基于SSR標記的白櫟天然居群遺傳多樣性分析

臧明月， 李 璇， 方炎明

(南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，南方現代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，亞熱帶森林生物多樣性保護國家林業(yè)和草原局重點實驗室，江蘇 南京 210037)

白櫟(Quercusfabri)，屬殼斗科(Fagaceae)櫟屬(Quercus)冬青櫟組植物[1]，是我國特有的珍貴櫟樹，具有較高的生態(tài)與經濟價值。該物種主要分布于南嶺以南、長江流域，如四川、貴州、江西等省區(qū)，一般生長于海拔1 900 m以下丘陵山區(qū)及山坡雜木林中。目前，有關白櫟的研究主要集中于對其果實中淀粉等營養(yǎng)物質含量的測定[2]、葉片形態(tài)特征統(tǒng)計[3]及混交林生態(tài)學效應探究[4-5]等，以指導栽培生產工作。

隨著分子生物學研究方法的不斷發(fā)展，基于不同分子標記手段，在櫟屬植物中已經開展了相當豐富的群體遺傳學研究，但對于白櫟群體遺傳多樣性方面的研究鮮有報道。微衛(wèi)星又稱簡單重復序列(simple sequence repeats, SSR)，是以1～6個核苷酸為單位組成的串聯(lián)重復序列。SSR標記是基于聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction, PCR)的一種分子標記技術，具有多態(tài)性高、重復性好、操作簡便、共顯性等優(yōu)點[6]。

本研究以采自3個白櫟天然居群的樣本為材料，探究適用于該物種的SSR-PCR反應體系，并篩選出合適的微衛(wèi)星引物，在此基礎上進行遺傳多樣性與遺傳結構分析，為其種質資源的合理開發(fā)與保護提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究材料

通過查閱《中國植物志》《中國樹木志》及相關文獻，結合地形、地貌和氣候條件，對于白櫟天然居群在全國范圍內的分布情況有了一定的了解。分別選取江蘇省紫金山(PM)、安徽省黃山(YM)和浙江省天目山(TM)為采樣地點，每個種群隨機選取30株個體，同時保證相鄰個體間的距離不少于30 m，以達到避免個體遺傳背景相同的目的。選取幼嫩、無明顯病蟲害的葉片，采用硅膠顆粒進行保存。同時，對采樣點進行了GPS定位，具體信息見表1。

表1 白櫟種群采樣點信息

1.2 基因組DNA的提取與質量檢測

采用植物基因組試劑盒(天根試劑公司)提取白櫟基因組DNA，取1 μL DNA溶液，用One-drop spectrophotometer(上海采邑生物科技有限公司)測定其純度和濃度，并進一步使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測出合格的DNA樣品，將其置于-20 ℃低溫冰箱內長期保存。

1.3 SSR引物的篩選

選用33對適用于櫟屬植物的SSR引物[7-14]，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，配制成10 μmol/L溶液。選取1個濃度和純度均較高的白櫟基因組DNA樣品，以1 ℃為梯度單位，對所選引物的退火溫度進行優(yōu)化，確定最適退火溫度用于后續(xù)實驗。利用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對引物多態(tài)性進行篩選，根據擴增情況，選出特異性好、多態(tài)性豐富的引物進行毛細管電泳分析檢測。PCR實驗采用20 μL的體系，配比為：DNA模板2 μL、F端及R端引物[生工(Sangon Biotech)生物工程上海(股份)有限公司合成]各0.3 μL、2×TaqPCR MasterMix 10 μL(北京天根生化科技有限公司)、ddH2O 7.4 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，根據不同引物退火溫度退火45 s，72 ℃延伸45 s，其中變性—退火—延伸設置30個循環(huán)，之后72 ℃延伸8 min。

1.4 數據分析

使用Popgen 32[15]計算等位基因數(Na)、有效等位基因數(Ne)、觀察雜合度(Ho)、期望雜合度(He)及Shannon信息指數(I)。使用GenAlEx 6.5軟件[16]分別計算種群間與不同個體間的遺傳距離，在此基礎上進行主成分分析(PCoA)。同時計算遺傳分化指數(FST)，并根據公式Nm=(1-FST)/4FST[17]計算基因流(Nm)。該軟件同時也用于Mantel檢驗，利用10 000次的隨機置換評估經轉換的居群間遺傳分化系數FST/(1-FST)和對數化地理距離矩陣之間的相關性，確定是否存在顯著的地理隔離(isolation by distance，IBD)效應。

利用軟件Arlequin 3.5.2.2[18]進行分子方差分析(AMOVA)推斷白櫟種群遺傳變異的來源與組成比例。采Structure軟件2.1[19]中的貝葉斯聚類算法。其中K值分別設為1～10獨立運行10次，每次不作數迭代(length of burn-in periods)和MCMC(Markov Chain Monte Carlo)均設為100 000。采用ΔK法[20]進行聚類數值設定，使用Structure Harvester[21]計算ΔK的最大值?；贜ei’s標準遺傳距離，采用MEGA 7[22]中的UPGMA法對種群進行系統(tǒng)聚類分析。

2 結果與分析

2.1 退火溫度優(yōu)化與引物篩選

通過對電泳結果的檢測，根據條帶的清晰程度、亮度差異及拖尾情況等(圖1)，最終確定了所有引物的最適退火溫度。33對引物中，6對微衛(wèi)星引物(表2)具有較好的多態(tài)性，其擴增產物大小與目的條帶基本吻合，主帶清晰、擴增效率高，且毛細管電泳檢測結果較好(圖2)，適用于群體分析。

圖1 部分引物退火溫度篩選情況Fig.1 Results of partial primers with screened annealing temperature

表2 6對微衛(wèi)星引物序列及特征

圖2 6個微衛(wèi)星位點的毛細管電泳結果Fig.2 The microsatellite loci fluorescence detection graphs of six primers by capillary electrophoresis

2.2 遺傳多樣性分析

利用6對微衛(wèi)星引物擴增90個個體，共檢測到75個等位基因，不同位點上等位基因變化范圍為7～20，平均值為12.50。其中，位點quru-GA-0M07、MSQ16、ssrQrZAG7、ssrQpZAG110的擴增結果好，提供的遺傳信息較多。觀察雜合度、期望雜合度在6對引物中的變化趨勢略有不同，最高值均來自引物ssrQrZAG7(表3)。各種群的遺傳參數見表4，3個種群等位基因數、有效等位基因數、觀察雜合度、期望雜合度及Shannon信息指數的平均值分別為12.89、7.16、0.70、0.80和2.05。

表3 6個微衛(wèi)星位點的白櫟遺傳多樣性參數

表4 3個白櫟種群的遺傳參數

2.3 遺傳分化

AMOVA分析表明(表5)，群體內部的分子變異率高達97.41%，而群體之間的遺傳變異僅為2.59%。6個微衛(wèi)星位點的遺傳分化系數(Gst)在0.010～0.079，均值為0.030，其中有5個位點的Gst值小于0.05(表3)。從居群角度來看，YM與TM群體間的基因流為12.908，之后依次是YM與PM居群、TM與PM居群，分別為7.103和5.564。Mantel分析表明(圖3)，3個白櫟天然居群間地理隔離效應不顯著(R2=0.984 2，P>0.05)。

表5 白櫟種群的分子變異分析

圖3 白櫟種群間遺傳距離與地理距離的Mantel檢驗Fig.3 Mantel test between genetic distance andgeographic distance among Quercus fabri populations

2.4 群體遺傳結構分析

使用Structure軟件對白櫟群體進行遺傳結構分析表明，在K=2時，ΔK取得最大值(圖4A)，所有個體主要被分為兩組(圖4B)，其中YM與TM的個體聚集在一起，而PM個體有一定的區(qū)分度。

圖4 基于Structure軟件計算的種群遺傳結構Fig.4 The results of genetic structure analyzed by program Structure

UPGMA法聚類分析所得系統(tǒng)發(fā)育樹表明(圖5)，18個來自于PM的個體，形成了獨立的分枝，這些個體在PcoA結果中(圖6)有同樣的表現，而YM與TM的個體區(qū)分度不大。

圖5 基于90個個體間遺傳距離的UPGMA聚類分析結果Fig.5 UPGMA result based on genetic distance among 90 Quercus fabri individuals

圖6 主成分分析結果Fig.6 The result of principal coordinates analysis

3 討 論

SSR-PCR反應體系中任何組分的含量都可直接影響擴增產物的特異性及擴增效率，因此，確定不同物種的反應體系并篩選出合適的引物及其退火溫度是進行后續(xù)群體遺傳研究的基礎。引物退火溫度過高或過低會導致目標DNA片段無法擴增或電泳條帶不純[23]。筆者與魏高明[24]的結果對比發(fā)現， 以引物ssrQrZAG112為例，在通用于麻櫟(Q.acutissima)、栓皮櫟(Q.variabilis)、白櫟和短柄枹櫟(Q.glanduliferavar.brevipetiolata)時，其合適的退火溫度是45 ℃，而當僅用于白櫟的試驗中時，退火溫度為53 ℃則更為合適。合適的退火溫度更有針對性，能提升擴增結果的準確性，有利于后續(xù)對引物多態(tài)性的篩選及群體遺傳研究的進行。

本研究所得3個種群的期望雜合度分別為0.81、0.79、0.81，說明這3個居群的白櫟具有較高的遺傳多樣性且水平十分接近。與其他櫟屬植物如麻櫟(He=0.757)[25], 越南青岡(Q.austrocochinchinensis,He=0.706)[26], 北美紅櫟(Q.rubra,He=0.760)[27]和 遼東櫟(Q.liaotungensis,He=0.754)[28]相比，結果略顯偏高，這一點與Xu等[29]的結論最為接近。后續(xù)工作將進一步擴大采樣的范圍至白櫟在全國的自然分布省區(qū)。此外，樣本的大小同樣會引起位點偏離哈迪-溫伯格平衡。

一般認為，Gst值為0.05～0.15時，群體遺傳分化程度中等。本研究中，白櫟群體間遺傳分化系數為0.030，說明遺傳分化水平較低。AMOVA結果也表明，居群之間的遺傳變異僅為2.59%。白櫟屬于風媒傳粉、異交植物，其花粉質輕、體積小，隨風傳播的距離遠，常通過花粉、種子或樹木個體的人為移動帶入新的基因，從而引起群體基因頻率的變化，這有利于群體間較多的基因交流，從而減弱遺傳漂變的影響，因此可以解釋白櫟群體間的變異較小。

基因流是遷移、繁殖、種群滅絕、種群重建等綜合作用的結果，代表了遺傳信息交換的程度[30]。所檢測到的基因流越強，表示不同種群間的遺傳信息交流越豐富。為了更好地理解不同位點的遺傳分化情況及種群間的遺傳多樣性等，Nei[31]首次確定了遺傳距離的概念。YM與TM群體間的基因流顯著高于PM群體與二者之間的交流水平，說明來自YM和TM的白櫟個體間有最頻繁的基因交流，使其遺傳差異縮小。Structure結果無法有效區(qū)分YM和TM兩個群體的個體，Mantel檢驗發(fā)現，居群間地理隔離效應不顯著，說明居群間的基因交流在一定程度上未受地形等因素限制，遺傳分化水平較低。本研究的樣點數較少，后續(xù)研究應進一步擴大采樣的范圍，增加居群的數量。

基于個體間的不同遺傳距離，筆者分別根據PcoA、貝葉斯聚類分析及UPGMA法聚類分析，所得結果均表明，PM居群的個體具有一定特異性，與其他居群相比，有不同的血統(tǒng)，遺傳差異更大。這些種間差異引起的原因可能是具有不同的譜系或者不同的生境導致的隔離，但是具體的原因需要結合更多的種群與其他分子標記來進一步研究。

群體遺傳結構很大程度上受人為活動的影響，如對次生林分的改造行為[32]，筆者采樣的林分多屬于次生林，林分生長過程中的不同環(huán)節(jié)，如交配、繁殖、地理分布范圍改變及遺傳交流等都會改變群體遺傳結構[33]。白櫟是我國主要的珍貴栽培樹種，對適用于該物種微衛(wèi)星引物的篩選及天然居群遺傳參數及結構等的研究，最終是為了保護白櫟天然居群，提高遺傳多樣性，減少其遭受不科學的開發(fā)利用。針對白櫟的遺傳變異大多來源于群體內部這一特征，應重視對群體內不同類型個體的保存，以原地保護為主，減少對天然居群內部環(huán)境的干擾與破壞。根據白櫟3個居群的遺傳多樣性水平基本一致這一結論，還可構建白櫟的種質資源庫，進一步對白櫟的種源進行遺傳改良，以保護該物種的遺傳多樣性，提升進化的潛力。