Uhrf1對腸上皮發(fā)育的影響

王芯悅，李亮，段秋慧，李大力，陳金聯(lián)

Uhrf1對腸上皮發(fā)育的影響

王芯悅1,3，李亮2,3，段秋慧2，李大力2，陳金聯(lián)3

1. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，淮南 232000 2. 華東師范大學(xué)生命科學(xué)院，上海市調(diào)控生物學(xué)重點實驗室，上海 200241 3. 上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院南院消化內(nèi)科，上海 201499

作為一種常見的表觀遺傳修飾類型，DNA甲基化對哺乳動物發(fā)育起著重要作用。Uhrf1作為重要的表觀遺傳調(diào)控因子，在DNA合成過程中可結(jié)合半甲基化的DNA同時招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1參與DNA甲基化的維持，保證遺傳信息在細(xì)胞分裂前后的穩(wěn)定傳遞。目前關(guān)于Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化是否影響腸上皮發(fā)育過程尚不清楚。為探索Uhrf1在腸上皮發(fā)育中的作用，本研究成功構(gòu)建了腸上皮特異性敲除的小鼠模型，利用HE染色對腸上皮組織形態(tài)學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，敲除的小鼠腸上皮發(fā)育異常，主要表現(xiàn)為絨毛變短，數(shù)量減少，隱窩萎縮；通過表型分析發(fā)現(xiàn)，在小鼠腸上皮中特異性敲除后，細(xì)胞增殖明顯受到抑制、凋亡細(xì)胞增加、細(xì)胞分化異常，同時腸干細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)降低。進(jìn)一步對可能的分子機(jī)制進(jìn)行初步探索發(fā)現(xiàn)Uhrf1缺失后 DNA甲基化水平大幅下降，誘發(fā)DNA損傷。本研究結(jié)果表明Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化對腸上皮的正常發(fā)育成熟具有重要作用，有望豐富Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化在體內(nèi)的生物學(xué)功能，并為進(jìn)一步明確Uhrf1介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控機(jī)制提供實驗依據(jù)。

DNA甲基化；Uhrf1；腸上皮發(fā)育

DNA甲基化作為一種動態(tài)的和可逆的表觀遺傳修飾，是由甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)介導(dǎo)的對胞嘧啶的第5位碳原子進(jìn)行甲基修飾，形成5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine, 5mC)，主要發(fā)生在CpG二核苷酸位點上[1]。DNA甲基化在個體發(fā)育、基因表達(dá)調(diào)控及基因組穩(wěn)定性等多種生物學(xué)過程中發(fā)揮重要作用[2～5]。

腸上皮作為人體更新較快的組織，上皮細(xì)胞的正常增殖與分化無論是在空間還是時間上都受到嚴(yán)格調(diào)控，增殖與分化間的失衡將會破壞上皮的完整性及其屏障功能，甚至引發(fā)腫瘤的形成。腸上皮細(xì)胞這種快速的更新速率與不同類型細(xì)胞自身的表觀遺傳狀態(tài)密切相關(guān)，目前關(guān)于DNA甲基化如何調(diào)控腸上皮的早期發(fā)育和穩(wěn)態(tài)建立仍不是很清楚。

UHRF1 (ubiquitin-like with PHD and RING finger domains 1)是泛素樣含植物同源化結(jié)構(gòu)域(plant homeodomain domain, PHD)和環(huán)指域蛋白家族的主要成員之一，對DNA甲基化的維持至關(guān)重要[6]。UHRF1作為一種多結(jié)構(gòu)域蛋白，SRA結(jié)構(gòu)域(set and ring associated domain)可以識別半甲基化的DNA，并招募DNMT1到復(fù)制叉處，保證在細(xì)胞復(fù)制時遺傳信息由親代向子代的穩(wěn)定傳遞[7]；PHD及Tudor結(jié)構(gòu)域與甲基化組蛋白H3K9特異性地結(jié)合，參與異染色質(zhì)的形成和維持，同時有利于DNMT1的正確定位，將組蛋白修飾與DNA甲基化緊密聯(lián)系起來[8,9]。此外UHRF1的RING(really interesting new gene)結(jié)構(gòu)域被證明是一種泛素連接酶，可以催化組蛋白H3K23等位點發(fā)生泛素化修飾，并被DNMT1所識別，促進(jìn)DNMT1招募進(jìn)而參與DNA甲基化的維持[10,11]。除了參與DNA甲基化外，UHRF1還與細(xì)胞周期調(diào)控及DNA損傷修復(fù)等諸多生物學(xué)過程相關(guān)[12,13]。隨著UHRF1生物化學(xué)功能的不斷闡明，關(guān)于由UHRF1介導(dǎo)的DNA甲基化在體內(nèi)的生物學(xué)功能也得到研究學(xué)者的廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)Uhrf1決定卵母細(xì)胞質(zhì)量，影響卵母細(xì)胞成熟，對胚胎著床前的發(fā)育至關(guān)重要[14]；在斑馬魚()中，Uhrf1的突變導(dǎo)致整體DNA甲基化水平降低，肝臟體積縮小，組織發(fā)育不全[15]；在對胸腺細(xì)胞的研究中表明，敲除造成胸腺細(xì)胞數(shù)量明顯降低，Uhrf1介導(dǎo)的表觀遺傳調(diào)控對胸腺細(xì)胞的正常發(fā)育必不可少[16]；而在大腦皮層的研究中卻發(fā)現(xiàn)Uhrf1的缺失對早期發(fā)育作用較小，不影響細(xì)胞的增殖[17]。為探討Uhrf1及其介導(dǎo)的DNA甲基化在腸上皮發(fā)育中的作用，本研究構(gòu)建了在腸上皮中特異性敲除的小鼠模型，并對表型及可能的分子機(jī)制進(jìn)行分析，初步揭示了Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化在腸組織系統(tǒng)中的功能。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用的小鼠遺傳背景均C57BL/6J品系，飼養(yǎng)于華東師范大學(xué)實驗動物中心SPF級清潔實驗動物房。動物實驗的設(shè)計與操作均符合華東師范大學(xué)動物倫理委員會相關(guān)規(guī)定并被授權(quán)，嚴(yán)格遵守實驗動物3R原則。

1.2 實驗試劑

蘇木精和伊紅染液購自南京建成生物工程研究所；免疫組化二抗試劑盒和DAB顯色試劑盒購自德國VECTOR公司；免疫組化及蘇木精–伊紅染色相關(guān)的無水酒精、二甲苯、甲醇等購自上海國藥集團(tuán)；EB染液、dNTP混合物、ExTaq DNA聚合酶和6×DNA loading buffer等購自北京天根生化科技有限公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和Trizol等購自日本TaKaRa 公司；SYBR green購自上海翊圣生物科技有限公司；DNA marker購自美國Thermo Fisher公司；Ki67抗體(RM9106，美國Thermo Fisher公司)；Cleaved Caspase3抗體 (9664#，美國Cell SignalingTechnology公司)；Muc2 (Mucin 2)抗體(美國Santa Cruz Biotechnology公司)；Dclk1(Doublecortin-like kinase 1)抗體(ab31704，英國Abcam)，ChgA (Chro-mogranin A)抗體(ab15160，英國Abcam)；Uhrf1抗體(61341，美國Active Motif公司)；5mC抗體(39769，美國Active Motif公司)；γH2AX (phosphorylation of histone H2AX)抗體(05636#，美國Millipore公司)。

1.3 Uhrf1條件性敲除小鼠的構(gòu)建

通過基因打靶技術(shù)，在基因的第3號外顯子和第4號外顯子之間的內(nèi)含子區(qū)域插入可以表達(dá)β-半乳糖苷酶(LacZ)和neo抗性蛋白以及polyA，同時兩端還有2個同向的FRT (short flippase reco-gnition target)序列，另外在第4號外顯子兩側(cè)插入了同向的loxp序列。通過移植該ES細(xì)胞到假孕小鼠的子宮，獲得可以條件性敲除的小鼠。取-LacZ小鼠與Flp工具鼠交配，F(xiàn)lp(flippase)重組酶發(fā)揮作用，切除FRT之間序列，得到僅在第4號外顯子兩側(cè)插入同向的loxp序列的小鼠，使用此小鼠與在腸上皮中特異性表達(dá)重組酶Cre的工具鼠雜交，切割的第4號外顯子，導(dǎo)致Uhrf1蛋白的翻譯出現(xiàn)移碼，從而敲除基因。

1.4 聚合酶式反應(yīng)(polymerase chainreaction, PCR)

剪取小鼠腳趾并標(biāo)記放入1.5 mL無菌EP管中，按1:500比例加入蛋白酶K與消化液，置于55度水浴鍋中消化過夜，次日100度煮沸5分鐘后離心，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海鉑尚生物技術(shù)有限公司合成，序列Uhrf1(F)：5?-ACTCTTGATCTGTGCC-CTGC-3?和Uhrf1(R)：5?-ATCCCAGGCCTCCATAC-ACT-3?。擴(kuò)增體系(總體積為20 μL)：2 μL 10×buffer，2 μL dNTP混合物，2 μL引物，3 μL模板，0.2 μL Easy Taq酶，11 μL ddH2O。反應(yīng)條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 40 s；循環(huán)35次。擴(kuò)增后進(jìn)行凝膠電泳，凝膠自動成像儀記錄電泳圖像，比對條帶大小，確定小鼠基因型。

1.5 腸組織切片及蘇木精–伊紅染色(hemato-xylin-eosin staining, HE)

采用頸椎脫臼法將小鼠處死后，分離小鼠腸組織，制成“瑞士卷”，用4%多聚甲醛固定過夜，包埋后將蠟塊放入–20℃冰箱中保存，包埋好的組織制成5 μm切片，62℃烤片2 h，待干燥后進(jìn)行脫蠟復(fù)水，具體過程為二甲苯I：7 min→二甲苯II：7 min→二甲苯：乙醇(1∶1)：7 min→100%乙醇：4 min→95%乙醇：4 min→85%乙醇：4 min→75%乙醇：4 min→純水：3 min→蘇木精：5 min(具體視蘇木精濃度而定)→1%鹽酸酒精分色：10～30 s→蒸餾水中返藍(lán)：15 min→伊紅染色：30 s～1min→脫水及中性樹脂封片→顯微鏡下拍照。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

組織切片脫蠟復(fù)水同HE染色→3%的過氧化氫避光處理13 min→抗原修復(fù)液置于100℃處理20 min→PBST潤洗3次，每次5 min→封閉液室溫封閉30 min以上→滴加一抗于4℃孵育過夜→回收一抗，PBST潤洗3次→滴加HRP室溫避光反應(yīng)30 min→PBST潤洗3次→顯色3～5 min,深度適宜后蒸餾水中終止顯色反應(yīng)→蘇木精復(fù)染→鹽酸酒精分色→自來水中返藍(lán)15 min→脫水封片同HE染色。

1.7 實時熒光定量PCR (quantitative real-time PCR, qRT-PCR)分析

小鼠脫頸椎處死后取出腸組織液氮研磨后加入1 mLTrizol，按RNA抽提試劑盒說明書提取總 RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。qRT-PCR擴(kuò)增體系為25 μL，包括：12.5 μL (2×) SYBR Premix ExTaq，2 μL引物，1 μL cDNA，9.5 μL RNase FreeH2O。擴(kuò)增條件：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共40個循環(huán)，每個樣進(jìn)行3次重復(fù)。根據(jù)每個樣品與內(nèi)參基因所得的Ct值，利用2–ΔΔCt公式分析目的基因相對表達(dá)量?；虻臄U(kuò)增引物序列見表1。

表1 qRT-PCR引物序列

1.8 統(tǒng)計方法

用Graphpad Prism 6軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，各組之間的比較用平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，<0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 Uhrf1基因條件性敲除小鼠的構(gòu)建與鑒定

Uhrf1小鼠是以基因的第4號外顯子為靶基因，在其兩端插入loxp位點，與表達(dá)Cre酶的工具鼠交配后獲得VillinCre-Uhrf1小鼠，從而切除相同方向的兩個loxp位點間第4號外顯子序列，導(dǎo)致UHRF1蛋白翻譯時出現(xiàn)移碼，從而實現(xiàn)靶基因的敲除(圖1A)。設(shè)計引物針對loxp序列進(jìn)行PCR，對子代進(jìn)行基因型鑒定。如圖1B所示，僅擴(kuò)增出305 bp條帶者為Uhrf1，擴(kuò)增出305 bp和106 bp兩條帶的為Uhrf1，僅擴(kuò)增出106 bp條帶者為Uhrf1。通過對子代小鼠進(jìn)行基因型的鑒定，觀察發(fā)現(xiàn)VillinCre-Uhrf1小鼠可以正常出生，但是出生率低于理論預(yù)期，部分小鼠在斷奶前后出現(xiàn)顯著死亡情況，很難發(fā)育到成年階段，因此后續(xù)實驗選取出生后3周小鼠作為實驗研究對象。

2.2 Uhrf1基因條件性敲除小鼠的敲除效果

為了探索Uhrf1在腸發(fā)育及穩(wěn)態(tài)建立中的作用，首先采用免疫組織化學(xué)染色法對Uhrf1表達(dá)量及位置進(jìn)行檢測，如圖2A(左)染色結(jié)果顯示，著色區(qū)域陽性細(xì)胞僅定位于腸隱窩部位，腸的其他部位未見有表達(dá)，說明Uhrf1主要存在于腸隱窩增殖性細(xì)胞中，即主要包含小腸干細(xì)胞及快速增殖的祖細(xì)胞。進(jìn)一步采用Cre-loxp重組技術(shù)構(gòu)建腸上皮中特異性敲除的突變小鼠，并采用免疫組織化學(xué)染色和qRT-PCR方法檢測Uhrf1在腸組織中的表達(dá)情況，免疫組織化學(xué)技術(shù)結(jié)果顯示在條件性敲除小鼠的腸隱窩底部區(qū)域并未檢測到Uhrf1的表達(dá)(圖2A，右)；由圖2B結(jié)果可見，基因敲除小鼠腸組織中mRNA表達(dá)水平低于對照組小鼠。結(jié)果表明Cre重組酶可以發(fā)揮正常功能，導(dǎo)致基因敲除，證實基因條件性敲除小鼠構(gòu)建成功。

圖1 Uhrf1基因條件性敲除小鼠的構(gòu)建與鑒定

A：基因條件性敲除小鼠構(gòu)建示意圖。B：PCR鑒定基因敲除結(jié)果。M：DNA marker。

圖2 Uhrf1在腸組織中的表達(dá)情況

A：野生型和突變型小鼠腸組織中Uhrf1抗體免疫組織化學(xué)染色。標(biāo)尺：20 μm。B：野生型與突變型小鼠腸組織中mRNA表達(dá)量對比。****：<0.0001。

2.3 敲除Uhrf1造成腸上皮組織形態(tài)異常

為探究Uhrf1對腸上皮組織形態(tài)學(xué)的影響，選取出生后3周的野生型與敲除小鼠，脫頸椎處死后取小腸組織制作石蠟切片，通過HE染色進(jìn)行組織形態(tài)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比(圖3A)，Uhrf1的缺失導(dǎo)致腸絨毛長度明顯變短，隱窩發(fā)生萎縮，同時兩者數(shù)量減少,表明敲除后腸上皮發(fā)育過程受阻(圖3B)，腸上皮組織形態(tài)的建立依賴于Uhrf1。

圖3 野生型及突變型小鼠腸組織HE染色

A：野生型小鼠腸組織切片觀察。B：突變型小鼠腸組織切片觀察。右圖均是左圖虛線區(qū)域的放大示意圖。標(biāo)尺左：50 μm，標(biāo)尺右：20 μm。

2.4 Uhrf1的缺失影響腸上皮細(xì)胞的增殖與分化能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡

隱窩作為腸上皮的功能單位，負(fù)責(zé)維持細(xì)胞增殖與分化的平衡。Uhrf1特異性表達(dá)隱窩底部區(qū)域，暗示其可能影響上皮細(xì)胞的增殖和分化。因此選取3周齡VillinCre-Uhrf1小鼠，同時選取同窩Uhrf1的小鼠作為對照，采用免疫組織化學(xué)染色方法檢測腸上皮細(xì)胞的增殖、凋亡和分化情況，并進(jìn)一步對凋亡細(xì)胞及各類分化細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行檢測，在20倍顯微鏡視野下拍照，隨機(jī)選取3個形態(tài)相似視野，統(tǒng)計每個視野陽性細(xì)胞數(shù)。結(jié)果顯示：與對照組小鼠相比，胚胎期敲除導(dǎo)致增殖標(biāo)記蛋白Ki67陽性細(xì)胞數(shù)量顯著減少(圖4A)，說明腸上皮細(xì)胞的正常增殖受到明顯抑制。而凋亡相關(guān)蛋白Caspase3陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加，并且主要集中在隱窩底部區(qū)域(圖4，B和F)，表明Uhrf1的缺失不僅影響了細(xì)胞增殖，而且促使腸上皮細(xì)胞發(fā)生凋亡。敲除后腸上皮細(xì)胞增殖受到抑制以及凋亡增加暗示分化過程可能也受到影響，因此為進(jìn)一步了解Uhrf1對腸上皮分化細(xì)胞的影響，對杯狀細(xì)胞-Muc2、內(nèi)分泌細(xì)胞-ChgA、Tuft細(xì)胞-Dclk1標(biāo)記陽性細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)VillinCre-Uhrf1小鼠腸組織Muc2 (圖4，C和G)、ChgA (圖4，D和H)和Dclk1 (圖4，E和I)陽性細(xì)胞數(shù)減少，表達(dá)下降，說明敲除Uhrf1明顯影響了腸上皮細(xì)胞的正常分化過程。因此，這些研究結(jié)果表明Uhrf1是調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵因子。

圖4 Uhrf1fl/fl和VillinCre-Uhrf1fl/fl小鼠腸組織中的表型分析

A：腸組織增殖標(biāo)記蛋白Ki67免疫染色。B：腸組織凋亡標(biāo)志蛋白Caspase3-cleaved免疫染色。紅色箭頭指示凋亡陽性細(xì)胞，左上角為紅色箭頭區(qū)域放大圖。C：杯狀細(xì)胞標(biāo)記蛋白Muc2免疫染色。D：內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)記蛋白ChgA免疫染色。E：Tuft細(xì)胞標(biāo)記蛋白Dclk1免疫染色。標(biāo)尺：50 μm F～I(xiàn)：野生型與突變型小鼠Caspase3-cleaved、Muc2、ChgA、Dclk1陽性細(xì)胞統(tǒng)計結(jié)果。*：<0.05；**：<0.01；***：<0.001。**：<0.01；***：<0.001；****：<0.0001。

2.5 敲除Uhrf1腸干細(xì)胞標(biāo)志基因的表達(dá)降低

Lgr5+腸干細(xì)胞作為一種快速增殖的細(xì)胞，對腸組織生理功能及穩(wěn)態(tài)的維持起著重要的作用，因此為了解基因敲除鼠中Lgr5+干細(xì)胞有沒有受到影響，本研究進(jìn)一步在分子水平上對Lgr5+干細(xì)胞相關(guān)的基因：、、和表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，在腸組織中特異性敲除后，造成腸干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)降低(圖5)，表明Uhrf1可能對腸干細(xì)胞數(shù)量具有一定的影響。

2.6 敲除Uhrf1導(dǎo)致DNA甲基化水平下降，誘導(dǎo)DNA損傷

如前所述，UHRF1作為表觀遺傳調(diào)控因子，在DNA甲基化維持中起著關(guān)鍵作用。為確定Uhrf1的缺失是否會導(dǎo)致腸上皮基因組甲基化的丟失，采用免疫組織化學(xué)染色方法對5mC表達(dá)水平進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組小鼠相比，條件性敲除小鼠的腸組織中5mC水平明顯降低,表明敲除會造成腸上皮組織甲基化水平顯著下降(圖5A)。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平降低會引起DNA損傷應(yīng)答反應(yīng)，因此對DNA損傷標(biāo)志物γH2AX進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)敲除后在腸隱窩部位可以看到明顯的DNA損傷(圖5B)，說明Uhrf1的缺失導(dǎo)致腸上皮組織DNA損傷增加。

圖5 腸干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志基因的表達(dá)

3 討論

DNA甲基化作為最穩(wěn)定的表觀遺傳修飾，對體內(nèi)多個自我更新組織中基因的表達(dá)調(diào)控至關(guān)重要，DNA甲基化的異常將造成基因表達(dá)的改變，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生[18,19]。多項研究證明Uhrf1可招募Dnmt1，在增殖性細(xì)胞中維持DNA甲基化信息在細(xì)胞分裂前后的穩(wěn)定傳遞，缺失Uhrf1將會導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的DNA甲基化水平大幅下降[20]。本研究發(fā)現(xiàn)Uhrf1主要表達(dá)在腸隱窩底部區(qū)域主要是腸干細(xì)胞和快速增殖的祖細(xì)胞，而在絨毛等其他部位未見有表達(dá)，進(jìn)一步證明Uhrf1在增殖性細(xì)胞中表達(dá)豐富，這與之前報道的Uhrf1在其他組織系統(tǒng)中的表達(dá)相一致[21]。

研究表明Uhrf1可以影響不同組織細(xì)胞的增殖和分化并與凋亡過程相關(guān)。在對結(jié)腸調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的研究中發(fā)現(xiàn)Uhrf1缺陷的小鼠表現(xiàn)為細(xì)胞增殖和正常發(fā)育成熟過程受阻，免疫功能降低，并自發(fā)形成結(jié)腸炎[22]。在斑馬魚肝臟中，敲減可顯著抑制肝細(xì)胞增殖，造成凋亡增加[23]。在四肢間充質(zhì)細(xì)胞中敲除后，由于破壞了軟骨細(xì)胞增殖及分化過程，造成小鼠肢體明顯縮短[24]。同樣，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)Uhrf1的缺失抑制了腸上皮細(xì)胞的增殖與分化，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致腸上皮發(fā)育異常, 并造成腸干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記基因表達(dá)水平的降低。已有研究證明DNA甲基化水平的降低將會導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，突變率增加，從而引起DNA損傷反應(yīng)[25～27]。Amy等[28]在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT116中敲減發(fā)現(xiàn)，Uhrf1的丟失導(dǎo)致DNA損傷反應(yīng)的激活，主要表現(xiàn)為組蛋白H2AX在第139位絲氨酸的磷酸化以及細(xì)胞周期檢測點激酶2 (checkpoint kinase 2, CHK2)第68位蘇氨酸的磷酸化等，并造成細(xì)胞通過caspases 8和3途徑發(fā)生凋亡。為進(jìn)一步探索基因是如何誘發(fā)細(xì)胞凋亡，通過免疫組織化學(xué)染色方法對腸上皮組織甲基化水平及DNA損傷標(biāo)志物γH2AX進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示與對照組小鼠相比，Uhrf1的缺失導(dǎo)致腸上皮組織整體甲基化水平降低，DNA損傷增加，因此初步推測可能是Uhrf1的缺失造成DNA甲基化水平大幅下降，誘發(fā)DNA損傷，進(jìn)而引起腸上皮細(xì)胞增殖分化減緩，凋亡增加。目前已有研究表明DNA甲基化可以通過調(diào)控發(fā)育過程中細(xì)胞增殖和分化間的平衡來調(diào)節(jié)腸上皮穩(wěn)態(tài)的建立。Sheaffer等[29～31]研究發(fā)現(xiàn)Dnmt1介導(dǎo)的維持性DNA甲基化對腸上皮細(xì)胞分化過程中的基因表達(dá)調(diào)控起著關(guān)鍵作用，胚胎期敲除發(fā)現(xiàn)Dnmt1的缺失導(dǎo)致小鼠腸上皮細(xì)胞增殖下降、絨毛數(shù)量減少、基因組甲基化水平降低，并采用轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)與DNA損傷及細(xì)胞周期相關(guān)的基因表達(dá)升高，造成細(xì)胞周期阻滯，從而引起細(xì)胞死亡,這與本研究中在小鼠胚胎期腸上皮細(xì)胞中特異性敲除的表型相類似；進(jìn)一步在成體小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，盡管短期內(nèi)敲除可導(dǎo)致小鼠體重下降，基因組穩(wěn)定性及甲基化水平降低，但兩個月左右由于Dnmt3b的激活，DNA甲基化水平及腸上皮完整性可以逐漸恢復(fù)到正常水平，Dnmt1和Dnmt3b共同負(fù)責(zé)成體小鼠腸上皮甲基化的維持，目前關(guān)于Uhrf1在成體小鼠腸組織中的功能還有待建立動物模型進(jìn)行下一步的研究。據(jù)報道Uhrf1可以通過靶向多個信號通路發(fā)揮生物學(xué)功能。例如Chen等[32]證明Uhrf1可以通過影響細(xì)胞周期抑制蛋白CDKN1A (cyclin dependent kinase inhibitor 1A)以及調(diào)節(jié)B細(xì)胞增殖和衰老家族的()表達(dá)水平來促進(jìn)B細(xì)胞增殖，進(jìn)一步應(yīng)用亞硫酸鹽測序分析發(fā)現(xiàn)基因的CpG位點的DNA甲基化水平在敲除后明顯降低。Xiang 等[33]發(fā)現(xiàn)Uhrf1的缺失導(dǎo)致基底細(xì)胞阻滯在G1期，損害了氣道再生過程，并表明Uhrf1可能影響了與G1/S期轉(zhuǎn)變相關(guān)的細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶的活性。在自然殺傷性T細(xì)胞中Uhrf1被證明可以通過調(diào)節(jié)蛋白激酶B/哺乳動物雷帕霉素白蛋白(protein kinase B/mammalian target of rapamycin, Akt-mTOR)信號軸來控制細(xì)胞的分化，影響細(xì)胞的發(fā)育[34]。目前關(guān)于Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化對腸上皮發(fā)育具體調(diào)控機(jī)制尚不清楚，考慮到Uhrf1和Dnmt1在甲基化維持中的作用，Uhrf1和Dnmt1是否具有類似的功能與機(jī)制，需要更進(jìn)一步的探索。

圖6 Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化對腸上皮細(xì)胞影響

A：野生型與條件性敲除Uhrf1小鼠腸上皮中5mC免疫組織化學(xué)染色。B：野生型與條件性敲除Uhrf1小鼠腸上皮中DNA損傷標(biāo)志物γH2AX 免疫組織化學(xué)染色。紅色箭頭表示DNA損傷陽性細(xì)胞。標(biāo)尺：50 μm。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建在腸上皮中特異性敲除的小鼠模型，發(fā)現(xiàn)在胚胎期敲除后，腸上皮發(fā)育異常，上皮穩(wěn)態(tài)失衡，Uhrf1的缺失導(dǎo)致DNA甲基化的維持過程被破壞，誘發(fā)DNA損傷反應(yīng)，造成腸上皮細(xì)胞的增殖與分化受阻，細(xì)胞凋亡增加，首次揭示了Uhrf1介導(dǎo)的DNA甲基化在腸上皮發(fā)育中的重要作用，為進(jìn)一步明確Uhrf1介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制提供了實驗依據(jù)。

[1] Smith ZD, Meissner A. DNA methylation: roles in mammalian development., 2013, 14(3): 204–220.

[2] Greenberg MVC, Bourc'his D. The diverse roles of DNA methylation in mammalian development and disease., 2019, 20(10): 590–607.

[3] Schübeler D. Function and information content of DNA methylation., 2015, 517(7534): 321–326.

[4] Smith ZD, Sindhu C, Meissner A. Molecular features of cellular reprogramming and development., 2016, 17(3): 139–154.

[5] Newkirk SJ, An WF. Uhrf1: a jack of all trades, and a master epigenetic regulator during spermatogenesis., 2020, 102(6): 1147–1152.

[6] Xue BS, Zhao JS, Feng PH, Xing J, Wu HL, Li Y. Epigenetic mechanism and target therapy of Uhrf1 protein complex in malignancies., 2019, 12: 549–559.

[7] Sharif J, Muto M, Takebayashi S, Suetake I, Iwamatsu A, Endo TA, Shinga J, Mizutani-Koseki Y, Toyoda T, Okamura K, Tajima S, Mitsuya K, Okano M, Koseki H. The SRA protein Np95 mediates epigenetic inheritance by recruiting Dnmt1 to methylated DNA., 2007, 450(7171): 908–912.

[8] Xie S, Qian CM. The growing complexity of Uhrf1- mediated maintenance DNA methylation., 2018, 9(12): 600.

[9] Cheng JD, Yang Y, Fang J, Xiao JX, Zhu TT, Chen F, Wang P, Li Z, Yang HR, Xu YH. Structural insight into coordinated recognition of trimethylated histone H3 lysine 9 (H3K9me3) by the plant homeodomain (PHD) and tandem tudor domain (TTD) of Uhrf1 (ubiquitin-like, containing PHD and RING finger domains, 1) protein., 2013, 288(2): 1329–1339.

[10] Nishiyama A, Yamaguchi L, Sharif J, Johmura Y, Kawamura T, Nakanishi K, Shimamura S, Arita K, Kodama T, Ishikawa F, Koseki H, Nakanishi M. Uhrf1- dependent H3K23 ubiquitylation couples maintenance DNA methylation and replication., 2013, 502(7470): 249–253.

[11] Harrison JS, Cornett EM, Goldfarb D, DaRosa PA, Li ZM, Yan F, Dickson BM, Guo AH, Cantu DV, Kaustov L, Brown PJ, Arrowsmith CH, Erie DA, Major MB, Klevit RE, Krajewski K, Kuhlman B, Strahl BD, Rothbart SB. Hemi-methylated DNA regulates DNA methylation inheri-tance through allosteric activation of H3 ubiquitylation by Uhrf1., 2016, 5: e17101.

[12] Jeanblanc M, Mousli M, Hopfner R, Bathami K, Martinet N, Abbady AQ, Siffert JC, Mathieu E, Muller CD, Bronner C. The retinoblastoma gene and its product are targeted by ICBP90: a key mechanism in the G1/S transition during the cell cycle.2005, 24(49): 7337–7345.

[13] Tian YY, Paramasivam M, Ghosal G, Chen D, Shen X, Huang YL, Akhter S, Legerski R, Chen JJ, Seidman MM, Qin J, Li L. Uhrf1 contributes to DNA damage repair as a lesion recognition factor and nuclease scaffold., 2015, 10(12): 1957–1966.

[14] Maenohara S, Unoki M, Toh H, Ohishi H, Sharif J, Koseki H, Sasaki H. Role of Uhrf1 in de novo DNA methylation in oocytes and maintenance methylation in preimplantation embryos., 2017, 13(10): e1007042.

[15] Jacob V, Chernyavskaya Y, Chen XT, Tan PS, Kent B, Hoshida Y, Sadler KC. DNA hypomethylation induces a DNA replication-associated cell cycle arrest to block hepatic outgrowth in Uhrf1 mutant zebrafish embryos.,2015, 142(3): 510–521.

[16] Zhang YW, Chen YS, Ma R, Jiang YW, Liu J, Lin YT, Chen SQ, Xia MY, Zou F, Zhang JS, Pan T, Wang L, Wei L, Zhang H. Uhrf1 controls thymocyte fate decisions through the epigenetic regulation of EGR1 expression., 2020, 204(12): 3248–3261.

[17] Ramesh V, Bayam E, Cernilogar FM, Bonapace IM, Schulze M, Riemenschneider MJ, Schotta G, G?tz M. Loss of Uhrf1 in neural stem cells leads to activation of retroviral elements and delayed neurodegeneration.,2016, 30(19): 2199–2212.

[18] Sen GL, Reuter JA, Webster DE, Zhu L, Khavari PA. DNMT1 maintains progenitor function in self-renewing somatic tissue., 2010, 463(7280): 563–567.

[19] Yang XD, Han W, Liu F. DNA methylation in vertebrate embryogenesis.(, 2012, 34(9): 1108– 1113.楊曉丹, 韓威, 劉峰. DNA甲基化與脊椎動物胚胎發(fā)育. 遺傳, 2012, 34(9): 1108–1113.

[20] Bostick M, Kim JK, Estève PO, Clark A, Pradhan S, Jacobsen SE. Uhrf1 plays a role in maintaining DNA methylation in mammalian cells., 2007, 317(5845): 1760–1764.

[21] Blanchart A, Navis AC, Assaife-Lopes N, Usoskin D, Aranda S, Sontheimer J, Ernfors P. Uhrf1 licensed self-renewal of active adult neural stem cells., 2018, 36(11): 1736–1751.

[22] Obata Y, Furusawa Y, Endo TA, Sharif J, Takahashi D, Atarashi K, Nakayama M, Onawa S, Fujimura Y, Takahashi M, Ikawa T, Otsubo T, Kawamura YI, Dohi T, Tajima S, Masumoto H, Ohara O, Honda K, Hori S, Ohno H, Koseki H, Hase K. The epigenetic regulator Uhrf1 facilitates the proliferation and maturation of colonic regulatory T cells., 2014, 15(6): 571–579.

[23] Sadler KC, Krahn KN, Gaur NA, Ukomadu C. Liver growth in the embryo and during liver regeneration in zebrafish requires the cell cycle regulator, Uhrf1., 2007, 104(5): 1570–1575.

[24] Yamashita M, Inoue K, Saeki N, Ideta-Otsuka M, Yanagihara Y, Sawada Y, Sakakibara I, Lee J, Ichikawa K, Kamei Y, Iimura T, Igarashi K, Takada Y, Imai Y. Uhrf1 is indispensable for normal limb growth by regulating chondrocyte differentiation through specific gene expression., 2018, 145(1): dev157412.

[25] Jenkins Y, Markovtsov V, Lang W, Sharma P, Pearsall D, Warner J, Franci C, Huang B, Huang JN, Yam GC, Vistan JP, Pali E, Vialard J, Janicot M, Lorens JB, Payan DG, Hitoshi Y. Critical role of the ubiquitin ligase activity of Uhrf1, a nuclear RING finger protein, in tumor cell growth., 2005, 16(12): 5621–5629.

[26] Ma HH, Chen H, Guo X, Wang ZT, Sowa ME, Zheng LJ, Hu SB, Zeng PY, Guo R, Diao JB, Lan F, Harper JW, Shi YG, Xu YH, Shi Y. M phase phosphorylation of the epigenetic regulator uhrf1 regulates its physical association with the deubiquitylase USP7 and stability., 2012, 109(13): 4828–4833.

[27] Loughery JEP, Dunne PD, O'Neill KM, Meehan RR, McDaid JR, Walsh CP. Dnmt1 deficiency triggers mismatch repair defects in human cells through depletion of repair protein levels in a process involving the DNA damage response.2011, 20(16): 3241– 3255.

[28] Tien AL, Senbanerjee S, Kulkarni A, Mudbhary R, Goudreau B, Ganesan S, Sadler KC, Ukomadu C. Uhrf1 depletion causes a G2/M arrest, activation of DNA damage response and apoptosis., 2011, 435(1): 175–185.

[29] Sheaffer KL, Kim R, Aoki R, Elliott EN, Schug J, Burger L,Schübeler D, Kaestner KH. DNA methylation is required for the control of stem cell differentiation in the small intestine., 2014, 28(6): 652–664.

[30] Elliott EN, Sheaffer KL, Schug J, Stappenbeck TS, Kaestner KH. Dnmt1 is essential to maintain progenitors in the perinatal intestinal epithelium., 2015, 142(12): 2163–2172.

[31] Elliott EN, Sheaffer KL, Kaestner KH. The 'de novo' DNA methyltransferase Dnmt3b compensates the Dnmt1-deficient intestinal epithelium., 2016, 5: e12975.

[32] Chen C, Zhai SL, Zhang L, Chen JJ, Long XH, Qin J, Li JH, Huo R, Wang XM. Uhrf1 regulates germinal center B cell expansion and affinity maturation to control viral infection., 2018, 215(5): 1437–1448.

[33] Xiang HD, Yuan LF, Gao X, Alexander PB, Lopez O, Lau C, Ding Y, Chong MY, Sun T, Chen R, Liu SQ, Wu HY, Wan Y, Randell SH, Li QJ, Wang XF. Uhrf1 is required for basal stem cell proliferation in response to airway injury., 2017, 3: 17019.

[34] Cui Y, Chen XF, Zhang JL, Sun X, Liu HF, Bai L, Xu CQ, Liu XL. Uhrf1 controls iNKT cell survival and differen-tiation through the Akt-mTOR axis., 2016, 15(2): 256–263.

Effect of Uhrf1 on intestinal development

Xinyue Wang1,3, Liang Li2,3, Qiuhui Duan2, Dali Li2, Jinlian Chen3

As a best-characterized epigenetic modification, DNA methylation plays an important role in mammalian development. Uhrf1 is a critical epigenetic regulator that can bind to hemimethylated DNA and recruit DNA methyltransferase 1 to maintain DNA methylation. So far, the role of Uhrf1-mediated DNA methylation in intestinal development is still unknown. In order to investigate the impact of Uhrf1 deletion in intestinal development, we have successfully constructed the epithelial-specificknockout mouse model. After Uhrf1 ablation, we found the mutant mice exhibited abnormal epithlial structure with less and shorter villi and shrinked crypts compared with wild type micehematoxylin-eosin staining.Further analysis showed that Uhrf1 deletion in the intestinal epithelium significantly decreased the cell proliferation and induced cell apoptosis. In addition, Uhrf1 deletion inhibited the normal epithelial differentiation and the expression of intestinal stem cell marker genes.Preliminary mechanism study revealed that loss of Uhrf1 caused global DNA hypomethylation which induced DNA damage in crypt cells.Taken together,our data suggested that DNA methylation mediated by Uhrf1 is vital forthe normal intestinal development.Our results enriched therole of Uhrf1 and laid the foundation for further epigeneticregulatory mechanismexploration.

DNA methylation;Uhrf1;intestinal development

2020-11-26;

2020-12-22

上海市自然科學(xué)基金項目(編號：16ZR1429100)資助[Supported by the National Natural Science Foundation of Shanghai(No. 16ZR1429100)]

王芯悅，在讀碩士研究生，專業(yè)方向：消化內(nèi)科學(xué)。E-mail: 1294008801@qq.com

李大力，博士，研究員，研究方向：基因編輯。E-mail: dlli@bio.ecnu.edu.cn陳金聯(lián)，博士，主任醫(yī)師，研究方向：消化道腫瘤與肝病。E-mail: wqq_021002@163.com

10.16288/j.yczz.20-337

2021/1/8 14:13:16

URI: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1913.R.20210107.1324.006.html

(責(zé)任編委: 趙冰)