林木與病原菌分子互作機(jī)制研究進(jìn)展

田呈明，王笑連， 余 璐，韓 珠

(北京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，省部共建森林培育與保護(hù)教育部重點實驗室，北京 100083)

自植物出現(xiàn)在陸地上以來，微生物便作為重要的選擇壓力參與塑造植物的進(jìn)化。對于植物-病原微生物來說，二者更是處于長期的“軍備競賽”狀態(tài)，植物通過激活免疫系統(tǒng)來抑制和防衛(wèi)病原菌，病原菌也不斷發(fā)展出新的“武器”去反抑制或躲避植物的防衛(wèi)反應(yīng)。因此，植物-病原菌互相的選擇壓力也構(gòu)成了所謂的植物-病原菌互作體系?；诨?qū)驅(qū)W說，早期的研究主要集中在植物抗病基因以及病原菌致病基因功能方面，不斷揭示植物與病原菌互作過程中的關(guān)鍵分子及其信號通路，促進(jìn)植物免疫與病原菌致病機(jī)理的研究越來越深入與清晰。進(jìn)入21世紀(jì)以來，生物信息學(xué)及基因組學(xué)手段，VIGS/HIGS與CRISPR/Cas9等技術(shù)的不斷革新和突破，為傳統(tǒng)分子操作困難生物的互作研究提供了強大的工具，推進(jìn)植物-病原菌互作的分子機(jī)制研究進(jìn)入快速發(fā)展的黃金時期。與此同時，木本植物與病原菌的互作研究也逐漸發(fā)展起來，并不斷有新的理論、新的方法和新的突破涌現(xiàn)。尤其從病原菌基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析、致病關(guān)鍵基因篩選與功能鑒定、效應(yīng)蛋白作用機(jī)制、致病信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝產(chǎn)物等方面揭示病原菌的致病機(jī)制，進(jìn)而探索林木免疫受體作用機(jī)制、免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫與生長平衡機(jī)制、抗病基因的分離鑒定、RNAi (RNA interference)以及分子抗病育種等。筆者從植物-病原菌分子互作的現(xiàn)狀出發(fā)，綜述了國內(nèi)外林木-病原菌分子互作機(jī)制研究的熱點，并提出未來的發(fā)展趨勢。

1 植物與病原菌互作研究的基本問題

植物與病原菌互作機(jī)制的研究非常廣泛，尤其是真菌、細(xì)菌和卵菌等[1-3]病原菌與寄主植物互作研究已發(fā)展出許多模型和理論，闡釋了植物-微生物互作過程中，植物如何通過免疫受體識別病原微生物進(jìn)而誘發(fā)寄主的抗病反應(yīng)，以及病原微生物利用效應(yīng)蛋白來抑制寄主免疫反應(yīng)以成功侵染寄主的分子機(jī)制(圖1)，逐步形成了新的植物-病原“分子互作”的概念[4]。

植物免疫機(jī)制研究的最終目的是應(yīng)用于分子抗病育種。激活植物的免疫系統(tǒng)主要通過模式識別受體(pattern recognition receptors, PRRs)和抗病蛋白(resistance protein, R)等免疫受體完成。PRRs可直接識別病原菌分泌到胞外的病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns, PAMPs)或質(zhì)外體效應(yīng)蛋白 (apoplastic effector)，進(jìn)而激活病原相關(guān)分子模式觸發(fā)式免疫(PAMPs triggered immunity, PTI)。 最近研究發(fā)現(xiàn)PRRs可通過招募多種多樣的共受體 (coreceptor)來增強識別PAMPs的效率[5-7]。PRRs激發(fā)的PTI作為植物第1層免疫防衛(wèi)反應(yīng)，其強度較低，因此植物為了能夠更加準(zhǔn)確調(diào)控PRRs或PRRs的共受體，通過釋放免疫原多肽物質(zhì)——植物細(xì)胞激素(phytocytokines)來輔助調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，從而使PTI反應(yīng)更加精確[8]。由此可見，雖然植物不具備脊椎動物的獲得性免疫(adaptive immunity)，但其存在著精確高效的先天免疫機(jī)制。例如，一些植物共生菌也會刺激宿主的第1層免疫反應(yīng)，類似于病原菌觸發(fā)的PTI免疫反應(yīng)[9]。當(dāng)共生細(xì)菌存在時，植物會主動降低PRRs表達(dá)水平和MAMPs識別敏感度，從而使共生細(xì)菌達(dá)到適合的生存條件，使其充分發(fā)揮對宿主植物的有益作用[10]。植物抗病蛋白主要通過識別胞內(nèi)效應(yīng)蛋白(cytoplasmic effector)來激活效應(yīng)蛋白觸發(fā)式免疫(effector triggered immunity, ETI)。70%的R蛋白都是受體類蛋白 (nucleotide-binding domain and leucine-rich repeat receptors, NLRs)。除了少部分NLRs可直接與效應(yīng)蛋白結(jié)合來激活免疫反應(yīng)，大量的NLRs通過感知效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)的空間變化(steric alteration)或寄主蛋白翻譯后修飾來激活ETI免疫。不僅PRRs具有共受體蛋白，NLRs同樣能招募共受體(helper NLRs, hNLRs)來幫助識別效應(yīng)蛋白[11-12]，hNLRs還對下游抗病信號的傳遞起到關(guān)鍵作用[13]。同時強力的活性氧迸發(fā)(reactive oxygen species burst)、胼胝體沉積(callose deposition)、超敏壞死(hypersensitive resistance, HR)，以及抗病基因表達(dá)等免疫反應(yīng)均需要PRRs與NLRs的共同激活才能完成[14]。在應(yīng)對病原菌侵入時，植物中PRRs與NLRs分化出相互協(xié)作的關(guān)系，未來如何更好地認(rèn)識免疫受體將是植物抗病育種的重要一環(huán)。

植物免疫系統(tǒng)中關(guān)鍵抗病基因的克隆及其抗性機(jī)制的解析是抗病分子育種的重要基礎(chǔ)。近年來已經(jīng)有小麥抗條銹病(Pucciniastriiformis)基因YrU1[15]、玉米抗紋枯病(Rhizoctoniasolani)基因ZmFBL41[16]、小麥全生育期持久抗性的主效抗病基因Xa4、小麥主效抗赤霉病 (Fusariumgraminearum)基因Fhb7[17]以及多病害抗病基因NPR1[18]等數(shù)百個抗病基因不斷在各種作物中被成功克隆。同時，植物分子抗病育種技術(shù)的發(fā)展也迎來了許多新技術(shù)與突破。諸如根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的Fast-TrACC(fast-treated agrobacterium coculture)技術(shù)可快速獲得穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因植物[19]。碳納米管技術(shù)使得RNA可結(jié)合在納米粒子上轉(zhuǎn)入受體植物材料，從而利用SiRNA沉默目標(biāo)基因[14]。高深寬比碳納米管[high-aspect-ratio carbon nanotube (CNT) nanoparticles]技術(shù)，可將目標(biāo)DNA導(dǎo)入大范圍的植物中去，大大消除了寄主限制[20]。抗病育種領(lǐng)域雖利好消息不斷，但仍面臨廣譜抗病基因抗性的持久性、抗性與產(chǎn)量之間的拮抗性制約。因此，除了尋找新的廣譜抗病基因，協(xié)調(diào)植物生長、適應(yīng)與抗病性的關(guān)系外，利用新型的轉(zhuǎn)基因技術(shù)或者載體介導(dǎo)材料高效穩(wěn)定地獲取目標(biāo)分子改造植株，是未來提高抗病育種快速性、簡便性、革新性和靈活性的重要途徑。

在病原菌中，由于效應(yīng)蛋白既能被R蛋白識別觸發(fā)植物免疫成為無毒基因(avirulence gene)，也能通過修飾躲避識別成為毒性基因(virulence gene)，使得效應(yīng)蛋白成為病原菌致病的關(guān)鍵性武器和植物免疫的靶標(biāo)。通常在獲得微生物基因組或轉(zhuǎn)錄組后，使用生物信息學(xué)方法，根據(jù)效應(yīng)蛋白的一般特征分析篩選獲得候選效應(yīng)蛋白，并通過試驗手段加以證實[21]。效應(yīng)蛋白作用方式主要包括：①抑制或躲避植物PTI或ETI。如LysM效應(yīng)蛋白可通過結(jié)合幾丁質(zhì)寡糖來抑制幾丁質(zhì)觸發(fā)的植物免疫[22-23]。水稻白葉枯病菌(Xanthomonasoryzae)的RXLR效應(yīng)蛋白采用失活同源物來躲避寄主葡聚糖酶抑制劑蛋白的識別從而躲避PTI[24]。②抑制RNAi。病毒能通過產(chǎn)生病毒RNA沉默抑制劑(viral suppressors of RNA silencing，VSRs)來對抗植物的RNA沉默體系，細(xì)菌、真菌和卵菌也廣泛利用效應(yīng)蛋白來抑制寄主植物的RNA沉默體系以促進(jìn)病原菌侵染[25-28]。③操縱植物微生物群落。一些病原菌效應(yīng)蛋白具有植物性毒素和抗菌活性，既影響宿主植物也干擾微生物群落[29]；另外一些效應(yīng)蛋白高度特異，能通過靶向破壞植物相關(guān)進(jìn)程，如通過局部養(yǎng)分剝奪，進(jìn)而影響植物與有益微生物的正?；プ麝P(guān)系；效應(yīng)蛋白也可以招募微生物協(xié)同互作，以抵御競爭性微生物或直接幫助其定殖宿主植物[30]。

圖1 植物-病原菌互作研究各個時期的重要進(jìn)展Fig.1 The timeline of important advancements in the history of plant-pathogen interaction

2 林木與病原菌互作的分子機(jī)制

傳統(tǒng)木本植物病害研究多集中在病原菌鑒定、檢測，病害流行和防治等方面，其與病原菌之間相互作用的分子機(jī)制研究相對較少。然而，隨著林木分子育種的不斷發(fā)展，以及許多新興技術(shù)的出現(xiàn)，近年來有關(guān)林木與病原菌互作分子機(jī)制的研究也取得了較為顯著的進(jìn)步，為林木病害防控提供了理論支撐。林木-病原菌互作的理論基礎(chǔ)以及發(fā)展模式與作物(模式植物)-病原菌互作體系十分類似，但是林木與病原菌的互作機(jī)制方面還有種種壁壘需要突破。

2.1 病原菌侵染寄主的分子機(jī)制

病原菌侵染寄主的分子機(jī)制研究以致病關(guān)鍵基因克隆及其功能調(diào)控網(wǎng)絡(luò)為核心。隨著許多林木病原菌，尤其是膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、大麗輪枝菌(Verticilliumdahliae)、蘋果腐爛病菌(Valsamali或Cytosporamali)以及核盤菌(Sclerotiniasclerotiorum)等病原真菌的遺傳轉(zhuǎn)化體系的成功建立，利用基因敲除與回補、突變體生物學(xué)表型分析等手段探究病原菌侵染結(jié)構(gòu)發(fā)育與致病力相關(guān)的關(guān)鍵基因得以實現(xiàn)，尤其以絲裂原激活蛋白激酶MAPK(mitogen-activated protein kinase)信號通路以及轉(zhuǎn)錄因子的功能研究較為深入。附著胞是許多病原真菌的直接侵入結(jié)構(gòu)，與致病性密切相關(guān)。在楊樹炭疽病菌(C.gloeosporioides)中，敲除致病相關(guān)MAPK(pathogenic MAPKs)Mk1后突變體附著胞完全無法形成，導(dǎo)致致病力的喪失[45]。杉木炭疽病菌(C.gloeosporioides)在敲除細(xì)胞壁完整性相關(guān)的Slt2 MAPK中Mps1及其上游Mck1與Mkk1基因后，各突變體無法形成附著胞，導(dǎo)致致病力喪失[46]。

病原菌可以通過侵染結(jié)構(gòu)直接侵入寄主，也能夠產(chǎn)生水解酶類破壞寄主的組織，以及產(chǎn)生毒素等次生代謝物攻擊宿主植物。例如病原菌Alternariaalternata可以產(chǎn)生寄主專化性毒素——ACT毒素改變寄主細(xì)胞膜通透性，引起電解質(zhì)滲漏，也可作為效應(yīng)蛋白誘導(dǎo)寄主發(fā)生脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量活性氧(reactive oxygen species , ROS)[47]，并最終導(dǎo)致寄主細(xì)胞死亡[48]。這些毒素相關(guān)基因的缺失突變株均不合成ACT毒素，且致病力明顯下降[49-51]。丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(Pseudomonassyringaepv.actinidiae, Psa)通過積累菜豆毒素以減少精氨酸的合成，并最終致獼猴桃葉片出現(xiàn)感病癥狀[52-54]。

在林木病原菌中，對細(xì)胞壁水解酶組成的進(jìn)化與功能研究取得了諸多進(jìn)展。鱷梨炭疽病菌(C.gloeosporioides)果膠酸裂解酶基因pelB的缺失導(dǎo)致突變體果膠裂解酶和果膠酸裂解酶均顯著減少，使其致病性降低[55-56]。楊樹腐爛病菌(Cytosporachrysosperma)的草酸合成相關(guān)基因可能通過改變草酸的合成來影響病原菌的致病性[57]。蘋果腐爛病菌(V.mali)在致病過程中通過分泌多種細(xì)胞壁水解酶來降解寄主細(xì)胞壁，促進(jìn)其侵染。因此學(xué)者們在V.mali中開展了大量水解酶類的研究工作。例如，編碼木聚糖酶基因Endo-β-1、4-xylanaseVmXyl1在V.mali致病過程中顯著上調(diào)表達(dá)，并且蘋果樹枝提取物也可以刺激VmXyl1的表達(dá)，其敲除突變體中Endo-β-1、4-xylanase活性明顯下降，致病性減弱[58]。在敲除VmVeA與VmVelB后，突變體致病性明顯下降。此外，突變體中果膠酶相關(guān)基因表達(dá)明顯下降，但是纖維素酶、半纖維素酶與木質(zhì)酶相關(guān)基因的表達(dá)并沒有受影響。說明VmVeA與VmVelB特異地影響突變體果膠酶產(chǎn)生，從而調(diào)控其致病性[59]。VmPmk1敲除后對于活性氧脅迫與細(xì)胞壁脅迫更加敏感，并且VmPmk1在調(diào)控致病性中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在侵染過程中，許多編碼細(xì)胞壁降解酶基因的表達(dá)量在VmPmk1突變體中明顯下降，包括果膠酶(pectinase genes)、半纖維素酶(hemi-cellulase genes)與纖維素酶(cellulase genes)。利用免疫金沉淀進(jìn)一步證實了VmPmk1突變體在侵染蘋果枝條時對果膠的降解能力出現(xiàn)明顯下降，說明病原真菌細(xì)胞壁降解能力在其致病中的關(guān)鍵作用[60]。V.mali侵染能夠造成韌皮部組織壞死水解，雖然木質(zhì)部也被侵染，但是并沒有腐爛，說明V.mali很可能針對不同部位分泌不同的細(xì)胞壁降解酶。在許多子囊病原菌中，銅離子自由基氧化酶家族是一類重要的木質(zhì)素降解酶家族。但是在Valsamali與V.pyri中沒有出現(xiàn)此類家族基因，且編碼纖維素酶與半纖維素酶的基因數(shù)量與作物病原菌如Magnaportheoryzae、Colletotrichumgraminicola相比出現(xiàn)明顯地減少。因此，V.mali與V.pyri雖然能夠侵染到蘋果和梨樹的木質(zhì)部，但是由于其缺乏相應(yīng)的木質(zhì)素降解酶，導(dǎo)致無法降解木質(zhì)部。同時，由于主要從傷口侵入，其編碼角質(zhì)酶基因的數(shù)量相較于需要直接穿透葉片角質(zhì)層病原菌也明顯下降。V.mali在侵染過程中編碼果膠酶的基因出現(xiàn)了大量的上調(diào)表達(dá)[61]。

2.2 病原菌活性氧解毒的分子機(jī)制

林木的過敏性壞死(hypeisensitive response，HR)可有效抵御腐生菌及活體營養(yǎng)型病原菌定殖，但卻有助于死體營養(yǎng)型真菌的生存。死體營養(yǎng)型病原真菌鏈格孢(A.alternata)進(jìn)化出由多通路協(xié)作實現(xiàn)對寄主ROS的解毒機(jī)制，其中關(guān)鍵的組分包括轉(zhuǎn)錄因子AaAP1，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因AaHOG1、AaSKN7、AaHSK1，及NADPH 氧化酶(Nox)、非核糖體多肽合成酶(NPS) 與谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的多基因級聯(lián)等。在外界刺激下，細(xì)胞質(zhì)膜蛋白Nox產(chǎn)生的H2O2成為ROS 解毒系統(tǒng)的核心。首先，Nox可以通過誘導(dǎo)YAP1半胱氨酸殘基之間二硫鍵的形成從而引起其蛋白構(gòu)相改變，進(jìn)而激活YAP1。另一方面Nox通過磷酸化激活SKN7及SSK1等轉(zhuǎn)錄因子，這些轉(zhuǎn)錄因子繼而調(diào)控HOG1。激活后的YAP1與HOG1在細(xì)胞核內(nèi)調(diào)控大量ROS相關(guān)基因的表達(dá)，實現(xiàn)對寄主ROS的解毒。例如通過誘導(dǎo)鐵載體的生物合成，將鐵匱乏條件下攝取的足量鐵貢獻(xiàn)給抗氧化酶CAT、SOD，進(jìn)而通過酶解機(jī)制介導(dǎo)ROS解毒；或通過GPx3的激活誘導(dǎo)GSH-Px合成，酶解還原“毒性”ROS為無毒羥基化合物。SKN7可能通過與YAP1及其他因子互作繼而參與非鐵載體介導(dǎo)的鐵吸收系統(tǒng)，調(diào)控 CAT、SOD活性解毒ROS，但SKN7和SSK1在ROS解毒方面不依賴HSK1調(diào)控，其具體的上游元件仍未知[62-68]。此外，在楊樹炭疽病菌中，轉(zhuǎn)錄因子CgAp1調(diào)控氧化脅迫應(yīng)答以及侵入過程中ROS的清除，小G蛋白CgCdc42同樣調(diào)控侵入過程中寄主ROS的清除，其均對致病性起了重要調(diào)控作用[69-70]。在杧果炭疽菌(C.gloeosporioides)中，漆酶LAC1在其侵染杧果過程中表達(dá)量提高，促進(jìn)了杧果膠孢炭疽菌的致病力[71]。在黃櫨枯萎病菌(V.dahliae)中，轉(zhuǎn)錄因子VdAtf1、VdYap1以及VdSkn7在活性氮脅迫響應(yīng)中發(fā)揮不同的功能，并且對其微菌核的形成以及致病力發(fā)揮了關(guān)鍵作用[72]。因此，研究林木病原菌對寄主ROS拮抗的相關(guān)基因功能是解析林木病原菌致病機(jī)制的重要途徑之一。

2.3 病原菌效應(yīng)蛋白

病原菌為了成功侵入并定殖于寄主植物，通過分泌效應(yīng)蛋白作為入侵的“武器”。已知的林木病原菌效應(yīng)蛋白的作用機(jī)制主要有：①躲避寄主免疫識別；②調(diào)控寄主植物基因的轉(zhuǎn)錄；③與寄主靶標(biāo)蛋白互作；④對靶向寄主R基因進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)；⑤靶向操縱寄主激素信號；⑥靶向操縱宿主蛋白質(zhì)。效應(yīng)蛋白作為植物病理學(xué)研究熱點之一，近年來在林木病原細(xì)菌、卵菌以及真菌中取得了一些重要進(jìn)展。

近年來Guillen等[73-74]通過楊樹基因組、銹菌基因組和轉(zhuǎn)錄組的生物信息學(xué)分析預(yù)測了楊樹-柵銹菌候選效應(yīng)蛋白，并在細(xì)菌與卵菌侵染擬南芥過程中表達(dá)候選效應(yīng)蛋白，通過觀察其促進(jìn)病原菌侵染與否來判斷效應(yīng)蛋白研究是否作為候選激發(fā)子。劉霞等[75]構(gòu)建了山田膠銹菌(Gymnosporangiumyamadae)和亞洲膠銹菌(G.asiaticm)的吸器獲取技術(shù)體系，并通過轉(zhuǎn)錄組測序預(yù)測了候選效應(yīng)蛋白[76]。橡膠樹白粉病菌(OidiumheveaeB.A.Steinmann)基因組分析預(yù)測了141個經(jīng)典分泌型效應(yīng)蛋白及非經(jīng)典型效應(yīng)蛋白，其中對1個非經(jīng)典型效應(yīng)蛋白OH_0367的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，其在白粉菌侵染階段上調(diào)表達(dá)，并且可以抑制植物水楊酸的合成從而促進(jìn)病原菌致病[77]。綜上所述，效應(yīng)蛋白研究是深入理解植物-病原菌互作的重要切入點，但是相較于有關(guān)卵菌、稻瘟菌、鐮刀菌、黑粉菌等農(nóng)作物病原菌較為深入的研究，林木病原真菌的效應(yīng)蛋白研究還處于起步階段。

3 林木-病原菌基因組與轉(zhuǎn)錄組學(xué)

寄主與病原菌在長期的互作與進(jìn)化過程中，在分子水平形成了復(fù)雜的互作網(wǎng)絡(luò)，單個基因功能的研究不足以全面揭示二者互作的分子機(jī)制?；蚪M與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析對于研究寄主與病原菌的互作關(guān)系十分必要。目前大量樹種，包括巨桉(Eucalyptusgrandis)、橄欖(Oleaeuropaea)、板栗(Castaneamollissima)、黑松(Pinuscontorta)、馬尾松(Pinusmassoniana)、白蠟樹(Fraxinusspp.)、橡膠樹(Heveabrasiliensis)、茶樹(Camelliasinesis)、楊梅(Myricarubra)、山蒼子(Litseacubeba)、毛果楊(Populustrichocarpa)等已經(jīng)完成了全基因組測序[78-79]，為許多重要林木的組學(xué)研究提供了基礎(chǔ)條件。如毛果楊表面受體多基因家族LRR-RLPs與楊樹中小分子未知功能類蛋白SPUFs出現(xiàn)頻繁的關(guān)聯(lián)性，轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)顯示1對LRR-RLPs和SPUFs蛋白在楊樹傷口反應(yīng)中同步表達(dá)，并且兩個基因在啟動子區(qū)域存在約300個氨基酸長度序列的同源性，為楊樹免疫過程中配體-受體成對調(diào)控的研究提供了新的思路[80]。部分林木病原菌的效應(yīng)蛋白被預(yù)測，如對山田膠銹菌和亞州膠銹菌的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，最終分別預(yù)測34個和7個候選效應(yīng)蛋白[81]。挪威云杉[Piceaabies(L.) Karst.]根腐病菌(Heterobasidionparviporum)15個菌株的比較基因組學(xué)分析預(yù)測了病原菌致病相關(guān)基因及候選效應(yīng)蛋白[82]。對楊樹黑斑病發(fā)病區(qū)域的楊樹無性系NL895進(jìn)行混合轉(zhuǎn)錄組測序，分析得到楊樹-黑斑病菌互作相關(guān)的768個病原真菌基因以及54個楊樹基因。這些基因間的關(guān)系可以分為3類：真菌單基因與楊樹多個基因具有關(guān)聯(lián)性；楊樹單基因與真菌多個基因具有關(guān)聯(lián)性；其他相關(guān)關(guān)聯(lián)性較低基因。其中真菌金屬蛋白酶M6-08342與10個楊樹基因具有明顯關(guān)聯(lián)性，并包含兩個抗病相關(guān)基因[83]。對蘋果白粉病菌(Podosphaeraleucotricha)不同侵染時期的葉片中與植物激素相關(guān)的信號通路及植物真菌互作相關(guān)基因的表達(dá)模式進(jìn)行了分析，篩選獲得了部分蘋果抗白粉病的候選基因[84]。在茶白星病侵染茶葉過程中，利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析得到2 180條差異表達(dá)基因，并且鑒定了部分關(guān)鍵上調(diào)表達(dá)基因，如細(xì)胞色素基因P450、Hsp90.1、Hsp70及TT4等基因[85]。基于全基因組序列對核桃細(xì)菌性黑斑病菌(Xanthomonascampestrispv.juglandis)7個菌株進(jìn)行分析，預(yù)測得到520個分泌蛋白，有效地縮小了對其外泌蛋白的研究范圍[86]。馬文博等[87]對引起柑橘黃龍病的韌皮桿菌屬(CandidatusLiberibacter)的36個菌株的基因組進(jìn)行了分析，揭示了各個菌株間的系統(tǒng)發(fā)育以及致病力分化關(guān)系，并且預(yù)測了包括Sec轉(zhuǎn)位通道(Sec translocon)依賴的關(guān)鍵毒力相關(guān)效應(yīng)蛋白?；蚪M與轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究不僅可以分析林木-病原菌互作過程的關(guān)鍵基因，同時還能對同屬間各病原菌致病力分化進(jìn)行分析。

4 林木免疫分子機(jī)制

4.1 林木識別病原菌及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制

林木依賴先天免疫系統(tǒng)識別 “異己”(non-self)，發(fā)起對入侵生物的攻擊指令，包括林木對保守的病原菌相關(guān)分子模式(PAMPs)的識別和林木免疫受體對病原菌效應(yīng)蛋白的識別。

林木通過細(xì)胞表面的PRRs對保守的PAMPs進(jìn)行識別，進(jìn)而激活PTI免疫[88]。不同基因型柑橘對潰瘍病菌(Xanthomonascitrissp. Xcc)的免疫反應(yīng)與病原分子模式(PAMP: flg22)相關(guān)。在Xflg22識別初期，抗病金桔(Fortunellamargarita)中各類防衛(wèi)基因的表達(dá)有顯著性的升高，而感病品種鄧肯葡萄柚(Citrusparadisi)中該類基因沒有被誘導(dǎo)表達(dá)，反映出Xflg22能夠在抗性基因型柑橘品種中啟動強力的PTI[89]。

植物中抗病基因(resistance gene，R gene)編碼的抗病蛋白可識別效應(yīng)蛋白，進(jìn)而激活ETI 免疫。在蘋果基因組中已經(jīng)鑒定出868個R基因，這些基因?qū)υS多病原物有效，如抗蘋果黑星病的Vf基因，它們編碼的蛋白能識別病原效應(yīng)蛋白并激活防御反應(yīng)，表現(xiàn)為感染部位的局部過敏性壞死[90]。

MAPK級聯(lián)在植物先天免疫應(yīng)答不同生物脅迫中發(fā)揮著重要作用，是植物對病原物產(chǎn)生抗性的關(guān)鍵[91]。在林木中關(guān)于MAPK信號途徑的研究雖不如模式植物中的透徹，但是相關(guān)工作也逐漸開展起來。柑橘CsMAP9-like蛋白在柑橘抵抗褐斑病中發(fā)揮了重要作用[92]。白粉菌侵染葡萄后，寄主VvMPK1和VvMPK10基因分別在病原菌侵染12和48 h后顯著上調(diào)表達(dá)，而VvMPK9基因的表達(dá)量隨著侵染時間的延長而增加，推測其與抗病有關(guān)[93-94]。

信號傳遞最終會作用于轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控進(jìn)而調(diào)控一系列轉(zhuǎn)錄過程。植物中的多個轉(zhuǎn)錄因子家族的眾多成員參與了對生物、非生物脅迫的響應(yīng)，目前發(fā)現(xiàn)與植物防衛(wèi)反應(yīng)有關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族主要有ERF蛋白、NAC蛋白、WRKY蛋白和MYB蛋白等[95]。WRKY蛋白作為植物所特有的轉(zhuǎn)錄因子，是近年新發(fā)現(xiàn)的新型鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，與部分病程相關(guān)基因(pathogenesis-related，PR)表達(dá)顯著相關(guān)，在植物-病原菌互作中發(fā)揮重要作用[96-97]。小黑楊PsnWRKY70基因能響應(yīng)葉枯病菌侵染。蘋果MdWRKY33-1、MdWRKY40b基因的表達(dá)與病程相關(guān)基因MdPRs表達(dá)或抗性調(diào)控相關(guān)。湖北海棠MhWRKY1基因在調(diào)節(jié)水楊酸(SA)介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得性抗性(SAR)中起關(guān)鍵作用，導(dǎo)入該基因的蘋果對白粉病的抗性增強[98-100]。柑橘CsBZIP40基因通過調(diào)節(jié)SA途徑影響柑橘抗性，其表達(dá)水平與柑橘潰瘍病的抗性呈正相關(guān)[101]。

泛素連接酶通過泛素化修飾調(diào)控靶蛋白的降解、轉(zhuǎn)運和功能變化，是控制免疫信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要調(diào)控因子。我國學(xué)者發(fā)現(xiàn)了水稻和擬南芥的多個E3泛素連接酶在植物免疫調(diào)控中的功能和作用機(jī)理。在木本植物中，蘋果BTB-BACK結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶蛋白POZ/BTB CONTAINING-PROTEIN 1(MdPOB1) 通過泛素化降解U-box結(jié)構(gòu)域的E3泛素連接酶MdPUB29抑制蘋果對B.dothidea的防御能力，但MdPUB29是蘋果輪紋病抗性的正調(diào)控因子[102-106]。

4.2 林木病程相關(guān)蛋白對病原菌的防御機(jī)制

植物病程相關(guān)蛋白PRs 在健康的植物中不表達(dá)或者表達(dá)量很低，當(dāng)受到病原物或其他刺激后會大量表達(dá)。PR蛋白有17個家族，且常表現(xiàn)為β-1、3-內(nèi)葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等多個家族共同作用，以限制病原菌的生長和蔓延。一些家族如PR-8 家族成員具有溶解酵素活性，直接作用于細(xì)菌；而防御素(PR-12)、抗菌肽(PR-13)、部分脂質(zhì)轉(zhuǎn)移蛋白(PR-14)、PR-1和類甜蛋白PR-5都有廣譜抗細(xì)菌和真菌活性[107]。林木通過引入抗菌肽基因可有效控制病原菌侵入。如將人工合成抗菌肽Shiva A和天蠶抗菌肽Cecropin B基因同時引入錦橙(C.sinensis)，得到的轉(zhuǎn)基因植株對Xanthomonascitrisubsp.citriXcc的抗性顯著提高。黑星病菌(Venturiainaequalis)能誘導(dǎo)蘋果葉片中PR-2、PR-5和PR-8的表達(dá)發(fā)揮抗菌功能[90]。但是目前對PR蛋白在植物抗逆過程中的功能及其調(diào)控機(jī)制的了解還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

4.3 林木次生代謝產(chǎn)物介導(dǎo)的防御反應(yīng)

林木防御反應(yīng)相關(guān)的次生代謝產(chǎn)物植保素(Phytoalexin, PA)能有效地抵御各種生物脅迫。Wang等[108]發(fā)現(xiàn)耐病葡萄柚雜交種Jackson和感病葡萄柚Marsh在次生代謝上存在顯著差異。其中除了萜烯合成酶相關(guān)基因(CiClev10014707，Ciclev10017785)在耐黃龍病的Jackson中下調(diào)表達(dá)外，涉及類萜生物合成的β-丙氨酸合酶(Ciclev10033766、Ciclev10033930、Ciclev10033377)、環(huán)阿屯醇合酶(Ciclev 10010416)和LIJ梨醇C合酶(Ciclev 10031967)均顯著上調(diào)[108]。Zhong等[109]通過數(shù)字基因表達(dá)譜分析比較了接種黃龍病菌13周和26周的碰柑，發(fā)現(xiàn)參與類黃酮、苯丙素、木質(zhì)素、類異戊二烯和生物堿代謝的次生代謝相關(guān)基因的表達(dá)大部分在接種黃龍病菌13周下調(diào)，但大多在接種黃龍病菌26周時上調(diào)。

4.4 林木分子抗病育種研究

目前許多植物抗病研究的重點集中在廣譜抗病基因的鑒定，或者同時聚合多個抗病基因來達(dá)到擴(kuò)展植物抗病譜的范圍。由于林木培育周期長，多基因聚合抗病可能是防止抗病性丟失的重要方向。對于林木抗病育種，林木轉(zhuǎn)基因技術(shù)也提供了良好的解決途徑。在板栗疫病研究中，Charles Maynard團(tuán)隊成功開發(fā)了板栗的轉(zhuǎn)化體系，并且鑒定了多個板栗抗疫病的候選基因[110-111]。板栗轉(zhuǎn)基因植株表達(dá)草酸氧化酶OxO(oxalate oxidase)對板栗疫病具有良好抗性[112-113]。在轉(zhuǎn)基因雜交楊樹表達(dá)OxO可以提高楊樹對病原真菌Septoriamusiva的抗性[114]。隨著Cross kingdom micro RNA與寄主誘導(dǎo)的基因沉默技術(shù)(HIGS)的發(fā)展，為林木的抗病分子研究開拓了一條新的途徑。眾多研究表明HIGS對多種植物病原真菌Fusariumverticillioides、F.graminearum、F.oxysporum，以及Blumeriagraminis、Pucciniatriticina都有著很好的抑制效果[115-117]。在大麗輪枝菌中，VdH1基因缺失后突變體致病性顯著下降，HIGS靶向植物病原真菌關(guān)鍵基因可有效提高棉花對于大麗輪枝菌的抗性[118]。同時棉花可通過miRNA來抑制大麗輪枝菌致病基因的表達(dá)，從而抑制病原菌侵入[119]。毛果楊和毛白楊處于干旱狀態(tài)時miR472上調(diào)表達(dá)，在高鹽分處理的胡楊中下調(diào)表達(dá)，表明miR472可能靶向楊樹NBS-LRR的轉(zhuǎn)錄，從而提高了楊樹抗病能力；同時當(dāng)miR472過表達(dá)后對楊樹腐爛病菌(C.chrysosperma)表現(xiàn)高度抗性[120]。蘋果在抵御葉斑病真菌(Glomerellacingulata或Colletotrichumgloeosporioides)侵染時，Md-miR156ab和Md-miR395分別靶向轉(zhuǎn)錄因子MDWRKyn1和MDWRKY26，從而影響蘋果對葉斑病的抗性[121]。Md-miRln20 通過抑制Md-TN1-GLS的表達(dá)調(diào)控蘋果對G.cingulata的抗病性[122]。當(dāng)然，HIGS技術(shù)還在發(fā)展完善的過程中，例如HIGS的靶標(biāo)位點一般只是目標(biāo)基因的小部分序列，容易造成同源非靶標(biāo)基因的沉默。HIGS有一定的寄主-病原體系限制，不能保證其在各個系統(tǒng)中均有高效的沉默效率，也無法像基因敲除一樣完全阻斷目標(biāo)基因的表達(dá)，而只能抑制其表達(dá)。目前HIGS還沒有應(yīng)用于林木抗病研究中，在林木-病原菌互作體系的應(yīng)用難度或問題還有待探索和解決，但是基于microRNA以及HIGS技術(shù)，其所表現(xiàn)出的簡便性與抗病潛力對于今后的林木分子抗病研究有重要意義。

在木本植物中，利用CRISPR技術(shù)體系的基因組定點編輯研究在楊樹中率先開展。2015年，美國估治亞大學(xué)的Zhou等[123]首次利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，在毛白楊(Populustomentosa)中實現(xiàn)了木質(zhì)素合成關(guān)鍵酶基因的定點編輯。緊接著，國內(nèi)研究人員也實現(xiàn)了CRISPR/Cas9對毛白楊多個靶基因的敲除，并且獲得多基因突變植株[124-125]。此外，國內(nèi)外目前對茶樹[Camelliasinensis(L.) O. Ktze.]、甜橙[Citrussinensis(L.) Osbeck]、蘋果(Maluspumila)也實現(xiàn)了CRISPR/Cas9的靶向敲除突變[126-128]。但在真菌中，由于其同源重組率極低、高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的缺乏、啟動子和有效篩選標(biāo)記的缺乏等原因， CRISPR/Cas9的應(yīng)用還主要集中在酵母、霉菌、稻瘟菌、玉米黑粉菌、尖孢鐮刀菌以及蕈菌等真菌中[129-132]，并且在應(yīng)用過程中出現(xiàn)的脫靶、編輯效率低以及突變體篩選工作量大等問題也亟待解決[133]。

因此，對于林木抗病分子育種還局限在傳統(tǒng)抗病育種領(lǐng)域內(nèi)，對于許多新興方向和技術(shù)的突破和應(yīng)用還十分欠缺，未來如何突破技術(shù)壁壘是推進(jìn)林木抗病分子研究的關(guān)鍵。

5 林木與內(nèi)生真菌、外生真菌互作研究熱點

在自然界中，內(nèi)生真菌及外生真菌如何與林木的免疫系統(tǒng)“和平共處”，其依賴的分子機(jī)制可以幫助人們從免疫水平揭開共生的分子機(jī)制，并為林木-病原菌互作研究提供新的方向或思路。

按照“內(nèi)共生理論”，許多林木內(nèi)生真菌可以產(chǎn)生與其宿主相同或相似的代謝產(chǎn)物。因此，從林木內(nèi)生真菌中篩選和提取有宿主藥理活性的物質(zhì)，許多新型藥物拓展研發(fā)途徑，并成為重要的研究方向[134-135]，也獲得了很多內(nèi)生菌資源[136-138]，并篩選出了能高產(chǎn)紫杉烷類物質(zhì)的菌種[139]。然而大量研究表明內(nèi)生真菌還與林木抗病蟲害相關(guān)。Arnold等[140]研究發(fā)現(xiàn)可可樹(Theobromacacao)接種葉片優(yōu)勢內(nèi)生真菌菌群可有效減少由棕櫚疫霉(Phytophthorapalmivora)引起的危害。袁秀英等[141]開展了美洲黑楊雜種無性系NL-80351楊、美洲黑楊無性系和歐美楊休眠芽、葉片、樹皮和枝條等組織內(nèi)生真菌分離培養(yǎng)和鑒定工作，發(fā)現(xiàn)某些菌株對楊樹爛皮病菌(Cytosporasp.)有一定的拮抗作用。Busby等[142]在控制實驗中發(fā)現(xiàn)接種楊樹葉片內(nèi)生葡萄穗霉(Stachybotryssp.)、深綠木霉(Trichodermaatroviride)、黑細(xì)基格孢(Ulocladiumatrum)和狹截盤多毛孢(Truncatellaangustata)等菌株可增強毛果楊對楊柵銹菌的抗性，其抗病機(jī)制可能與內(nèi)生菌誘導(dǎo)林木抗病相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。

菌根真菌與植物會發(fā)生物種間的基因轉(zhuǎn)移，從而促進(jìn)演化歷程。Wang等[143]對苔蘚MACRO2基因進(jìn)行了沉默及過表達(dá)，揭示了來自菌根類真菌的該基因影響了宿主的表觀修飾與發(fā)育。菌根真菌與植物間基因轉(zhuǎn)移很可能是陸生植物性狀產(chǎn)生與演化的重要因素。在農(nóng)作物與模式植物中，有關(guān)共生菌與植物之間適應(yīng)性的分子機(jī)制，以及植物與病原菌、共生菌的免疫識別差異的機(jī)制均有大量研究[9, 144-145]。林木共生菌的研究主要集中在共生菌的次生代謝產(chǎn)物，及其對植物抗病性、脅迫抗性影響等領(lǐng)域，對于內(nèi)生真菌、外生真菌與林木的分子互作機(jī)制研究還十分匱乏，而外生真菌與林木的互作在對大尺度景觀以及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性等具有很大的研究潛力。因此探索共生真菌與植物、林木之間互作分子機(jī)制，對揭示植物進(jìn)化與適應(yīng)性形成的分子基礎(chǔ)具有重要意義。

6 結(jié) 語

自然界中植物與微生物、病原菌具有極為復(fù)雜的關(guān)系，許多植物-病原菌互作所涉及生理過程的分子機(jī)制尚有待探究。對于植物-微生物或者植物-病原菌的互作理論，普遍接受二者“軍備競賽”的關(guān)系，代表性互作模式都是基于“基因?qū)颉睂W(xué)說、“警戒”假說以及“誘餌”假說不斷發(fā)展而來。例如近年一些科學(xué)家大膽引入中國傳統(tǒng)哲學(xué)思想中的“陰陽”概念，來闡釋二者協(xié)調(diào)發(fā)展而又相生相克的關(guān)系[146]。因此隨著互作機(jī)制研究的不斷深入，理論與假說不斷完善和補充，許多哲學(xué)概念或者社會學(xué)理論也可以與互作模式理論結(jié)合起來。隨著經(jīng)濟(jì)的飛速發(fā)展，生物及生態(tài)領(lǐng)域獲得越來越多的關(guān)注和資源分配。相較于農(nóng)作物領(lǐng)域?qū)τ诮?jīng)濟(jì)的重要性，林業(yè)更偏重于其對于生態(tài)的重要性，相應(yīng)地林業(yè)病害相較于農(nóng)作物病害雖造成較少的經(jīng)濟(jì)損失，但其對于生態(tài)環(huán)境及綠色發(fā)展造成嚴(yán)重及深遠(yuǎn)的影響。筆者對林木-病原菌未來的研究方向展望如下：

1)應(yīng)充分利用CRISPR/Cas 9等基因編輯技術(shù)的快速高效等優(yōu)點，對林木與病原菌互作中的關(guān)鍵基因的功能進(jìn)行解析。

2)目前基因組、轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組的測序和分析手段日趨成熟，組學(xué)大數(shù)據(jù)的深度挖掘是未來林木與病原菌互作組學(xué)研究突破的關(guān)鍵。

3)林木的抗病育種受到其生長周期長、遺傳操作困難等因素的限制，生產(chǎn)上缺少高效的轉(zhuǎn)基因抗病材料，利用HIGS等新技術(shù)和分子操作工具將是解決林木抗病材料分子育種的關(guān)鍵。

林木病理學(xué)研究不僅要跟上植物學(xué)、微生物學(xué)領(lǐng)域互作研究的熱點和前沿，林木-病原菌互作也需要根據(jù)實際需要探索特色研究方向。