青錢柳嫁接愈合過程中砧穗生理特性及其與親和性的關(guān)系

李 娜，朱培林，豐 采，溫敏學，方升佐，尚旭嵐*

(1.南京林業(yè)大學林學院，南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037；2.江西省林業(yè)科學院，江西 南昌 330032；3. 江西省益森實業(yè)有限公司，江西 宜春 336000)

青錢柳(Cyclocaryapaliurus)，又名麻柳、一串錢、金錢柳，系胡桃科(Juglandaceae)青錢柳屬，是我國特有的單種屬植物[1]。青錢柳是一種藥食同源的植物資源，長期以來民間沖泡其葉片作茶飲[2]。研究發(fā)現(xiàn)青錢柳葉含大量生物活性物質(zhì)，有降血糖、降血脂、降血壓、抗氧化等藥用價值，具有良好的開發(fā)利用前景[3-6]。但青錢柳雌雄異型異熟的開花特性，造成種子飽滿度低、種子發(fā)育差，并具有深休眠特性，扦插繁殖成活率低，難以滿足大量人工栽培的種苗需求[7]。嫁接技術(shù)在植物優(yōu)良性狀保持和快速擴繁等方面具有重要的應(yīng)用價值[8]，生產(chǎn)上常采用同種作為砧木，但青錢柳本砧培育時間長、經(jīng)濟成本高，選擇與青錢柳具有高親和性和低經(jīng)濟成本的異種植物作為砧木極有必要。已有研究表明，嫁接后接穗和砧木營養(yǎng)貯藏物質(zhì)、防御酶活性以及酚類物質(zhì)含量等的生理變化，在一定程度上能夠反映嫁接親和性強弱[9-11]。同時，嚴毅[12]和石雪暉等[13]研究發(fā)現(xiàn)，砧穗的營養(yǎng)物質(zhì)和酶活性的差值絕對值的大小，與砧穗的生理適應(yīng)程度有關(guān)，可以作為砧穗組合親和性的判斷指標。目前張燕等[14]已探討青錢柳不同砧穗組合和嫁接方法對嫁接成活率的影響，但至今對青錢柳嫁接愈合過程中的生理特性變化與親和性關(guān)系的研究尚鮮見報道。因此，筆者以胡桃科的楓楊屬、山核桃屬和青錢柳屬3個樹種為砧木進行青錢柳嫁接，通過比較不同嫁接組合接穗和砧木生理指標的差異，探討生理特性與嫁接成活的關(guān)系，為青錢柳砧穗嫁接親和性的早期預測和砧木選擇奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗地概況

以南京林業(yè)大學青錢柳種質(zhì)資源庫多年生青錢柳為采穗母樹，選取1年生健壯的枝條作為接穗材料，以2年生青錢柳、楓楊(Pterocaryastenoptera)和薄殼山核桃(Caryaillinoinensis)實生容器苗為砧木，于2018年2月在南京林業(yè)大學白馬教學科研基地(119°09′E，31°35′N)進行嫁接試驗?；匚挥诮K省南京市溧水區(qū)白馬鎮(zhèn)，屬于北亞熱帶向中亞熱帶的過渡區(qū)，年均氣溫15.4 ℃，全年無霜期237 d，年均日照時間2 240 h，年均降雨量1 087.4 mm。

1.2 試驗設(shè)計

嫁接試驗于2018年2月下旬進行，采用切接的方法進行嫁接，選取無病蟲害的1年生完全木質(zhì)化枝條為接穗，每個接穗留1個芽，接穗背芽方削成一個長3～5 cm的大斜面，斜面面積超過髓心，削去向芽方的外皮。選直徑為1～2 cm的苗木為砧木，距根頸10～15 cm處截斷，沿木質(zhì)部和韌皮部之間縱切，切口長度與接穗削面相同。將接穗插入砧木切口中，露白0.5 cm，最后用薄膜條綁扎，芽露在外面。

設(shè)計青錢柳-青錢柳(QQ，對照組)、青錢柳-楓楊(QF)和青錢柳-薄殼山核桃(QB)3種嫁接組合，根據(jù)青錢柳、楓楊和薄殼山核桃現(xiàn)有實生容器苗的數(shù)量，3個組合分別選取嫁接苗110株(QQ)、40株(QF)和45株(QB)，采用完全隨機區(qū)組設(shè)計，3次重復，于70 d時統(tǒng)計不同嫁接組合嫁接成活狀況，以接穗芽萌動作為判斷嫁接成活的標準。同時，每種組合各嫁接200株用于取樣，測定嫁接后0、40 和70 d的相關(guān)生理指標。嫁接當日，每個組合各取5株嫁接苗，截取嫁接處5 cm長莖段，分別剝?nèi)〗铀肱c砧木韌皮，再分別裝袋放入液氮中帶回實驗室，隨后保存在-80 ℃超低溫冰箱中。40 和70 d均選擇接穗芽萌動或已長成新梢的植株進行取樣，其他操作同上。每個組合每次均取3個平行樣。

1.3 測定方法

可溶性糖、可溶性蛋白和淀粉含量和過氧化物酶(POD)活性的測定參照李合生[15]的方法，多酚氧化酶(PPO)活性的測定參照張曉等[16]的方法，單寧含量測定參照韓衛(wèi)娟等[17]的方法。POD和PPO酶活單位U為每min吸光度變化0.01所需酶量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用單因素方差分析方法比較各嫁接組合接穗或砧木不同時期的生理指標和嫁接成活率的差異，并用Duncan’s新復極差法分析處理間的差異顯著性；以獨立樣本t檢驗比較各嫁接組合同一時期接穗和砧木的差異，以Pearson相關(guān)模型分析生理指標和嫁接成活率的關(guān)系。接穗與砧木的差值絕對值=|接穗指標-砧木指標|。數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析均采用SPSS 22.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同嫁接組合嫁接成活率的差異

成活率是判斷砧穗嫁接親和性的主要指標。方差分析結(jié)果表明，不同嫁接組合的嫁接成活率存在顯著差異(P<0.05，圖1)。嫁接后70 d，QQ組合的成活率為53.49%，顯著高于QF和QB組合的成活率，但QF和QB組合間成活率無顯著差異，表明青錢柳本砧嫁接的親和性顯著高于異種嫁接。

QQ代表青錢柳-青錢柳嫁接組合，QF代表青錢柳-楓楊嫁接組合，QB代表青錢柳-薄殼山核桃嫁接組合。下同。不同字母表示同一時間嫁接組合成活率差異顯著(P<0.05)。QQ indicate the grafting combination of C. paliurus and C. paliurus, QF indicate the grafing combination of C. paliurus and P. stenoptera, and QB indicate the grafing combination of C. paliurus and C. illinoinensis. The same below. Different letters indicate the significant difference of survival rates grafting at various grafting combinations at the same time(P<0.05).圖1 不同嫁接組合青錢柳嫁接成活率的差異Fig.1 Variations in the grafting survival rate of C. paliurus at various grafting combinations

2.2 不同嫁接組合接穗和砧木代謝物質(zhì)含量的差異

2.2.1 可溶性糖和可溶性蛋白含量

嫁接后隨著時間的延長，QQ組合接穗與砧木可溶性糖含量呈先降后升的變化規(guī)律，而QF和QB組合砧木可溶性糖含量均呈現(xiàn)上升趨勢(表1)。嫁接后40 d，QQ組合接穗和砧木可溶性糖含量分別比嫁接當天(0 d)降低32.80%和15.87%。QF和QB組合接穗可溶性糖含量的變化幅度小，分別比嫁接當天降低8.38%和4.74%，而砧木可溶性糖含量分別是嫁接當天的109.43%和176.92%。QQ和QB組合的接穗與砧木間可溶性糖含量均存在顯著差異(P<0.05)，其接穗與砧木的差值絕對值分別為0.32%和0.55%。嫁按后70 d時，3個嫁接組合中，QB組合的接穗與砧木的可溶性糖含量均最高，分別是QQ組合接穗與砧木的可溶性糖含量的155.45%和166.36%。70 d 時，QQ、QF和QB組合接穗和砧木間可溶性糖含量均不存在顯著差異(表1)。

表1 不同嫁接組合接穗和砧木中可溶性糖和可溶性蛋白含量的差異

嫁接后隨著生長時間的延長，QQ、QF和QB組合接穗的可溶性蛋白含量均呈現(xiàn)上升趨勢，而3個組合砧木的可溶性蛋白含量均先升后降(表1)。嫁接后40 d，3個組合接穗和砧木的可溶性蛋白含量均較嫁接當日有顯著升高，QQ組合砧木的可溶性蛋白含量升高幅度最大，為42.29%，而QF組合砧木的可溶性蛋白含量比嫁接當天僅升高29.77%。QQ組合接穗與砧木間可溶性蛋白含量存在顯著差異(P<0.05)，其差值絕對值為0.98%。70 d時，QQ組合砧木的可溶性蛋白含量較40 d時顯著降低，而3個組合接穗的可溶性蛋白含量在兩個時段變化不顯著。70 d時，QQ組合砧穗的差值絕對值為40 d時的2.04%，而QF組合則比40 d時升高了400%。

2.2.2 淀粉和單寧含量

嫁接后隨著生長時間的延長，QQ組合接穗與砧木淀粉含量均呈先降后升趨勢，QF和QB組合砧木的淀粉含量也表現(xiàn)為先降后升趨勢，但兩種組合接穗的淀粉含量則表現(xiàn)為上升趨勢(表2)。40 d時，QQ組合接穗與砧木淀粉含量分別比嫁接當天(0 d)降低24.46%和25.90%，QF和QB組合砧木的淀粉含量變化幅度較小，分別比嫁接當天降低3.68%和12.76%，而接穗的淀粉含量分別比嫁接當天升高了10.07%和27.34%。40 d時，3個組合中僅QB砧穗間淀粉含量存在顯著差異(P<0.05)，差值絕對值達0.35%，而QQ組合砧穗淀粉含量的差值絕對值僅為0.02%。70 d時，QQ、QF和QB組合的接穗與砧木間淀粉含量均存在顯著差異(P<0.05)，砧穗淀粉含量的差值絕對值分別為0.71%、0.62%和1.70%，均比40 d砧穗差值有所升高。

表2 不同嫁接組合接穗和砧木中淀粉和單寧含量的差異

嫁接后隨著生長時間的延長，QQ、QF和QB組合接穗與砧木的單寧含量均表現(xiàn)為先升后降趨勢(表2)。40 d時，3個組合接穗和砧木的單寧含量均較嫁接當日有顯著升高，QB組合的砧木與接穗的單寧含量分別比嫁接當天升高100%和80.86%，而QQ組合的變化幅度最小，僅比嫁接當天升高31.25%和36.97%。40 d時，QB組合的接穗與砧木間單寧含量存在顯著差異(P<0.05)，差值絕對值為0.67%。70 d時，QB組合砧木的單寧含量最高，為QQ組合砧木的1.55倍。70 d時，QF組合接穗與砧木間單寧含量存在顯著差異(P<0.05)，其砧穗差值絕對值為0.44%，較40 d升高了340%，而QQ砧穗間單寧含量的差值絕對值最小，較40 d時僅提高了25%。

2.3 不同嫁接組合接穗和砧木氧化酶活性的差異

嫁接后隨著生長時間的延長，QQ、QF和QB組合接穗與砧木的POD活性均先升后降(表3)。40 d時，QQ組合接穗和砧木的POD活性最高，分別是嫁接當天的309.34%和480.22%，QB組合接穗和砧木的POD活性變化幅度最小，分別是嫁接當天的180.77%和116.06%。40 d時，QQ、QF和QB組合接穗與砧木間POD活性均存在顯著差異(P<0.05)，砧穗POD活性差值絕對值分別為62.20、31.30 和74.40 U/g。70 d時，3個嫁接組合砧穗POD活性的差值絕對值相較40 d時小，分別降低到3.30、7.90和19.60 U/g，其中，QF和QB組合接穗與砧木間POD活性存在顯著差異(P<0.05)。

嫁接后隨著生長時間的延長，QQ組合接穗與砧木的PPO活性先降后升，QF和QB組合接穗與砧木的PPO活性在嫁接愈合過程中持續(xù)升高(表3)。40 d時，QQ 組合接穗和砧木的PPO活性均最低，與嫁接當天相較，分別降低34.12%和25.59%，而QB組合接穗和砧木的PPO活性與嫁接當天相較分別升高63.03%和88.26%。40 d時，QQ、QF和QB組合砧穗PPO活性的差值絕對值分別為0.90、3.00和4.45 U/g，僅QB組合接穗與砧木間PPO活性存在顯著差異(P<0.05)。70 d時，QQ組合接穗和砧木的PPO活性變幅最大，比40 d時分別升高146.04%和79.62%，而QF組合接穗和砧木PPO活性變幅較小，較40 d時分別升高16.49%和25.78%。70 d時，QQ、QF和QB組合砧穗間PPO活性差異均不顯著。

表3 不同嫁接組合接穗和砧木中POD和PPO活性的差異

2.4 不同砧穗組合成活率與生理指標的關(guān)系

由嫁接成活率與不同時期接穗、砧木生理指標的相關(guān)性分析(表4)可知，同一時期，接穗和砧木的生理指標與嫁接成活率的相關(guān)性一致，但不同時期，接穗和砧木的生理指標與嫁接成活率的相關(guān)性存在一定差異。嫁接后40 d，接穗和砧木的可溶性糖、淀粉和單寧含量及PPO活性均與嫁接成活率顯著負相關(guān)(P<0.05)，POD活性與嫁接成活率顯著正相關(guān)(P<0.05)；嫁接70 d后，接穗和砧木中的可溶性糖和單寧含量及PPO活性與嫁接成活率顯著負相關(guān)(P<0.05)，而接穗POD活性與嫁接成活率顯著正相關(guān)(P<0.05)。

為了綜合說明不同時期嫁接體代謝物質(zhì)含量及氧化酶活性與嫁接成活率的關(guān)系，分別以嫁接40和70 d的接穗與砧木的代謝物質(zhì)及氧化酶活性的差值絕對值與嫁接成活率進行了相關(guān)分析，結(jié)果表明，40 d時接穗與砧木的PPO活性差值絕對值與嫁接成活率顯著負相關(guān)(P<0.05)；而70 d時接穗與砧木的POD活性差值絕對值與嫁接成活率顯著負相關(guān)(P<0.05，表4)。

表4 嫁接成活率與不同時期接穗、砧木生理指標的相關(guān)性分析(n=9)

3 討 論

3.1 嫁接成活率

親和嫁接是指砧木和接穗可以完全或部分愈合成為共生體，并能長期生長和結(jié)實，砧木和接穗在分類學上關(guān)系越近，其嫁接親和性越好[18]。有研究表明，楓楊屬與青錢柳屬的親緣關(guān)系相對較近，山核桃屬與青錢柳屬的親緣關(guān)系較遠[19-20]。本研究中，QQ組合嫁接70 d時的成活率為53.49%，顯著高于QF和QB組合的成活率(P<0.05)；QF組合成活率較QB組合高7.35%，這可能是由于青錢柳與楓楊的親緣關(guān)系較之與薄殼山核桃的近，因此其親和性在嫁接早期表現(xiàn)得略強。但隨著時間的延長，以楓楊和薄殼山核桃為砧木嫁接的青錢柳均表現(xiàn)長勢逐漸衰弱干枯等后期不親和現(xiàn)象，嫁接300 d時成活率均為0。而對本砧嫁接組合的觀察發(fā)現(xiàn)，70 d時砧穗已完全愈合，接穗已有2～3片復葉完全展開，新梢生長旺盛，嫁接300 d時成活率僅略有降低(為50.87%)。

3.2 代謝物質(zhì)

植物的生長發(fā)育是植物體各種代謝活動的綜合體現(xiàn)，通過早期的生理變化可預測未來的生長表現(xiàn)。

在嫁接愈合過程中，不同的階段會產(chǎn)生相應(yīng)的生理響應(yīng)調(diào)節(jié)接口的分化和愈合，以維持植物正常生長[21-22]。很多研究表明，嫁接愈合初期不僅需要碳水化合物作為信號物質(zhì)啟動砧穗間物質(zhì)交流，還需要消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì)為新組織的構(gòu)建提供足夠的能量[23-24]，王瑞等[25]對油茶嫁接愈合過程的研究發(fā)現(xiàn)，在輸導組織分化前砧穗中的可溶性糖含量均呈下降趨勢。本研究結(jié)果表明，QQ組合砧木和接穗的可溶性糖和淀粉含量隨時間均表現(xiàn)為先降低后升高，而QF和QB組合砧木的可溶性糖和淀粉含量卻呈現(xiàn)持續(xù)升高，這說明嫁接愈合更快更好的QQ組合其可溶性糖和淀粉能被順利運輸，并被植物消耗分解，因此表現(xiàn)為初期降低；而不親和的嫁接組合其營養(yǎng)物質(zhì)運輸受阻，在結(jié)合部積累，則表現(xiàn)為升高[26-27]。相關(guān)性分析結(jié)果也表明，40和70 d時接穗、砧木的可溶性糖和淀粉含量與嫁接成活率呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，因此，可溶性糖和淀粉含量的變化可用于青錢柳早期嫁接親和性的預測?？扇苄缘鞍鬃鳛闋I養(yǎng)物質(zhì)，在青錢柳嫁接愈合過程中與成活率未見顯著相關(guān)性，但本研究中3個組合的砧木可溶性蛋白含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，這與孫華麗等[28]和魏菊等[29]的研究結(jié)果一致。

單寧是一種多酚類化合物，通過影響IAA合成及運輸，進而影響形成層發(fā)育和維管束分化[30]，蘇文川[31]認為單寧與隔離層的形成有關(guān)，嫁接體內(nèi)單寧含量較高致使隔離層擴增，阻礙砧穗間水分養(yǎng)料及信號分子的交流。Usenik等[32]的研究表明，嫁接口上下積累較多酚類物質(zhì)不利于砧穗愈合。本試驗中3個嫁接組合接穗和砧木的單寧含量隨時間均表現(xiàn)為先升后降，這是由于植物受到傷害時，其體內(nèi)單寧大量積累，隨著嫁接體漸漸愈合，單寧含量逐步下降[31]。通過比較3個組合接穗與砧木的單寧含量可以發(fā)現(xiàn)，QB組合均最高，而QQ組合均最低，這與各組合嫁接成活率正好相反。相關(guān)分析結(jié)果也表明，40和70 d時接穗、砧木的單寧含量與嫁接成活率呈負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，因此，單寧含量的變化也可作為青錢柳早期嫁接親和性鑒定的指標。

3.3 氧化酶活性

POD在嫁接愈合過程中不僅是非生物脅迫的應(yīng)激產(chǎn)物，同時可以沉積木質(zhì)素，促進維管組織的木質(zhì)化[33-34]。因此，嫁接初期植物體常表現(xiàn)為POD活性增加，以抵御因嫁接創(chuàng)傷產(chǎn)生的過氧化氫，從而促進傷口愈合[35-36]，之后POD還會參與嫁接體細胞中的木質(zhì)素合成催化木質(zhì)素單體脫氫聚合反應(yīng)[37-38]。嚴毅[12]研究還發(fā)現(xiàn)，葡萄柚嫁接砧穗愈傷組織POD、PPO等酶的活性差值絕對值越接近，愈合越好。楊瑞[39]也發(fā)現(xiàn)，葡萄砧穗葉片中的POD、PPO活性差值絕對值越小，嫁接親和力就越強。本研究中QQ、QF和QB組合接穗與砧木POD活性均表現(xiàn)為先升后降，這與魏菊等[29]的研究結(jié)果一致。其中，QQ組合接穗的POD活性在兩個時段均高于其他兩個組合，70 d時QQ組合接穗與砧木的POD活性差值絕對值最小。相關(guān)性分析結(jié)果表明，嫁接后40 d，砧木和接穗的POD活性與嫁接成活率均呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，70 d時，接穗的POD活性與嫁接成活率呈正相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，70 d時接穗與砧木的POD活性差值絕對值與嫁接成活率則呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，因此，砧穗POD活性的變化以及70 d時砧穗的絕對差值可作為青錢柳嫁接親和性鑒定的早期預選指標。PPO廣泛存在于植物組織中，通過形成醌類化合物構(gòu)成保護性屏障而使細胞免受病菌的侵害，同時，PPO也參與木質(zhì)素的形成[40]。嫁接愈合初期，PPO將砧穗接合部的酚類氧化成活性醌，醌聚集形成黑色和褐色的隔離層；有研究表明，嫁接后PPO活性一般為先上升后下降[29,41]，通常在不親和嫁接組合中PPO活性高且持續(xù)時間長[42-43]。本研究中，QF和QB組合接穗與砧木的PPO活性在嫁接愈合過程中持續(xù)升高，這與兩個組合嫁接后單寧含量一直保持較高水平相一致。而QQ組合PPO活性在40 d時降低而后再上升，這可能是由于本砧組合嫁接40 d時砧穗間隔離層消失，已進入接穗和砧木愈傷組織形成時期，故此時PPO活性表現(xiàn)為降低，這與其較低的單寧含量表現(xiàn)一致。隨著QQ組合愈傷組織的分裂、增殖和連接，砧穗之間愈傷組織會形成維管束橋，而木質(zhì)素是嫁接口維管組織分化的前提[44]，PPO參與木質(zhì)素的形成，故本砧嫁接70 d時PPO活性反而高于40 d。相關(guān)分析結(jié)果表明，整個嫁接愈合過程，砧穗的PPO活性與嫁接成活率均呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P<0.05)，嫁接40 d時接穗與砧木的PPO活性差值絕對值與嫁接成活率則呈顯著負相關(guān)關(guān)系(P< 0.05)。因此，也可把砧穗PPO活性的變化和40 d時砧穗PPO活性的絕對差值作為青錢柳嫁接親和性鑒定的早期預選指標。

結(jié)合嫁接成活率和嫁接愈合過程中砧穗生理特性可以得出，以楓楊和薄殼山核桃為砧木嫁接青錢柳的親和性較差，表現(xiàn)為可溶性糖和淀粉易積累在接合部、POD活性低、單寧含量和PPO活性高等特點，觀察也發(fā)現(xiàn)，以這兩個樹種為砧木嫁接的青錢柳苗木均出現(xiàn)后期不親和的現(xiàn)象。綜上可知，青錢柳本砧嫁接的親和性顯著高于異種嫁接，在嫁接愈合過程中，可溶性糖、淀粉、單寧含量、POD活性、PPO活性以及POD和PPO活性絕對差值可以作為其早期評價砧木與接穗嫁接親和性的生理指標。