié)構(gòu)致密，通透性差是引起秤錘樹種子休眠的主要原因。銀杏(Ginkgobiloba)種子成熟后胚極小，需要經(jīng)過一個(gè)后熟過程才能得以分化生長，是典型的胚后熟休眠類型[21]。洑香香等[22]研究發(fā)現(xiàn)，山茱萸(Cornusofficinalis)種子屬復(fù)雜的多因素綜合休眠，既存在種皮機(jī)械阻礙，還存在胚的形態(tài)休眠。

已有研究表明，角質(zhì)層和柵欄層的存在是阻礙種子吸水的主要原因，并且角質(zhì)層和柵欄層越厚，種皮的透水性越差[23-24]。本研究種皮掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，‘鳳丹’成熟種子的種皮雖然也有角質(zhì)層、柵欄層，但角質(zhì)層僅由一層很薄的蠟質(zhì)所覆蓋，柵欄層、薄壁細(xì)胞層中有較多的空隙。吸水曲線的結(jié)果表明，‘鳳丹’種子在浸種72 h時(shí)，吸水率達(dá)到50.6%，因而種皮對(duì)種子的吸水沒有影響。層積30 d時(shí)，薄壁細(xì)胞層中的空隙變得更大，角質(zhì)層與柵欄層間也出現(xiàn)了明顯的孔洞，這些結(jié)構(gòu)的變化明顯增加了種皮的透性。另外，層積30 d時(shí)種子縱徑、橫徑明顯變大，這些都從另一側(cè)面說明吸水不是造成‘鳳丹’種子休眠的主要原因。

層積過程中胚結(jié)構(gòu)的解剖觀察發(fā)現(xiàn)，層積近2個(gè)月后，胚根才能明顯伸長、變粗，最終突破種皮；‘鳳丹’種子屬于子葉留土型萌發(fā)方式，胚根出現(xiàn)后還需經(jīng)過3個(gè)多月的層積，上胚軸才能表現(xiàn)出較為明顯的伸長并伸出土面。種胚的解剖觀察，從另一角度證明下胚軸休眠和上胚軸休眠是‘鳳丹’種子休眠的兩個(gè)關(guān)鍵階段[25]。

結(jié)合以往的同類研究可以進(jìn)一步明確：‘鳳丹’種子不存在吸水障礙，導(dǎo)致種子休眠的原因主要是存在胚生理后熟和上胚軸休眠現(xiàn)象，這與芍藥屬植物的休眠類型一致[8]。

3.2 營養(yǎng)物質(zhì)代謝及其酶活性對(duì)‘鳳丹’種子萌發(fā)的影響

3.2.1 營養(yǎng)物質(zhì)含量變化對(duì)‘鳳丹’種子萌發(fā)的影響

大量研究表明，種子的休眠與萌發(fā)狀態(tài)取決于種子內(nèi)部能量的動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)胚和胚乳中貯藏的大分子物質(zhì)在各種酶的作用下分解并轉(zhuǎn)化為易被吸收的小分子物質(zhì)時(shí)，種子才會(huì)逐漸從休眠狀態(tài)轉(zhuǎn)化為萌發(fā)狀態(tài)[26-27]。種子內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)主要包括蛋白質(zhì)、糖類和脂肪三大類，蛋白質(zhì)可分解成小分子氨基酸為種子萌發(fā)提供氮源，脂肪和糖類物質(zhì)為種子解除休眠與萌發(fā)階段的呼吸作用提供基礎(chǔ)物質(zhì)[28]。

有研究指出，對(duì)于粗脂肪含量豐富的油料種子，在休眠解除過程中，脂肪在脂肪酶的作用下水解成脂肪酸和甘油，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為糖類物質(zhì)，為種子的萌發(fā)奠定物質(zhì)基礎(chǔ)[29]。‘鳳丹’種子粗脂肪含量豐富，占30%左右，層積過程中，隨著休眠的不斷解除，胚乳內(nèi)的粗脂肪呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，在測(cè)定的最后一個(gè)階段達(dá)到最低值。由于粗脂肪的分解，為胚根的伸長和子葉的萌動(dòng)提供了必要的能量。本研究測(cè)定的幾個(gè)指標(biāo)中，粗脂肪含量下降最多的較第Ⅰ階段下降了88.7%。韓克杰等[30]在研究中同樣發(fā)現(xiàn)，歐洲榛子(Corylusavellana)種子在胚根突破種皮后脂肪開始大量水解，供種子萌發(fā)利用。也有學(xué)者在南方紅豆杉(Taxuschinensis)的研究中也發(fā)現(xiàn)，種子層積過程中粗脂肪含量呈逐漸下降趨勢(shì)，且粗脂肪的分解和利用可能是種子休眠解除的關(guān)鍵原因[31-32]。

淀粉是種子中普遍存在的大分子貯藏物質(zhì)，大多數(shù)淀粉可以在淀粉酶的催化下水解成葡萄糖，為種子萌發(fā)提供能量；而可溶性糖是種子呼吸作用進(jìn)行的最直接的能量物質(zhì)，它可由淀粉、脂肪等貯藏物質(zhì)降解而得到補(bǔ)充[33]。本研究中，‘鳳丹’種子中淀粉含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，說明層積過程中，淀粉不斷被水解為可溶性糖供胚生長利用，這與越南安息香(Styraxtonkinensis，俗稱東京野茉莉)[34]、榧樹(Torreyagrandis)的研究結(jié)果一致[35]。層積初期，可溶性糖含量逐漸減少，這可能是由于此時(shí)種子主要消耗胚乳中貯藏的可溶性糖，隨著層積時(shí)間的延長，胚根開始突破種皮(Ⅲ階段)，雖然需要的可溶性糖更多，但由于伴隨著淀粉和粗脂肪等物質(zhì)分解速度的加快，種子中其他營養(yǎng)物質(zhì)的代謝也會(huì)產(chǎn)生一定量的可溶性糖(淀粉和脂肪等大分子物質(zhì)降解的速度大于呼吸消耗的速度)，致使可溶性糖含量又逐漸增加；隨后由于胚根的伸長，子葉的膨大，上胚軸的伸長，消耗了胚乳內(nèi)更多的營養(yǎng)物質(zhì)，可溶性糖含量又呈現(xiàn)不斷下降的趨勢(shì)。四川牡丹(P.decomposita)在層積過程中可溶性糖含量也呈現(xiàn)下降—上升—下降的變化[36]，這與本研究結(jié)果一致。

種子中貯藏的可溶性蛋白質(zhì)會(huì)經(jīng)過一系列的生理活動(dòng)最終降解為氨基酸，為種子休眠的解除和萌發(fā)提供足夠的氮源，而蛋白質(zhì)含量的高低也可以間接反映出種子內(nèi)部生命活動(dòng)的強(qiáng)弱[37]。本研究中，層積初期可溶性蛋白質(zhì)基本沒有變化，但隨著層積的不斷進(jìn)行，其含量呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢(shì)，這與王家源等[15]和戴萍[33]的研究結(jié)果一致。

‘鳳丹’種子休眠解除過程中，盡管各營養(yǎng)物質(zhì)的含量基本都呈下降的趨勢(shì)，但各物質(zhì)的代謝速度并不一致。如層積初期(Ⅰ—Ⅱ階段)只有可溶性蛋白質(zhì)的含量下降不顯著，但在Ⅱ—Ⅲ階段，該指標(biāo)的下降速度卻非常快；而粗脂肪則是在Ⅲ—Ⅳ階段，下降速度較快。這也從另一個(gè)側(cè)面說明，層積過程中，種子體內(nèi)發(fā)生的生理變化不同，代謝的營養(yǎng)物質(zhì)種類也不相同。

3.2.2 酶活性變化對(duì)‘鳳丹’種子萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)需要完成大量胚乳貯藏物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，而一系列的轉(zhuǎn)化過程中都離不開酶的作用[38]。本研究中，隨著層積時(shí)間的延長，過氧化物酶POD活性呈現(xiàn)波動(dòng)上升的趨勢(shì)，在胚根突破種皮(第Ⅲ階段)時(shí)，參加反應(yīng)的POD酶活性顯著增強(qiáng)，達(dá)到整個(gè)層積過程的最大值，正是由于POD酶活性的增加，才更有助于細(xì)胞分裂、細(xì)胞體積增大以及新細(xì)胞壁形成等過程，幫助種子解除休眠。

酸性磷酸酶APA能夠協(xié)調(diào)種子內(nèi)部物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，在蛋白質(zhì)的合成和脂肪的代謝中發(fā)揮著重要作用[24]。由于‘鳳丹’種子中含有大量的粗脂肪，脂肪的水解離不開APA的催化作用，APA在碳水化合物的轉(zhuǎn)化和蛋白質(zhì)合成中同樣起著重要作用[39]。本研究中，隨著層積作用的進(jìn)行，APA活性呈現(xiàn)不斷增強(qiáng)的趨勢(shì)，且與胚乳中粗脂肪含量的變化趨勢(shì)相吻合，可能正是由于APA在種子休眠解除與萌發(fā)過程中不斷被激活，才促進(jìn)了粗脂肪的降解，為種子的萌發(fā)提供能量[40]。劉亞萍等[41]在研究中也發(fā)現(xiàn)，APA對(duì)胡楊(Populuseuphratica)種子的萌發(fā)具有重要的調(diào)控作用，戴萍[33]、李金霞等[35]在研究中也發(fā)現(xiàn)了相同的規(guī)律。