m6A閱讀者YTH蛋白的研究進展

王曉樂，馬榮榮，魯鎮(zhèn)飛，馬煒煒

(寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 作物研究所，浙江 寧波 315000)

無論在真核還是原核生物中，基因的表達調(diào)控都是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平上的多層次調(diào)控，這些過程對生物的生長、發(fā)育和生存都至關(guān)重要。近年來，關(guān)于RNA上化學(xué)修飾的研究逐漸使人們認識到這些化學(xué)修飾在基因表達調(diào)控中的重要性，而對于RNA上的化學(xué)修飾的研究被統(tǒng)稱為表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)。

在所有RNA化學(xué)修飾中，m6A是真核生物RNA中最常見也是分布最廣泛的表觀轉(zhuǎn)錄修飾。m6A修飾最早發(fā)現(xiàn)于20世紀70年代，當時人們猜測m6A修飾可能是一種mRNA潛在調(diào)節(jié)因子[1-2]。隨后在酵母的研究中證實了m6A修飾水平是一個動態(tài)變化過程，并對酵母的生長發(fā)育至關(guān)重要。在酵母孢子形成過程中，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶的缺失抑制酵母孢子的形成，并阻斷新個體的發(fā)育[3-4]。此后，研究者們逐漸發(fā)現(xiàn)m6A修飾具有多種生物學(xué)功能。在細胞及組織水平上，m6A影響細胞分化[5-7]、腫瘤形成[8-11]、節(jié)律鐘調(diào)控[12]、神經(jīng)發(fā)育及其功能行使[13]、果蠅性別決定[14-16]及X染色體沉默(XCI)[17]。在分子水平上，m6A修飾與mRNA的最終命運密切相關(guān)，一方面m6A通過破壞m6A所在區(qū)域的mRNA二級結(jié)構(gòu)從而提高其附近區(qū)域與蛋白的結(jié)合能力[18]，另一方面m6A同樣具有招募特定蛋白(也被稱為READER閱讀蛋白，如翻譯起始因子eIF3和YTH蛋白)結(jié)合mRNA的功能[19-20]。Meyer等[21]研究發(fā)現(xiàn)，5′UTR區(qū)具有m6A修飾的mRNA能夠招募eIF3蛋白并增強缺失eIF4E情況下的mRNA翻譯過程。由于在環(huán)境脅迫或疾病情況下eIF4E的表達受抑制，因此，m6A依賴的eIF3蛋白招募在脅迫條件或疾病狀態(tài)下可能至關(guān)重要[22]。盡管有若干關(guān)于eIF3與m6A互作的報道，但eIF3如何識別m6A并與之互作的分子機理研究卻較少。與此相比，另一類m6A結(jié)合蛋白YTH蛋白則已有較為詳盡的研究。本文我們將詳細綜述YTH蛋白在m6A修飾調(diào)控RNA過程中的功能多樣性。

1 多樣化的YTH蛋白

1998年Imai等[23-24]通過酵母雙雜交法篩選TRA-2β(剪切復(fù)合體的組分)的互作蛋白時發(fā)現(xiàn)了第一個YTH蛋白，并將其命名為YT521-B。隨后通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)該蛋白中一段由140個氨基酸組成的區(qū)域在其同源蛋白中高度保守，遂將這一區(qū)域命名為YTH(YT521-B homologs)結(jié)構(gòu)域[25]，而具有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白也隨之被命名為YTH蛋白。由于YTH結(jié)構(gòu)域與RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域RRM具有高度同源性，因此，YTH結(jié)構(gòu)域被認為，可能是新的RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域[25]。通過BLAST比對發(fā)現(xiàn)，幾乎所有生物中均能找到Y(jié)T521-B的同源蛋白或具有YTH結(jié)構(gòu)域的蛋白，但秀麗隱桿線蟲Caenorhabditiselegans除外[26]。

前人對于YTH蛋白的研究主要集中在動物(特別是哺乳動物)中，并將動物YTH蛋白分為3大類：YTHDC1(YTH domain-containing protein 1)、YTHDC2(YTH domain-containing protein)和YTHDF(YTH domain-containing family protein)。除YTH結(jié)構(gòu)域外，三者并無氨基酸序列相似性，蛋白大小和結(jié)構(gòu)域排列也存在明顯差異(圖1)。雖然YTHDC1與YTHDC2名字相似但實際上除都具有YTH結(jié)構(gòu)域外，兩者并無同源關(guān)系。大部分無脊椎動物僅具有1個YTHDF亞家族的同源蛋白，而大部分脊椎動物則具有3個序列高度相似的YTHDF同源蛋白：YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3。與YTHDC2具有多個結(jié)構(gòu)域不同，YTHDF蛋白除C端的YTH結(jié)構(gòu)域外缺乏其他可識別的蛋白結(jié)構(gòu)域，其余部分為一段約350個氨基酸組成的富含P/Q/N的低復(fù)雜度區(qū)域。

圖1 人YTH家族的蛋白結(jié)構(gòu)域

與動物中的情況不同，植物中YTH蛋白的種類變化更為復(fù)雜。首先，通過同源比對發(fā)現(xiàn)植物沒有YTHDC2的同源蛋白。其次，多數(shù)雙子葉植物具有2個以上YTHDC1的同源蛋白，例如擬南芥具有2個，土豆具有4個；相較而言單子葉植物僅具有1～2個YTHDC1的同源蛋白，如水稻僅具有1個。最后，相較YTHDC1，YTHDF同源蛋白在不同植物(特別是被子植物)之間差異更為顯著。雖然2個不同的研究小組都曾對植物YTHDF進行系統(tǒng)發(fā)育分析，并各自將植物YTHDF分為3個分支(Li等將3個分支命名為Group Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ，而Scutenaire等命名為YTHDFA/YTHDFB/YTHDFC)，但2個研究小組對每個分支的組成并不統(tǒng)一[27-28]。通過對動物及植物YTHDF蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，植物YTHDF蛋白與動物YTHDF蛋白的演化互相獨立，植物YTHDF的3個分支與脊椎動物YTHDF1/2/3并無直接的對應(yīng)關(guān)系(未發(fā)表數(shù)據(jù))。除同源性差異外，YTHDF同源蛋白的數(shù)量在不同植物中也有顯著差異，大豆、番茄、玉米等物種分別具有18、4以及16個。模式植物擬南芥和水稻雖然均具有11個YTHDF同源蛋白，但是兩者的YTHDF蛋白并非全部直系同源[25]。植物中存在大量的YTH蛋白暗示植物YTH蛋白的功能可能更為復(fù)雜，有待我們進一步進行研究。

值得注意的是，并非所有YTH蛋白均具有YTH結(jié)構(gòu)域。Devanshi等[29]深入研究不同物種YTHDC2時發(fā)現(xiàn)，盡管在大部分多細胞生物中均可發(fā)現(xiàn)YTHDC2的直系同源基因，但部分生物(哺乳動物鴨嘴獸，部分鳥類、兩棲類和爬行動物，果蠅以及線蟲)的YTHDC2顯然缺少了YTH結(jié)構(gòu)域。這一研究結(jié)果暗示YTHDC2蛋白可能逐漸不再依賴YTH結(jié)構(gòu)域行使其生物學(xué)功能。

2 YTH蛋白識別m6A的分子機理研究

2.1 YTH蛋白結(jié)合特定m6A修飾模塊

由于YTH結(jié)構(gòu)域與RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域RRM具有高度同源性，YTH結(jié)構(gòu)域被認為同樣具有RNA結(jié)合活性[25]。通過交聯(lián)免疫沉淀技術(shù)(CLIP)研究細胞內(nèi)YTH蛋白的結(jié)合靶標時發(fā)現(xiàn)，大部分哺乳動物YTH蛋白能夠與RNA上某個含有m6A修飾的特定模塊相結(jié)合[15,18,28]。

迄今為止，大量研究數(shù)據(jù)顯示動物YTHDF蛋白主要結(jié)合在DR[m6A]CH(D=A/G/U，R=A/G，H=A/C/U)模塊上[30]，且這一結(jié)果與通過meRIP方法測序獲得的動物細胞內(nèi)m6A的分布情況一致[31]。早期研究認為，哺乳動物YTHDF1和YTHDF2結(jié)合于不同的m6A修飾位點上，其重疊部分僅占所有測序位點的60%[32]。但Patil等[32]研究顯示，哺乳動物不同YTHDF蛋白在轉(zhuǎn)錄組上結(jié)合位點的分布與m6A在mRNA上的分布情況完全一致，由此推斷哺乳動物YTHDF蛋白對m6A修飾位點的結(jié)合并無偏好性。這一相反結(jié)論可能是由于2項研究采用了不同的方式對CLIP數(shù)據(jù)進行分析。早期研究更關(guān)注于不同YTHDF蛋白結(jié)合于哪些位點，因此，通過生物信息學(xué)方法僅對出現(xiàn)頻率高于閾值的結(jié)合位點進行統(tǒng)計。然而這一方法對于閾值附近的結(jié)果如何取舍具有一定的隨機性。Patil等[17]的研究則更傾向于關(guān)注每個m6A位點上結(jié)合的YTHDF蛋白的頻率是否相近，并認為對于每個位點而言YTHDF1/2/3蛋白具有高度相似的結(jié)合比例。綜上所述，不同YTHDF蛋白對于具有m6A修飾的RNA并無選擇偏好性。

與動物YTHDF類似，動物YTHDC1與YTHDC2也主要與DRACH(D=A/G/U，R=A/G，H=A/C/U)模塊結(jié)合，但與YTHDF蛋白不同的是YTHDC1定位于細胞核中[30]，因此，YTHDC1更傾向于結(jié)合ncRNA，特別是XIST[17]。而對于大部分m6A位點而言，除在特定條件下或特定類型細胞內(nèi)，YTHDC2并無m6A結(jié)合能力[17]，這一結(jié)果與部分物種的YTHDC2蛋白丟失YTH結(jié)構(gòu)域相佐證。

雖然植物具有更多YTH同源蛋白，但對植物YTH蛋白的結(jié)合模塊研究較少。在研究擬南芥YTHDF蛋白ECT2(Evolutionary Conserved C-Terminal Region 2)的結(jié)合模塊時發(fā)現(xiàn)，ECT2主要結(jié)合在URUAY(R=G>A，Y=U>A)模塊上[33-34]。但對擬南芥莖、葉片及花器官中m6A修飾位點的研究揭示擬南芥m6A修飾位點主要為RR[m6A]CH(R=A/G，H=A/C/U)[35]，與動物中的m6A修飾位點相近，而與ECT2的結(jié)合模塊不同。這2項相悖的研究結(jié)果是否說明其中一方的研究結(jié)果存在缺陷呢？值得注意的是，除經(jīng)典的RRACH模塊外，植物m6A修飾位點還存在其他類型。水稻愈傷組織中m6A修飾主要分布在RAGRAG(R=A/G)模塊上[36]，而水稻葉片及玉米幼苗的m6A修飾則主要集中在UGUAMM(M=A/C)模塊上[31,36]，其中UGUAMM模塊與ECT2結(jié)合的URUAY模塊具有一定程度的相似性。這些研究結(jié)果表明，在植物的不同組織中m6A修飾位點不同。結(jié)合植物中普遍存在較多YTH同源蛋白，我們推測植物YTH蛋白可能結(jié)合于不同的m6A修飾位點上并行使差異化的功能。

對擬南芥ECT2結(jié)合模塊(URUAY)進一步研究發(fā)現(xiàn)，該模塊位于Poly(A)位點上游30～150堿基處，且包含多聚腺苷酸化相關(guān)的UGUA序列，ECT2通過結(jié)合URUAY模塊啟動多聚腺苷酸化并維持靶標mRNA穩(wěn)定性[34]，這一結(jié)果與動物YTHDF2誘導(dǎo)mRNA降解正好相反，進一步使我們猜測植物YTHDF蛋白可能發(fā)揮與動物并不相同的生理生化功能。

m6A修飾不僅存在于mRNA和ncRNA，也存在于18S和28S rRNA，那么YTH蛋白是否結(jié)合18S或28S rRNA上的m6A呢？rRNA上的m6A修飾位于一種A-m6A-C模塊序列中[37]，iCLIP結(jié)果顯示沒有一個YTH蛋白結(jié)合在這些位點上[30]。近期對于人類核糖體結(jié)構(gòu)的研究表明，18S和28S rRNA中的m6A位點均被包埋在核糖體亞基內(nèi)部[38]。因此，iCLIP實驗所顯示的YTH蛋白不與rRNA m6A結(jié)合這一結(jié)果可能與YTH蛋白無法接觸這些位點有關(guān)。

2.2 YTH蛋白結(jié)合m6A修飾的RNA的能力和模式

體外實驗證明YTH結(jié)構(gòu)域能夠通過結(jié)合m6A進一步與RNA結(jié)合[19]。雖然關(guān)于YTH結(jié)構(gòu)域和m6A修飾的RNA結(jié)合能力的研究結(jié)果不盡相同(部分研究認為其結(jié)合濃度需達到100～300 nmol，而使用YTHDF2的YTH結(jié)構(gòu)域進行的RNA結(jié)合能力實驗僅需1～3 μmol)，但相較需要5～10倍濃度才能與YTH結(jié)構(gòu)域結(jié)合的未被甲基化的RNA，m6A修飾的RNA的確具有更強的YTH結(jié)構(gòu)域結(jié)合能力[39-44]。與大部分僅需較低濃度(nmol級)即可結(jié)合的特異性RNA結(jié)合蛋白相比[45]，YTH結(jié)構(gòu)域結(jié)合m6A修飾的RNA的能力并不強，這說明YTH結(jié)構(gòu)域可能并不能獨自與靶標RNA形成穩(wěn)定的復(fù)合體，而是需要N端低復(fù)雜度區(qū)域序列輔助參與蛋白-RNA的互作。

3個獨立研究小組分別研究了釀酒酵母(Zygosaccharomycesrouxii)甲基化RNA結(jié)合蛋白1(MRB1)、人源YTHDC1及YTHDC2與具有m6A修飾的RNA形成復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)[39-41,46]，結(jié)果表明，MRB1、YTHDC1及YTHDC2的YTH結(jié)構(gòu)域使用了一套相似且保守的m6A識別機制，即m6A的甲基部分被由1個酪氨酸和2個色氨酸組成的芳香族籠狀結(jié)構(gòu)識別(圖2)，腺嘌呤本身并不與3個氨基酸中的任何1個發(fā)生互作[39]。隨后2個YTHDF蛋白(YTHDF1[42]及YTHDF2[43-44])的晶體結(jié)構(gòu)相繼報道，研究結(jié)果顯示，兩者的芳香族籠狀結(jié)構(gòu)與YTHDC1或YTHDC2略有不同，是由3個色氨酸組成，但同樣能夠識別N6-甲基基團。此后在對多個物種的YTH結(jié)構(gòu)域比較后發(fā)現(xiàn)，組成籠狀結(jié)構(gòu)的這3個芳香族氨基酸在不同物種中高度保守[30]。

圖示為釀酒酵母MRB1的YTH結(jié)構(gòu)域部分結(jié)構(gòu)，組成芳香族籠狀結(jié)構(gòu)的酪氨酸和色氨酸以球棍模型表示，3個氨基酸共同形成籠狀疏水區(qū)域，結(jié)合m6A位點上的甲氨基團，m6A中的嘌呤環(huán)并不參與疏水互作。

值得注意的是裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)Mmi1蛋白是個例外，Mmi1蛋白雖然具有YTH結(jié)構(gòu)域及芳香族籠狀結(jié)構(gòu)，卻并不與m6A結(jié)合，而是結(jié)合1個未甲基化的RNA模塊DSR(the determinant of selective removal motif，UUAAAC)[47]。而且，在DSR模塊上添加m6A修飾并不會增強兩者的結(jié)合能力，甚至在一些研究結(jié)果中反而降低了兩者的結(jié)合能力。對Mmi1-DSR復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)研究顯示Mmi1與RNA的結(jié)合面不同于典型YTH蛋白-RNA結(jié)合面，而是位于另一區(qū)域[47]。因此，Mmi1與未甲基化的RNA結(jié)合并不需要芳香族籠狀結(jié)構(gòu)的參與。

3 YTH家族的功能研究

3.1 YTH蛋白的分子生物學(xué)功能

m6A修飾最為廣泛常見的分子生物學(xué)功能是起始mRNA翻譯和介導(dǎo)mRNA降解[48]。除此之外，Patil等[30]認為,m6A以及YTH蛋白還能夠調(diào)節(jié)可變剪切或基因組沉默等分子生物學(xué)過程(圖3)。

A—通過招募SRSF10及磷酸化的SRSF3，YTHDC1啟動特定mRNA前體剪切；B—YTHDC1結(jié)合XIST上的m6A誘導(dǎo)X染色體沉默；C—YTHDC1通過招募未磷酸化的SRSF3促進RNA向核外轉(zhuǎn)運；D—YTHDF1通過與mRNA終止密碼子及3′UTR區(qū)域附近的m6A結(jié)合，并招募eIF3及其他翻譯起始元件從而調(diào)控翻譯過程；E—YTHDF3通過與YTHDF1互作增強YTHDF1介導(dǎo)的翻譯起始；F—YTHDF3引導(dǎo)m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本與YTHDF2結(jié)合，進入RNA降解途徑；G—YTHDF2與m6A結(jié)合并招募CCR4/CAF/NOT復(fù)合體使m6A修飾的mRNA發(fā)生脫腺苷化并降解。

3.1.1 YTH蛋白調(diào)控可變剪切

在被定義為m6A結(jié)合蛋白之前，YTHDC1最初被認為是啟動外顯子包含過程的調(diào)控因子[49]，而YTH結(jié)構(gòu)域?qū)τ谛惺惯@一功能是必要的[48]。基于目前對YTH結(jié)構(gòu)域的理解，YTHDC1對于mRNA剪切的調(diào)控依賴于與m6A的結(jié)合[49]。近期的研究顯示YTHDC1通過招募2種競爭性mRNA剪切因子SRSF3(serine/arginine-rich splicing factor 3)和SRSF10行使其功能[47]。YTHDC1與磷酸化的SRSF3結(jié)合會啟動外顯子包含過程[48]，而與SRSF10的結(jié)合則啟動外顯子跳躍過程(圖3 A)。但是關(guān)于m6A直接參與調(diào)控可變剪切的證據(jù)仍不充分。在METTL3干擾材料中，僅有不足100個含有m6A的外顯子發(fā)生了可變剪切[19]。不僅如此，分析METTL3-/-老鼠胚胎干細胞中m6A介導(dǎo)的剪切情況時發(fā)現(xiàn)，僅有不足0.5%的外顯子表現(xiàn)出了可變剪切，而其中不足100個外顯子具有m6A位點[5,50]。

雖然哺乳動物細胞中m6A可能并不會影響全部mRNA可變剪切，但在果蠅(Drosophila)中已有確切的報道表明，m6A通過調(diào)控Sxl(sex-lethal)的可變剪切影響性別特異性基因的表達[14-16]。果蠅的性別決定過程與Sxl蛋白有關(guān)，當全長且具有生物學(xué)活性的Sxl蛋白存在時，子代表現(xiàn)為雌性果蠅，而當Sxl無法成功翻譯全長蛋白時則為雄性果蠅。果蠅Sxl轉(zhuǎn)錄本的第二外顯子中含有1個可提前終止Sxl蛋白翻譯的終止密碼子，因此，雄性果蠅的Sxl基因在翻譯過程中提前終止，無法翻譯出全長Sxl蛋白，最終表現(xiàn)為雄性果蠅。而在雌性果蠅中，第二外顯子內(nèi)的m6A修飾能夠招募YT521-B(果蠅YTHDC1的直系同源基因)對Sxl轉(zhuǎn)錄本進行可變剪切，從而在mRNA成熟過程中剪切掉含有終止密碼子的外顯子，最終翻譯出全長Sxl蛋白序列。m6A的缺失會阻斷Sxl轉(zhuǎn)錄本的外顯子跳躍過程，導(dǎo)致子代中雄性果蠅的數(shù)量增加。過表達YT521-B對雄性果蠅而言是致死的[15]，推測可能是因為過量表達YT521-B產(chǎn)生了類似雌性果蠅Sxl轉(zhuǎn)錄本類型，最終抑制了雄性果蠅中msl-2(male-specific lethal 2)基因的表達，導(dǎo)致雄性果蠅中出現(xiàn)異常X染色體劑量補償效應(yīng)。因此，在果蠅中m6A能夠通過招募YT521-B直接引發(fā)特定基因的可變剪切事件。

3.1.2 YTH蛋白介導(dǎo)mRNA外運過程

在海拉細胞系中，YTHDC1介導(dǎo)m6A修飾的mRNA外運過程。YTHDC1首先與m6A結(jié)合，進一步與m6A修飾所在的mRNA結(jié)合形成mRNA-蛋白復(fù)合體(mRNPs)，該復(fù)合體招募未磷酸化的SRSF3和外運受體蛋白NXF1[51](圖3中C)。值得注意的是SRSF3的磷酸化狀態(tài)似乎與其行使的功能有關(guān)，YTHDC1與磷酸化的SRSF3結(jié)合啟動外顯子包含過程，而與未磷酸化的SRSF3結(jié)合則引發(fā)mRNA外運[51]。

3.1.3 YTH蛋白影響RNA降解過程

在哺乳動物中，YTHDF2作為m6A閱讀蛋白之一能夠誘導(dǎo)mRNA的降解。在海拉細胞系中，YTHDF2解碼2 000種以上mRNA中的m6A編碼，而敲除YTHDF2會引起這些mRNA含量顯著上升，因此認為，YTHDF2與具有m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性有關(guān)[20]。而這些受YTHDF2調(diào)控的mRNA的穩(wěn)定性與其3′端的多聚腺苷化程度呈正相關(guān)，即相比其他mRNA，與YTHDF2結(jié)合的mRNA普遍表現(xiàn)出較短的多聚腺苷酸尾部[20]。體外實驗發(fā)現(xiàn)METTL3甲基轉(zhuǎn)移酶缺失時去腺苷化水平顯著降低，這說明YTHDF2調(diào)控m6A修飾的mRNA穩(wěn)定性與m6A修飾直接相關(guān)。TFA(Tethering reporter assay)實驗還證明YTHDF2的N端結(jié)構(gòu)域?qū)θハ佘栈瘶O為重要[52]。綜上所述，YTHDF2首先通過YTH結(jié)構(gòu)域結(jié)合于m6A上，隨后其N端結(jié)構(gòu)域與CNOT1的SH(superfamily homolog)結(jié)構(gòu)域互作，并招募CCR4/CAF/NOT復(fù)合體行使去腺苷化功能[52](圖3中G)。早期研究認為，YTHDF2引導(dǎo)mRNA離開多聚核糖體進入p小體(富含mRNA-蛋白(mRNP)復(fù)合體，也包含mRNA降解因子，可能是mRNA的降解中心)，最終促進mRNA降解[20]。然而近期的研究似乎并不支持這一觀點，Hubstenberger等[53]在p小體中幾乎未觀察到顯著的mRNA降解事件，p小體更可能是作為mRNPs的儲存及分揀中心。這一相悖結(jié)果使得我們需要重新考慮YTHDF2介導(dǎo)mRNA進入p小體的重要性。

另外，YTHDF1和YTHDF3也能影響具有m6A修飾的mRNA的穩(wěn)定性。例如在海拉細胞系中，YTHDF1和YTHDF3引導(dǎo)m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本與YTHDF2結(jié)合，進入RNA降解途徑(圖3中F)[26]。然而有趣的是，過表達YTHDF1蛋白24 h后，細胞中m6A/A比值不僅沒有下降，反而上升了24%，推測可能是由于YTHDF1結(jié)合m6A修飾的mRNA引導(dǎo)其進入翻譯過程(圖3中D)起到了保護mRNA不被降解的作用[32]。

除mRNA外，YTH蛋白同樣能夠影響其他類型RNA的穩(wěn)定性。人源YTHDF2能夠與上千種環(huán)形內(nèi)源RNA(circRNA)結(jié)合[26]。circRNA是RNA前體經(jīng)過反向剪接內(nèi)部重復(fù)序列形成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)RNA。這些circRNA能夠中和miRNA的功能或阻止RNA與蛋白的結(jié)合[26]。在敲除YTHDF2的細胞里，circRNA前體的半衰期遠遠短于其他類型的m6A修飾轉(zhuǎn)錄本。此外，m6A修飾并不影響成熟circRNA的穩(wěn)定性。這些結(jié)果說明YTHDF2可能通過影響circRNA成熟過程或前體的穩(wěn)定性來調(diào)控circRNA[54]。盡管如此，YTHDF2調(diào)控circRNA穩(wěn)定性是否依賴于m6A修飾的腺苷酸殘基仍有待探討。

3.1.4 YTH蛋白影響RNA翻譯過程

除影響RNA穩(wěn)定性外，哺乳動物YTHDF1能夠解碼m6A修飾并在特定細胞類型或特定環(huán)境條件下影響靶標轉(zhuǎn)錄本的翻譯過程[32,55]。在海拉細胞系中，YTHDF1能夠結(jié)合某些mRNA終止密碼子及3′UTR區(qū)域附近的m6A，并與48S翻譯起始復(fù)合體中的eIF3(eukaryotic initiation Factor 3)互作，進一步招募其他翻譯起始復(fù)合體成員及核糖體，從而提高翻譯效率(圖3中D)[32]。

最近的研究顯示，其他YTHDF蛋白結(jié)合到報告基因的RNA上也會增強報告基因的翻譯[56]。Shi等[57]發(fā)現(xiàn)，在海拉細胞系中YTHDF3通過與YTHDF1協(xié)作，促進60%的YTHDF1目標蛋白翻譯，但YTHDF3既不能直接促進翻譯也不能獨自行使該功能。另一關(guān)于YTHDF3蛋白的研究也發(fā)現(xiàn)，YTHDF3不能獨自起始報告基因的翻譯，但YTHDF3的缺失會降低YTHDF1和YTHDF2對目標RNA的結(jié)合能力，同時YTHDF3還能促進YTHDF1起始的蛋白翻譯過程[58]。因此，YTHDF3能通過增強YTHDF1與RNA的特異性結(jié)合從而間接提高m6A依賴的翻譯效率(圖3中E)。具有m6A修飾的circRNA的翻譯過程則完全不依賴YTHDF1，但YTHDF3是必需的。YTHDF3通過招募直接結(jié)合于IRES(internal ribosome entry sites)上的eIF4G2，起始不依賴eIF4E的翻譯過程[54]。除了YTHDF1/3之外，在鼠睪丸細胞和肝癌細胞中，YTHDF2也參與翻譯調(diào)控過程[59-60]。體外TFA實驗證明，YTHDC2降低報告基因表達的同時，卻能誘導(dǎo)報告基因的翻譯。

植物YTH蛋白同樣能夠參與類似過程的調(diào)控。擬南芥YTHDF蛋白ECT2定位于細胞核及細胞質(zhì)中，組學(xué)研究表明ECT2同樣與RNA翻譯及降解過程有關(guān)，但具體機理仍不清楚。在脅迫條件(主要是熱脅迫及鹽脅迫)下，ECT2和ECT4重新定位于脅迫小體中(類似動物的p小體，主要負責mRNP復(fù)合體的儲存與分揀)，部分與翻譯相關(guān)因子共定位，這說明ECT2和ECT4可能與脅迫響應(yīng)下的翻譯下調(diào)過程有關(guān)[34]。與ECT2/4相比，ECT3并未出現(xiàn)這種類型的重新定位，可能是由于ECT3缺失了ECT2/4中富含YPQ的區(qū)域，在動物YTHDF蛋白中也發(fā)現(xiàn)了這一類似區(qū)域的存在。

3.1.5 YTH蛋白參與調(diào)控表觀遺傳組

核非編碼RNA(ncRNA)XIST通過包被X染色體并招募染色質(zhì)修飾因子(chromatin-modifying factors)隨機沉默1條X染色體，因此，在雌性哺乳動物的X染色體沉默(XCI)中扮演著重要角色[61]。XIST至少有76個m6A修飾，YTHDC1通過結(jié)合XIST上的m6A從而調(diào)控XIST的活性。從胚胎干細胞中移除m6A修飾能夠阻斷XIST介導(dǎo)的X染色體基因沉默[17]，同樣缺失YTHDC1也能阻斷XIST介導(dǎo)的X染色體沉默過程，且該表型能被外源添加的YTHDC1-XIST復(fù)合體恢復(fù)[17]。因此，YTHDC1通過結(jié)合XIST的m6A位點誘導(dǎo)X染色體沉默的發(fā)生(圖3中B)。

Wu等[62]研究發(fā)現(xiàn)，YTHDF2能夠促進KDM6B的降解，而后者則能夠促進多種促炎細胞因子上的H3K27me3去甲基化過程并增強促炎細胞因子的表達。同時H3K27me3也能抑制轉(zhuǎn)錄過程中腺苷酸上的甲基化過程，KDM6B通過招募m6A甲基轉(zhuǎn)移酶從而移除靶標基因附近的H3K27me3修飾，并促進新轉(zhuǎn)錄出來的mRNA上的m6A修飾。這些結(jié)果證明在病毒侵染過程中，m6A與組蛋白甲基化存在某種程度上的互作，并共同行使功能。

綜上所述，哺乳動物的YTH蛋白具有相似的分子生物學(xué)功能，但其功能是否冗余或是各有分工還需要進一步研究驗證。那么植物中數(shù)量眾多的YTH蛋白的分子生物學(xué)功能又是什么，相互之間是否冗余？這些問題仍有待進一步研究。

3.2 YTH蛋白的細胞學(xué)及生理學(xué)功能

3.2.1 性別決定及生殖系統(tǒng)發(fā)育

在小鼠中，YTHDC1對于生殖系統(tǒng)發(fā)育至關(guān)重要。在雄性小鼠中抑制YTHDC1的活性會導(dǎo)致精原細胞發(fā)育受阻，而在卵母細胞中缺失YTHDC1會引起上千種轉(zhuǎn)錄本發(fā)生可變剪切，多聚腺苷酸尾部及3′UTR區(qū)域長度改變，最終阻斷卵母細胞成熟，說明YTHDC1對兩性生殖細胞發(fā)育都非常重要。在果蠅中，YTHDC1的同源基因YT521-B通過改變下游基因Sxl轉(zhuǎn)錄本的可變剪切影響子代果蠅的性別[15]。

YTHDC2在哺乳動物生殖細胞中表達量較高，同樣對于雌雄兩性發(fā)育起著重要作用[26]。YTHDC2缺陷型小鼠雖然能夠存活，但不論是雄性小鼠或是雌性小鼠均表現(xiàn)為不育，同時睪丸和卵巢發(fā)育較正常小鼠更小，這些生殖細胞發(fā)育缺陷是由減數(shù)分裂缺陷引起的。YTHDC2缺陷型小鼠的生殖細胞形成過程在減數(shù)分裂前期I受阻，產(chǎn)生大量異常減數(shù)分裂的中期細胞，最終提早進入細胞凋亡過程[63-66]。這些表型與MEIOC(Meiosis specific with Coiled-coil domain)缺陷型小鼠相似，后者可以與YTHDC2直接互作。在雄性或雌性生殖細胞中，YTHDC2與MEIOC共同下調(diào)一系列編碼有絲分裂調(diào)節(jié)因子的mRNA，同時啟動減數(shù)分裂相關(guān)基因表達[63-64]，值得注意的是，這些被下調(diào)的mRNA均富含m6A修飾，這說明YTHDC2可能通過結(jié)合m6A修飾負調(diào)控其目標基因。

3.2.2 干細胞維持與分化

Zhang等[67]研究斑馬魚甲基轉(zhuǎn)移酶METTL3時發(fā)現(xiàn)，該基因?qū)υ煅杉毎?祖細胞分化過程至關(guān)重要，而YTHDF2識別notch1α上的m6A修飾并使之降解，從而抑制內(nèi)皮Notch信號通路，最終促進造血干細胞/祖細胞的分化。同樣在小鼠中，YTHDF2能夠結(jié)合多潛能基因的轉(zhuǎn)錄本，而這些轉(zhuǎn)錄本在缺失METTL3的情況下穩(wěn)定性提高。YTHDF2與這些mRNA的結(jié)合開啟胚胎干細胞的“超多能”狀態(tài)，阻斷其分化[68]。在肺癌研究中發(fā)現(xiàn)YTHDF2通過結(jié)合6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶3′UTR區(qū)的m6A修飾，從而促進6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶的翻譯過程并進一步促進肺癌的發(fā)生[11]。同時YTHDF2還能通過促進IL11(白細胞介素11)及SERPINE2的mRNA降解從而促進炎癥反應(yīng)介導(dǎo)的肝癌產(chǎn)生[69]。

在擬南芥中，去甲基化突變體表現(xiàn)出多種表型，包括胚發(fā)育停滯、生長抑制、莖尖分生組織異常、根系發(fā)生減少及向地性異常等[70-72]。體外和體內(nèi)實驗均證明擬南芥ECT2能夠直接結(jié)合m6A修飾的RNA，且ECT2和ECT3均與葉片發(fā)生及發(fā)育有關(guān)[73]。然而，ECT2/3/4的任何1個單基因突變體并不會表現(xiàn)出顯著的葉片發(fā)育缺陷表型，而三突突變體的葉原基中細胞分裂速率受抑制并表現(xiàn)出類似于去甲基化突變體的葉片表型[70,73-74]。這說明擬南芥中ECT2/3/4基因?qū)τ谝蕾噈6A修飾的葉片發(fā)育調(diào)控過程可能是冗余的。除了參與葉片發(fā)育過程，ECT2和ECT3蛋白還與表皮毛狀體發(fā)育有關(guān)。毛狀體是一種生長于葉片上皮的伸長枝狀單細胞，是表皮原細胞停止有絲分裂轉(zhuǎn)而發(fā)生多次核內(nèi)復(fù)制(細胞僅復(fù)制不分裂)過程的產(chǎn)物。核內(nèi)復(fù)制的次數(shù)直接決定了分枝的數(shù)量，正常的成熟毛狀體一般具有3個分枝。單獨缺失ECT2或ECT3功能的擬南芥突變體表現(xiàn)出類似的毛狀體數(shù)量及分支增加的表型，而在ect2/3雙突變體中該表型則更為嚴重，說明ECT2和ECT3在毛狀體發(fā)育過程中并非完全冗余[27]。在ect2單突變體中，ECT2功能的缺失引起至少3個與毛狀體發(fā)生相關(guān)的具有m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本發(fā)生快速降解或表達下調(diào)，造成表皮原細胞核內(nèi)復(fù)制增加1次，產(chǎn)生具有更多分枝的毛狀體[27,34]，但ECT2和ECT3調(diào)控表皮毛狀體發(fā)育的完整分子機理仍有待進一步研究。

3.2.3 神經(jīng)發(fā)育

在小鼠中，YTHDF1對于周圍坐骨神經(jīng)損傷后軸突再生過程是必需的，而在去甲基化突變體中也能觀察到與YTHDF1缺陷個體相同的表型。這一結(jié)果說明，圍繞m6A-YTHDF1行使的功能對周圍神經(jīng)系統(tǒng)創(chuàng)傷反應(yīng)非常重要[55]。不僅如此，YTHDF1能夠響應(yīng)神經(jīng)刺激，并促進海馬體中神經(jīng)元細胞內(nèi)m6A修飾的mRNA的表達，從而影響成年老鼠的學(xué)習及記憶能力[75]。

敲除初代培養(yǎng)的神經(jīng)元細胞m6A閱讀蛋白會引起突觸傳導(dǎo)障礙并產(chǎn)生不成熟的樹突棘[13]，沉默YTHDF3使軸突終末分支數(shù)量增多、PSD-95簇數(shù)量減少、AMPA受體表達降低。由此猜測神經(jīng)元細胞末梢中的YTH蛋白與所處區(qū)域的m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本互作并發(fā)揮功能，從而產(chǎn)生強烈的突觸反應(yīng)。此外還發(fā)現(xiàn)YTHDF1能夠調(diào)控APC基因的翻譯過程，而后者與神經(jīng)元形態(tài)及神經(jīng)發(fā)育有關(guān)。

除YTHDF外，其他YTH蛋白同樣與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)。與果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中高水平存在的m6A修飾mRNA一致，果蠅神經(jīng)系統(tǒng)中YT521-B(YTHDC1的同源基因)同樣高表達。YT521-B或Ime4缺陷的果蠅表現(xiàn)出飛行或爬行功能缺陷[14-16]。同時人類基因組計劃也發(fā)現(xiàn)YTHDC2的突變是自閉癥譜系障礙的潛在風險因子之一[76]。綜上所述，YTH蛋白對動物神經(jīng)發(fā)育、運動、學(xué)習及記憶起著至關(guān)重要的作用。

3.2.4 脅迫響應(yīng)

YTH蛋白在脅迫響應(yīng)中發(fā)揮功能。當溫度升高時，熱休克相關(guān)轉(zhuǎn)錄本的5′UTR端會發(fā)生甲基化修飾，細胞質(zhì)定位的YTHDF2進入細胞核中，與熱休克基因mRNA上5′UTR區(qū)域的m6A位點結(jié)合從而保護該m6A位點。之后YTHDF2招募eIF3復(fù)合體并啟動不依賴于帽結(jié)構(gòu)的翻譯過程[21, 77]。這一過程可能在其他類型的脅迫反應(yīng)中也存在。此外，在熱脅迫下m6A依賴的circRNA的翻譯水平也顯著升高。當細胞受到紫外線照射時，mRNA 5′UTR區(qū)域的m6A水平同樣會顯著升高，但這些m6A修飾以及其閱讀蛋白的功能和作用機理仍未研究清楚[54,78]。

3.2.5 硝酸鹽網(wǎng)絡(luò)調(diào)控

CPSF30-L是擬南芥YTH蛋白家族的一員，具有典型的DC類型YTH結(jié)構(gòu)域和CCCH類型鋅指結(jié)構(gòu)域。近期研究顯示CPSF30-L能夠調(diào)控硝酸鹽吸收、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、積累、內(nèi)部運輸及同化過程[79]。在硝酸鹽調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，CPSF30-L調(diào)控數(shù)個硝酸鹽響應(yīng)基因的表達，特別是硝酸鹽轉(zhuǎn)運蛋白NRT1.1。位于CPSF30-L第3個鋅指結(jié)構(gòu)域的點突變會引起NRT1.1表達水平降低和其3′UTR區(qū)域多聚腺苷酸長度縮短，硝酸鹽同化基因表達升高，并且植株硝酸鹽吸收量減少，根系硝酸鹽還原反應(yīng)增強、氨基酸含量增加[79]。這一表型只能由全長CPSF30-L蛋白來恢復(fù)，不具有YTH結(jié)構(gòu)域的CPSF30-S則不能，這說明YTH結(jié)構(gòu)域?qū)PSF30-L在硝酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程中至關(guān)重要，但該過程是否與m6A修飾有關(guān)仍有待探索。

4 小結(jié)與展望

從2012年發(fā)現(xiàn)m6A閱讀蛋白至今，科研工作者們已經(jīng)對m6A閱讀蛋白在細胞內(nèi)的功能進行了大量研究，包括維持正常的細胞活性和促進生殖、生長及發(fā)育過程等。YTH蛋白是m6A閱讀蛋白中最為廣泛研究的成員。從先前的研究中我們已經(jīng)能夠了解到Y(jié)TH蛋白通過YTH結(jié)構(gòu)域形成的芳香族籠狀結(jié)構(gòu)結(jié)合m6A的甲基基團并進一步與RNA結(jié)合，從而調(diào)控RNA的成熟、定位、翻譯及降解等過程，最終影響生物體干細胞的維持與分化、生殖系統(tǒng)發(fā)育、神經(jīng)發(fā)育和逆境響應(yīng)等一系列過程。然而現(xiàn)有的研究主要還是以動物(特別是哺乳動物細胞系)YTH蛋白為模型，因此，對于YTH蛋白的功能研究仍有許多問題留待我們解決。

對于YTHDF蛋白而言，一個重要的問題就是這些蛋白的功能是冗余的還是分化的。YTHDF1與YTHDF2能夠?qū)ν粋€轉(zhuǎn)錄本上的m6A修飾競爭性結(jié)合，并產(chǎn)生截然相反的作用——啟動翻譯或降解mRNA。YTHDF蛋白之間也能夠合作，在海拉細胞系中YTHDF3與YTHDF1或YTHDF2結(jié)合，輔助后者發(fā)揮功能。近期Li等[80]通過X晶體衍射等方法發(fā)現(xiàn)YTHDF1/2/3具有相似的與m6A互作模式，認為三者在細胞學(xué)功能上存在冗余性。在擬南芥中，ECT2和ECT3均對表皮毛狀體形態(tài)建成至關(guān)重要，任何一個基因單獨突變都會引起毛狀體分支及數(shù)量改變，雙突變體則表現(xiàn)出更為嚴重的毛狀體發(fā)育缺陷。這些研究結(jié)果說明至少在一些特定發(fā)育過程中YTHDF蛋白并非完全冗余。然而就葉片發(fā)育角度而言，ECT2/3/4的任何一個基因的單突變體均沒有顯著的表型，僅在三突突變體中能夠觀察到類似去甲基化突變體的葉片形態(tài)，因此，在某些過程中YTHDF蛋白的功能似乎又存在冗余性。與哺乳動物僅具有YTHDF1/2/3 3個成員不同，植物YTHDF亞家族數(shù)量更多，親緣關(guān)系更為復(fù)雜，此前的研究將植物YTHDF亞家族分為3個分支[27-28]，且不同植物物種在每個分支內(nèi)部又存在數(shù)量不等的YTHDF同源蛋白，分支內(nèi)同源蛋白之間是否存在功能冗余，分支間功能是否冗余？這些問題值得進一步在植物體內(nèi)驗證。

此外，YTH蛋白是否均通過與m6A結(jié)合行使功能也有待證實。在動物細胞中，YTHDC2定位于細胞質(zhì)中并受腫瘤壞死因子α的誘導(dǎo)[29,81]，推測YTHDC2可能在一些特定的細胞類型中受外界刺激調(diào)控。利用自身的解旋酶結(jié)構(gòu)域，YTHDC2解旋缺氧誘導(dǎo)因子1α(HIF1-α)的5′UTR區(qū)，增強其翻譯效率[59]，但該過程是否與m6A有關(guān)仍未知。此外，YTHDF2通過結(jié)合核糖體RNA上的m5C從而促進rRNA成熟[82]，而YTHDF3則通過結(jié)合IGF1R轉(zhuǎn)錄本上的m1A并下調(diào)IGF1R的表達，從而抑制滋養(yǎng)層細胞浸潤過程[83]。不僅如此，擬南芥YTHDC1的同源基因CPSF30-L參與硝酸鹽代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控過程，該功能需要YTH結(jié)構(gòu)域的參與，但是否需要m6A修飾的直接結(jié)合仍有待進一步證據(jù)證實。這些結(jié)果揭示YTH蛋白可能能夠通過m6A以外的途徑行使功能。

除了研究YTH蛋白的功能，對于“YTH蛋白是如何被調(diào)控的”這一問題仍知之甚少。YTHDF蛋白可能在不同組織類型或特定信號響應(yīng)中受不同的調(diào)控。磷酸化蛋白組學(xué)研究揭示在YTHDF蛋白的富P/Q/N區(qū)域和YTH結(jié)構(gòu)域附近存在大量磷酸化位點[84]。因此，YTHDF蛋白的翻譯后修飾可能影響了LLPS(liquid-liquid phase separation)形成過程中YTHDF介導(dǎo)的蛋白成簇互作。除了磷酸化修飾，YTHDF蛋白還具有酰基化修飾[85]。然而YTHDF蛋白上翻譯后修飾的改變是否受到了外源或內(nèi)源刺激的誘導(dǎo)仍有待進一步研究。如果確實存在外界刺激誘導(dǎo)，那么這些翻譯后修飾的YTH蛋白如何與其他蛋白或mRNA互作以及這些修飾如何影響YTH蛋白的亞細胞定位，這些問題都有待研究。至今為止，沒有一條信號通路直接調(diào)控m6A，因此，任何關(guān)于YTH蛋白如何受到信號調(diào)控的信息都將拓展我們對于m6A調(diào)控機制的了解。

對m6A修飾的研究，特別是對m6A閱讀蛋白YTH的研究雖然開展時間較短，但作為一種轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制，m6A修飾的分子機理研究正逐漸體現(xiàn)出其必要性及潛在應(yīng)用價值。在許多疾病中，例如病毒侵染和不同類型的癌癥，m6A扮演了非常重要的角色[56,86-93]。因此，研究者逐漸對開發(fā)針對m6A修飾復(fù)合體的小分子抑制劑或m6A競爭性結(jié)合小分子產(chǎn)生了新的研究興趣。同樣，深入研究植物(特別是農(nóng)作物)中數(shù)量眾多的YTH蛋白分子作用機理，回答其是如何影響作物生長發(fā)育并響應(yīng)外界環(huán)境變化這一問題，對于精確調(diào)控作物生長，最終提高作物產(chǎn)量、減少化學(xué)肥料及農(nóng)藥使用至關(guān)重要?？偠灾?，深入研究m6A閱讀蛋白為發(fā)掘表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)在藥物研發(fā)、作物育種等領(lǐng)域中的應(yīng)用價值奠定理論基礎(chǔ)。