大豆細胞核雄性不育基因研究進展

孫小媛，王一帆，王韞慧，藺佳雨，李金紅，丘遠濤，方小龍，孔凡江，李美娜

大豆細胞核雄性不育基因研究進展

孫小媛，王一帆，王韞慧，藺佳雨，李金紅，丘遠濤，方小龍，孔凡江，李美娜

廣州大學生命科學學院，廣州 510006

雄性不育是指植物雄蕊不能正常生長和產(chǎn)生有活力花粉粒的現(xiàn)象。利用雄性不育突變體開展雜交育種工作，是快速提高作物單產(chǎn)的有效途徑。目前，通過雜種制種已大幅度提高了水稻(L.)、玉米(L.)和小麥(L.)等作物的產(chǎn)量。大豆((L.) Merr.)作為自花授粉作物，通過人工去雄生產(chǎn)雜交種子不僅困難而且經(jīng)濟上不可行。由于適用于雜交種生產(chǎn)的不育系資源短缺，目前大豆還沒有實現(xiàn)大規(guī)模雜種優(yōu)勢利用。因此，快速實現(xiàn)大豆雜種優(yōu)勢利用迫切需要鑒定穩(wěn)定的大豆雄性不育系統(tǒng)。本文總結(jié)了大豆細胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)突變體及不育基因研究進展，同時結(jié)合擬南芥()、水稻和玉米中已報道的細胞核雄性不育基因，從反向遺傳學的角度，為大豆核雄性不育基因的鑒定提供依據(jù)。

大豆；細胞核雄性不育；反向遺傳學

大豆((L.) Merr.)原產(chǎn)于中國，是重要的糧食作物和飼用原料。但我國大豆耕種面積逐年縮減、產(chǎn)量增長緩慢，單產(chǎn)水平遠遠低于世界平均水平，無法滿足人們對大豆不斷增長的需求。因此，近年來我國大豆超過85%依賴進口，2019年全國大豆進口量達到8851萬噸，進口國家主要為巴西和美國。因此，快速提高大豆產(chǎn)量已成為目前我國大豆生產(chǎn)中最迫切的任務(wù)。

雜種優(yōu)勢利用是大幅度提高作物單產(chǎn)的有效途徑。利用雜種優(yōu)勢，水稻增產(chǎn)55%，小麥增產(chǎn)25%，大麥(L.)增產(chǎn)11%，谷子()增產(chǎn)68%[1,2]。因雜交植物具有較好的適應性、較強的抗逆性，因此對提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量做出了巨大貢獻。大豆是目前少數(shù)幾個沒有大規(guī)模利用雜種優(yōu)勢的作物之一，其主要原因是適于雜交種生產(chǎn)的不育系資源短缺。

雜交種子的產(chǎn)生需要具有遺傳多樣性的親本異花授粉，因此利用雄性不育和雌性可育的突變體是進行異花授粉、實現(xiàn)大規(guī)模雜交制種的前提。大豆是典型的自花授粉作物，通過人工去雄生產(chǎn)雜交種子不僅困難而且經(jīng)濟上不可行。因此，快速實現(xiàn)大豆雜種優(yōu)勢利用迫切需要在大豆中鑒定穩(wěn)定的雄性不育系統(tǒng)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，雄性不育由細胞核基因或線粒體基因控制，前者被稱為細胞核雄性不育(nuclear male sterility, NMS或genic male sterility, GMS)，后者被稱為細胞質(zhì)雄性不育(cytoplasmic male, CMS)[4,5]。雜交育種技術(shù)中的三系法利用CMS系為母本，以保持系為父本繁殖大量保持不育特性的種子；以CMS系為母本，以恢復系為父本，實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)可育的雜交種子。但三系法也存在缺陷，如恢復系的種質(zhì)資源狹窄、CMS系與恢復系的遺傳多樣性差，限制了CMS系的進一步發(fā)展[6～9]。兩系法利用光溫敏GMS系，如秈稻安農(nóng)S-1[10]，當處于低溫環(huán)境時可育，而在高溫環(huán)境育性轉(zhuǎn)變?yōu)椴挥?，以常?guī)品種作為恢復系，同時改變光溫條件，可實現(xiàn)不育系繁殖和雜交種生產(chǎn)。但隨著研究的深入，兩系法的問題也日益突出，不育系的育性受光照和溫度的影響，隨著繁殖代數(shù)的增加，育性轉(zhuǎn)變的臨界溫度發(fā)生改變，大大增加了繁殖不育系的難度[6～9]。隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，研究人員通過分子生物技術(shù)和基因工程手段，在水稻中通過利用核不育基因、花粉自我降解基因、紅色熒光蛋白篩選標記基因等，獲得轉(zhuǎn)基因保持系，利用該保持系繁殖大量非轉(zhuǎn)基因的雄性不育種子可用于商業(yè)生產(chǎn)[11]。因此在大豆中利用核不育基因并以此構(gòu)建雄性不育系統(tǒng)是快速實現(xiàn)大豆雜種優(yōu)勢利用的重要途徑。

雖然大豆核雄性不育突變體的發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有90多年的歷史，但是目前僅有基因被克隆，其他核不育基因尚未見報道[12]。對大豆核不育基因相關(guān)研究進展進行系統(tǒng)總結(jié)有助于深入認識和了解大豆核不育系統(tǒng)，鑒定并挖掘新的雄性不育基因也有助于開發(fā)穩(wěn)定的可用于大豆雜交種子生產(chǎn)的不育系統(tǒng)。本文對大豆核雄性不育基因的相關(guān)研究進行了綜述，并通過比較擬南芥、水稻和玉米等模式植物中已報道的雄性不育基因，以期為大豆核雄性不育基因的鑒定和研究提供參考。

1 大豆細胞核雄性不育突變體研究進展

1.1 大豆細胞核雄性不育突變體

細胞核雄性不育，其雄性育性大多由細胞核內(nèi)一對隱性基因控制，少數(shù)受顯性基因調(diào)控，符合孟德爾遺傳定律。目前已鑒定出28個大豆細胞核雄性不育突變體，包括雄性和雌性配子都可育的結(jié)構(gòu)型不育、部分雄性不育、雄性和雌性均不育、雄性不育和雌性可育、光敏雄性不育和由單一顯性基因控制的雄性不育(表1)。

是迄今為止在大豆中報道的唯一自然產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)型不育突變體，其花粉育性正常，但胚珠發(fā)育異常，受雙隱性基因和共同調(diào)控。通常帶有外露的花柱和柱頭，花瓣發(fā)育異常，阻止花絲的伸長，導致花藥與柱頭之間距離較遠，阻止自花授粉，因此結(jié)實率較低[13]。是溫度敏感型雄性不育，高溫環(huán)境下雄性生殖力較強[14]，其突變體的花藥外觀各不相同，有的花藥為棕色，較??；花藥通常開裂，退化的小孢子或花粉凝集成塊[15]。和()屬雄性和雌性都不育的突變體，其中是染色體聯(lián)會缺失的突變體，而和是染色體聯(lián)會異常的突變體，這類不育系的花粉和胚珠都敗育[16～20]。

表1 大豆核雄性不育突變體及基因信息

1971年，Brim和Young在大豆中發(fā)現(xiàn)了控制雄性不育性狀的突變體[21]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)雄性不育雌性可育的突變體包括、、、、、、、、和。突變體在第二次減數(shù)分裂末期細胞質(zhì)分裂失敗，結(jié)果產(chǎn)生多核小孢子，最終形成的花粉粒粘附在一起，不能萌發(fā)[22]。和均能進行正常的減數(shù)分裂，形成四分體，但由于絨氈層發(fā)育異常，小孢子隨后退化，最終花藥中沒有產(chǎn)生花粉粒[23,24]。與相似，都是第二次減數(shù)分裂末期后不發(fā)生胞質(zhì)分裂引起的敗育，但花藥略小且偏白色，形成中空小孢子[25]。突變體在花粉發(fā)育過程中絨氈層空泡化，小孢子解體，花粉增大[26]。突變體小孢子母細胞在第二次減數(shù)分裂末期后退化，藥室內(nèi)壁和絨氈層等發(fā)育呈現(xiàn)異常，并且花朵相比其他突變體較小[27]。小孢子的敗育主要由于四分體時期胼胝質(zhì)不解體，結(jié)果沒有產(chǎn)生花粉粒。育性受環(huán)境溫度的影響，和相似，結(jié)果都產(chǎn)生大量的退化花粉粒，但花粉沒有萌發(fā)溝[14,28,29]。而小孢子母細胞在第一次減數(shù)分裂的早前期開始發(fā)生敗育，染色體聯(lián)會異常，結(jié)果產(chǎn)生異常的多分體(polyad)，其雄性育性受隱性基因調(diào)控[30]。

光敏雄性不育系在短日照條件下，小孢子發(fā)育減數(shù)分裂過程中染色體行為異常，最終形成異?；ǚ哿＃瑢е滦坌圆挥齕31]。是目前在大豆中報道的唯一由顯性基因調(diào)控的雄性不育、雌性可育突變體，該突變體的小孢子四分體表現(xiàn)正常，而成熟花粉粒細胞質(zhì)分布不均，發(fā)生皺縮使花粉完全敗育[32]。

以上不育系由于花器官結(jié)構(gòu)異常或大量可育株的存在等問題，很難應用于雜交種生產(chǎn)。目前在優(yōu)勢大豆選育工作中較多使用核不育突變體材料[33]。

1.2 大豆細胞核雄性不育基因定位與克隆

大多數(shù)核不育基因(以下簡稱GMS基因)已被初步定位到大豆染色體上?？刂拼蠖剐坌院痛菩跃挥腉MS突變體中，基因位于11號染色體BARCSOYSSR_11_122-BARCSOYSSR_11_137標記之間，物理距離為～398 kb，包含57個預測基因[34]?；蛭挥?號染色體Satt436-Satt468標記之間，物理距離約為164 kb，包含17個預測基因，該區(qū)域中的基因編碼具有RWP-RK結(jié)構(gòu)域(RKD)的轉(zhuǎn)錄因子，已知RKD轉(zhuǎn)錄因子在雄配子發(fā)生、卵細胞功能控制和細胞分裂中發(fā)揮重要作用[35]，因此該基因可能是的候選基因。位于13號染色體Satt146-Satt030之間[34]，在14號染色體BARCSOYSSR_14_84-BARCSOYSSR_14_109標記之間，在2號染色體Satg001和端粒之間[34]。位于16號染色體分子連鎖群J上的SSR標記Satt132-Satt414之間，與兩個標記的距離分別為7.8 cM和3.4 cM[36]。

在大豆中報道的控制雄性不育雌性可育突變體的候選基因(、、、、、、、、、、和ms)分別定位到大豆的7條不同染色體上[37～39]。其中，和基因定位于13號染色體[38]。基因位于10號染色體Sat_190-Scaa001標記之間，與兩個標記距離分別為6.9和9.0 cM[37]。、、和均定位在2號染色體上[15,38,40]。、、和基因分別接近Satt516、Satt157、Satt542 BARCSOYSSR_ 02_1539和AW186493標記[38,40]。、、和分別位于11、9、7、3號染色體上[15,26,37,38]。ms定位在10號染色體SSR標記BARCSOYSSR_ 10_794-BARCSOYSSR_10_819之間[39]。雖然大豆核雄性不育基因的挖掘與定位已被廣泛研究和報道，但目前僅有基因被克隆。Thu等[12]將位點精細定位到216 kb的區(qū)域，該區(qū)域包含23個基因，通過測序發(fā)現(xiàn)其中第3外顯子有一個堿基插入，導致蛋白編碼提前終止。利用擬南芥同源基因突變體與大豆進行功能互補驗證，證明編碼大豆MS4蛋白，該蛋白是具有PHD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子。該研究首次通過圖位克隆的方法定位到大豆核雄性不育基因，但并沒有進行深入的功能研究。

2 從反向遺傳學角度，同源序列比對鑒定大豆GMS基因

基因之間在序列(蛋白質(zhì)、DNA或RNA)水平上的相似度越高，往往在功能上也有很高的保守性。有研究報道，在玉米GMS基因中有20%擬南芥GMS同源基因和30%水稻GMS同源基因，在調(diào)控雄性不育方面具有相似的功能[47]。相比于大豆，近幾十年來在擬南芥和水稻中發(fā)現(xiàn)了更多的GMS基因，分別鑒定到至少40個GMS基因[47]。本文根據(jù)擬南芥、水稻和玉米GMS基因，在大豆中找到了122個氨基酸相似性大于40%的同源基因(表2)，同時結(jié)合公共數(shù)據(jù)庫中大豆不同組織中的基因表達數(shù)據(jù)(http:// venanciogroup.uenf.br/resources/)，通過聚類分析將這122個基因分成3類(I、II、III)，其中第一類可進一步分為兩個子類(圖1)。

表2 擬南芥、水稻和玉米GMS基因與大豆同源基因

續(xù)表

圖1 大豆同源GMS基因在不同組織中表達聚類熱圖

不同顏色深淺表示不同基因在不同組織表達量的高低，藍色越深則表達量越高，黃色越深則表達量越低；I：I-1類基因在花中優(yōu)勢表達，I-2類基因在子葉和胚乳中幾乎不表達；II：在根瘤中幾乎不表達的一類基因；III：在子葉、胚乳和根瘤中幾乎不表達的一類基因。

32個I類(I-1)基因在花中優(yōu)勢表達，包括擬南芥[48]、[49]、[50]、[51]、[52]、[53]、[54]、[55]、[56]、[57]和[58]，水稻[59]、[60]、[61]、[62]、[63]、[64]、[65]、[66]、[67]和[68]，玉米、、、、等大豆同源基因[47]。其中絕大部分GMS基因參與了脂質(zhì)代謝過程，如擬南芥和分別編碼脂肪?；o酶A合成酶(ACOS)、長鏈脂肪酸ω-羥化酶(CYP704B)和細胞色素P450脂肪酸羥化酶(CYP703A)，在孢粉素合成和花粉外壁形成中扮演重要角色；一旦發(fā)生突變，將導致烏氏體形成缺陷，花粉壁發(fā)育不完整；它們分別與水稻和及玉米和同源[69]。參與脂質(zhì)代謝的基因中也包含一些重要轉(zhuǎn)錄因子，其中擬南芥[70]與水稻和玉米[71]同源，編碼具有PHD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控絨氈層細胞程序性死亡及花藥晚期發(fā)育。擬南芥和水稻[65]同源，編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，形成DYT1-TDF1-AMS-Ms188- Ms1遺傳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，影響絨氈層細胞發(fā)育和減數(shù)分裂后小孢子形成過程[58,72]。玉米是花藥體細胞層分化所必須的轉(zhuǎn)錄因子，其在水稻中同源基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子在絨氈層細胞程序性死亡和花粉發(fā)育中起著關(guān)鍵作用[73]。

29個I類基因(I-2)在子葉和胚乳中幾乎不表達。34 個II類基因在胚乳和花中的表達量較高，在子葉和根瘤中幾乎不表達。26個III類基因在不同組織均有表達，但大多數(shù)基因在子葉、胚乳和根瘤中幾乎不表達。綜上所述，I類基因(I-1)更有可能是大豆中的GMS基因。

利用大豆中122個可能的GMS基因，結(jié)合大豆中已經(jīng)報道的GMS基因所在的區(qū)間，本文將部分基因繪制在大豆染色體上(圖2)。結(jié)果顯示，基因和在位點所在的區(qū)間內(nèi)，其中擬南芥[70]與同源，在花粉發(fā)育過程中影響絨氈層發(fā)育，與大豆突變體表型相似。基因和在位點所在的區(qū)間內(nèi)，其中與擬南芥[74]同源，在小孢子形成過程中調(diào)控胼胝質(zhì)代謝，影響花粉外壁形成；而與擬南芥水稻基因同源，編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)控絨氈層細胞發(fā)育和減數(shù)分裂后小孢子形成，突變體產(chǎn)生膨大絨氈層和敗育小孢子，突變體絨氈層退化和細胞程序性死亡延遲，導致小孢子凹陷敗育[58]。大豆突變體也是由于絨氈層發(fā)育異常導致小孢子敗育，因此可能是大豆的候選基因。13號染色體的、和在所在的區(qū)間內(nèi)，其中與擬南芥同源，基因是CAZy糖基轉(zhuǎn)移酶31基因家族成員，突變導致阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)/果膠聚糖合成缺陷，參與擬南芥花粉外壁結(jié)構(gòu)和形態(tài)建成，從而影響花粉活力[75]。與水稻[76]同源，與絨氈層發(fā)育、脂質(zhì)代謝相關(guān)。擬南芥[77]與同源，通過調(diào)控角質(zhì)層發(fā)育影響花粉育性，其中擬南芥同源基因突變體的表型與大豆的突變體表型更為接近，可能是的候選基因。此外，和分別在和位點所在的區(qū)間內(nèi)，其中在擬南芥中的同源基因編碼R2R3 MYB轉(zhuǎn)錄因子，在絨氈層、減數(shù)分裂細胞和小孢子中高度表達，可能是控制胼胝質(zhì)降解的關(guān)鍵基因[78]。大豆與擬南芥[79]和煙草[80]基因同源，擬南芥基因編碼驅(qū)動蛋白，與細胞分裂時期微管運動有關(guān)，突變體在小孢子四分體時期胞質(zhì)分裂失敗，結(jié)果產(chǎn)生體積較大的敗育花粉粒；而煙草突變體中NPK1的定位與活性受到影響，抑制了成膜體和細胞板的擴張，從而產(chǎn)生了具有不完整細胞板的多核細胞，該表型與大豆突變體極為相似，提示很有可能是大豆的候選基因。編碼具PHD結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，位于所在的區(qū)間，已經(jīng)通過基因功能互補和CRISPR/Cas9技術(shù)，證實該基因就是大豆中的[12]。

通過對以上大豆GMS基因候選基因的預測，再利用CRISPR/Cas9或RNAi等反向遺傳學手段，對這些可能的大豆GMS基因進行功能驗證，以篩選大豆完全雄性不育系，有望創(chuàng)造出更多有價值的大豆雄性不育材料用于雜交育種。

圖2 大豆不育位點及GMS同源基因所在的染色體位置---圖

紅色斜體符號、、、、、、、、、、、ms、、、、和為基因；其余紅色符號為分子標記。

3 結(jié)語與展望

大豆中雖然已經(jīng)鑒定很多細胞核雄性不育突變體，但是基因克隆和分子機理的研究報道較少。植物之間存在著雄性生殖發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的保守性和多樣性[47]，利用模式植物GMS基因信息進行分析是發(fā)現(xiàn)大豆中GMS基因的有效方法，通過鑒定這些GMS基因在大豆花藥中優(yōu)勢表達的同源基因，再利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)和功能互補實驗進行進一步的驗證，可鑒定新的大豆核雄性不育基因。這不僅有助于人們了解雄性不育的分子機制和大豆生殖生物學，更重要的是可以開發(fā)穩(wěn)定的能夠用于雜交種子生產(chǎn)的大豆不育系統(tǒng)。

大豆中很多核不育系由于其中存在大量可育植株，并且花器官結(jié)構(gòu)存在異常，很難應用于雜交種的生產(chǎn)[81]。隨著三系雜交和兩系雜交育種技術(shù)在應用中顯現(xiàn)的問題日益突出[6～9]，研究人員利用現(xiàn)代生物技術(shù)，已開發(fā)了利用轉(zhuǎn)基因手段保持或繁殖非轉(zhuǎn)基因的植物核雄性不育系的方法[82]。其中包括玉米的多控不育技術(shù)、新型玉米基因工程不育制種技術(shù)和水稻的智能不育技術(shù)，綜合了轉(zhuǎn)基因技術(shù)、熒光蛋白篩選技術(shù)和花粉失活技術(shù)，將花粉育性恢復基因、花粉自我降解基因或、熒光蛋白篩選標記基因或抗除草劑基因組合構(gòu)建遺傳轉(zhuǎn)化載體，通過遺傳轉(zhuǎn)化將轉(zhuǎn)基因元件導入隱性核不育系中，獲得可育的轉(zhuǎn)基因保持系，該保持系自花授粉以1∶1的比例獲得可育轉(zhuǎn)基因種子和不育非轉(zhuǎn)基因種子，可通過熒光分選出來；非轉(zhuǎn)基因不育種子不發(fā)熒光，因此可以有效解決雄性不育種子保持和繁殖的問題，以期用于大規(guī)模商業(yè)生產(chǎn)。

葉綠體轉(zhuǎn)化和利用種子成熟后特異表達啟動子可能是利用作物核雄性不育基因的有效途徑[83]。通過葉綠體轉(zhuǎn)化，如構(gòu)建定點整合載體、利用葉綠體特異的啟動子和終止子等將育性恢復基因轉(zhuǎn)移到雄性不育株的胞質(zhì)中，實現(xiàn)外源花粉育性恢復基因的表達，獲得可育的保持系，該保持系可作為父本與不育系進行雜交，生產(chǎn)雜交種子[83,84]。另外，可以通過人工構(gòu)建的啟動子調(diào)控外源基因的表達，將種子成熟特異表達啟動子、毒素致死基因和花粉育性恢復基因作為緊密連鎖的元件通過遺傳轉(zhuǎn)化導入不育株，獲得轉(zhuǎn)基因植株。該轉(zhuǎn)基因株系在早期是可育的，可通過自花授粉生產(chǎn)繁殖不育系，在轉(zhuǎn)基因植株種子成熟后，致死基因?qū)l(fā)揮作用，導致帶有育性恢復基因的轉(zhuǎn)基因種子死亡，因此后代成活的不育種子不具有轉(zhuǎn)基因[84,85]。

通過現(xiàn)代生物技術(shù)手段，有望充分利用大豆核不育基因構(gòu)建相似的大豆核雄性不育雜交系統(tǒng)，有利于在大豆中更快、更好的實現(xiàn)雜種優(yōu)勢利用。

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Progress on genic male sterility gene in soybean

Xiaoyuan Sun, Yifan Wang, Yunhui Wang, Jiayu Lin, Jinhong Li, Yuantao Qiu, Xiaolong Fang, Fanjiang Kong, Meina Li

Male sterility refers to the phenomenon that stamens cannot grow normally and produce viable pollen grains in plants. Hybrid seed production by taking advantage of the trait of male sterility is an effective and quick strategy to increase crop yield. Up to date, the yield of rice (L.), maize (L.), wheat (L.) and other crops has been greatly increased based on hybrid vigor utilization. Soybean ((L.) Merr.) is a self-pollination species, artificial emasculation is not only time-consuming, but also labor-intensive and economically impracticable. So far, large scale hybrid breeding has not been performed in soybean due to the shortage of male sterile lines suitable for hybrid production. Therefore, it is urgent to identify a stable male sterile system for the rapid utilization of heterosis in soybean. In this review, we summarize the progress on the discovery of soybean genic male sterility (GMS) mutants and GMS genes. Combining with the investigation of GMS genes in, rice and maize, we provide important insights into the identification and potential utilization of GMS genes in soybean in the perspective of reverse genetics.

soybean; genic male sterility; reverse genetics

2020-10-23;

2020-12-07

國家自然科學基金項目(編號：31871648)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 31871648)]

孫小媛，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：植物資源利用。E-mail: 1797740106@qq.com

孔凡江，博士，教授，研究方向：大豆分子育種。E-mail: kongfj@gzhu.edu.cn李美娜，博士，副教授，研究方向：大豆雜種優(yōu)勢利用和生物鐘與環(huán)境互作。E-mail: limeina@gzhu.edu.cn

10.16288/j.yczz.20-357

2021/1/11 17:13:43

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210108.1636.001.html

(責任編委: 王秀娥)