分子標(biāo)記輔助選育攜帶抗稻瘟病基因Pigm的光溫敏不育系

李友發(fā)，張馨月，錢秋，劉江寧，富昊偉，汪慶*

(1.嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 嘉興 314016；2.無錫市哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司，江蘇 無錫 214000)

水稻是世界主要糧食作物之一，為全球一半以上的人口提供食物。然而，水稻在生產(chǎn)過程中，時常面臨各種病害的侵襲。其中，由稻瘟病病原菌(MagnaporthegriseaSacc)引起的稻瘟病是一種在全世界范圍內(nèi)最具毀滅性的水稻真菌性病害[1]。在稻瘟病流行年份，一般可造成水稻減產(chǎn)10%～20%，嚴(yán)重的甚至達(dá)到40%～50%[2]。生產(chǎn)上抗稻瘟病主要是采用化學(xué)防治和抗病育種2種方式，但由于化學(xué)防治成本高，且隨著人們對綠色食品的不斷追求，培育和推廣抗病品種已成為控制該病害最為經(jīng)濟(jì)有效的方法[3]。

雜交水稻由于雜種優(yōu)勢強(qiáng)、產(chǎn)量高，得到政府的大力推廣。雜交水稻的稻瘟病抗性取決于其雙親的稻瘟病抗性[4]，選育抗稻瘟病的光溫敏核不育系是配組選育抗稻瘟病兩系雜交水稻新品種的重要途徑。傳統(tǒng)抗病育種育種周期長、易受外界條件的影響、育種效率低。相比之下，分子標(biāo)記輔助選擇(MAS)育種可通過利用與目標(biāo)基因緊密連鎖的分子標(biāo)記對每個世代的單株進(jìn)行高效、可靠的目標(biāo)性狀的選擇，進(jìn)而可以大幅提高育種的效率。

迄今為止，國內(nèi)外已有100個稻瘟病抗性基因或QTLs被報道，它們分布在水稻的所有12條染色體上的不同位點(diǎn)，其中25個R基因已被成功克隆[5-6]。在已克隆的R基因中，Pigm基因是從持久抗稻瘟病品種谷梅4號中鑒定到的一個廣譜抗稻瘟病基因(簇)，具有廣譜抗性。本研究以高柱頭外露率、中粳類型溫敏不育系DS39、優(yōu)質(zhì)晚粳嘉58和攜帶Pigm的1350(揚(yáng)州大學(xué)農(nóng)學(xué)院提供)為材料，通過傳統(tǒng)雜交結(jié)合MAS和花藥培養(yǎng)技術(shù)，旨在獲得具有持久稻瘟病抗性且柱頭外露率高的晚粳類型兩系不育系，為選育安全高效的兩系雜交晚粳提供優(yōu)良親本材料。

1 材料與方法

1.1 材料

選用無錫哈勃生物種業(yè)技術(shù)研究院有限公司選育的中粳類型不育系DS39、常規(guī)優(yōu)質(zhì)粳稻嘉58和攜帶Pigm基因的粳稻1350為實(shí)驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 材料種植

在水稻單核靠邊期取花苞，置于4 ℃環(huán)境中低溫預(yù)處理4～6 d，次氯酸鈉表面消毒后，于無菌操作臺中將6枚花藥挑出，接種于SK3誘導(dǎo)培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)25 d左右，將愈傷組織轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基中分化培養(yǎng)20 d左右，即可分化出水稻幼苗。

1.2.2 基因型鑒定

材料選用需要篩選鑒定的株系的葉片，用CTAB法[7]提取DNA。

選用目標(biāo)基因Pigm的功能標(biāo)記M143104對各株系進(jìn)行基因型篩選。PCR引物由上海生工生物工程有限公司合成。引物序列為F：5′-CCTTG TTCCTCCTGCTATC-3′，R：5′-ATCTCGCTGTTCAG TCTTG-3′。Pigm的擴(kuò)增體系為：1 μL DNA模板、各1 μL 10 μmol·L-1正、反向引物、10 μL 2×EasyTaqSuper Mix、加無菌ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在2%質(zhì)量體積比的瓊脂糖凝膠上電泳分離，分離結(jié)果用BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)觀察，進(jìn)行拍照和記錄。

1.2.3 稻瘟病抗性鑒定

稻瘟病抗性鑒定在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的水泥槽抗性鑒定圃進(jìn)行。

試驗(yàn)選用混合了來自于嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院的15個致病力較強(qiáng)菌株的混合菌液進(jìn)行水稻稻瘟病接種和抗性評價(表1)。菌株包括8個B型小種的菌株(04、005、07、803、901、916、921、934)和7個C型小種菌株(02、805、809、812、912、917、935)。5月10日播種，當(dāng)幼苗達(dá)到三葉期時，采用噴霧法接種稻瘟病混合菌液，10 d后調(diào)查和記錄發(fā)病情況。

表1 稻瘟病的發(fā)病等級

1.2.4 農(nóng)藝性狀考察

種植1 000株鑒定小區(qū)，在始穗期套袋自交100個，并隨機(jī)抽取50個稻穗的花粉鏡檢，考察該不育系育性，成熟期隨機(jī)選取15株光溫敏不育系JF35-2(不取邊行)。主要考察株高、分蘗數(shù)、單株穗數(shù)、穗長、每穗穎花數(shù)、柱頭外露率等性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 攜帶抗稻瘟病基因Pigm的兩系不育系材料的創(chuàng)制

所有試驗(yàn)材料夏季和冬季分別種植在嘉興市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院嘉興試驗(yàn)基地和海南陵水試驗(yàn)基地。2016年夏季，在嘉興以高柱頭外露率、中粳類型溫敏不育系DS39為母本，與優(yōu)質(zhì)晚粳嘉58雜交獲得F1代雜交種。2016年冬季，F(xiàn)1代雜交種種植于陵水，取稻苞進(jìn)行花藥培養(yǎng)。2017年夏季，DH1種植于嘉興，篩選獲得26份不育系種子DH2。2017年冬季，DH2種植于陵水，編號為TS829-TS854，選擇白色大柱頭，雙外露，株型緊湊TS849繼續(xù)改良。2018年夏季TS849種植于嘉興，與攜帶Pigm粳稻材料1350雜交，獲得F1代雜交種。2018年冬季，F(xiàn)1代雜交種種植于陵水，取稻苞進(jìn)行花藥培養(yǎng)。2019年夏季，把288份DH1種植于嘉興，通過分子標(biāo)記選擇保留攜帶Pigm基因的單株108株，編號JF35-1到JF35-108，其中JF35-2表現(xiàn)最為突出(圖1)。

圖1 光溫敏不育系JF35-2的選育流程

2.2 基因型檢測

采用功能標(biāo)記M143104對各雜交組合的后代以及花藥培養(yǎng)的單株及株系材料進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇(圖2)，選擇出現(xiàn)亮色條帶(517 bp)的單株。最后通過分子標(biāo)記選擇從288份材料中鑒定到108株攜帶Pigm基因的單株(JF35-1～JF35-108)。

圖2 抗稻瘟病基因Pigm的分子標(biāo)記檢測

2.3 稻瘟病抗性鑒定

采用水泥槽病圃對各雜交組合的后代以及花藥培養(yǎng)的單株及株系苗期材料進(jìn)行稻瘟病抗性鑒定。從表2中可以看出，攜帶Pigm基因的單株對稻瘟病的抗性均達(dá)到了抗或高抗水平。其中JF35-2對稻瘟病的抗性表現(xiàn)為高抗水平。

表2 部分株系對稻瘟病的抗性鑒定

2.4 農(nóng)藝性狀考察

JF35-2屬粳型光溫敏兩系不育系，經(jīng)田間調(diào)查，該不育系的農(nóng)藝性狀整體良好。平均株高68 cm，株型適中，莖稈粗壯，葉色深綠，劍葉較短，分蘗力較強(qiáng)，平均單株有效穗11個、穗長16 cm、每穗穎花數(shù)170個，柱頭外露率47%，谷粒橢圓形，稃尖、柱頭無色。經(jīng)1 000株群體考查，群體整齊一致，不育株率為100%；考察了100個套袋自交稻穗，自交結(jié)實(shí)率為0%；隨機(jī)抽取50個稻穗的花粉鏡檢，花粉敗育率99.96%，以典敗為主，典敗率99.95%。

3 討論

稻瘟病嚴(yán)重危害世界水稻生產(chǎn)[8]，且由于水稻新品種審定中對稻瘟病抗性差的品種實(shí)行“一票否決”制度[9]，因此，育種工作者在選育優(yōu)良農(nóng)藝性狀的同時還需要注意稻瘟病抗性的篩選。

傳統(tǒng)抗病品種的選育主要是通過親本選擇，多次雜交、回交、自交等育種過程，并根據(jù)實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行田間表型的選擇來獲得。由于性狀與基因之間的數(shù)量對應(yīng)關(guān)系復(fù)雜，加之表型又是基因型與環(huán)境相互作用的結(jié)果，因此，以表型來推測基因型存在著一定程度的不可靠性，導(dǎo)致表型選擇的效率較低，制約了品種抗病改良的進(jìn)程。MAS育種可通過利用與抗病基因相關(guān)的分子標(biāo)記來追蹤目標(biāo)基因，這種分子水平上的間接選擇方法不受環(huán)境條件的限制和病原菌生理小種的影響，并且可在早代進(jìn)行選擇，還能有效區(qū)分雜合體和純合體，從而在短時間內(nèi)選育出純合型抗病的水稻材料[10]。此外，花藥培養(yǎng)可以快速純合育種材料，提高選擇效率，從而加快育種進(jìn)程[11]，在水稻育種同樣具有重要的應(yīng)用價值。

本研究采用分子標(biāo)記輔助選擇和花藥培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，打破了傳統(tǒng)育種的周期長、繁瑣等局限性，可準(zhǔn)確快速獲得攜帶目標(biāo)性狀的純合材料。本研究成功篩選到攜帶pigm基因的兩系不育系JF35-2，其農(nóng)藝性狀良好，柱頭外露率高，且對稻瘟病的抗性也達(dá)到高抗水平，結(jié)果表明，分子標(biāo)記輔助選擇和花藥培養(yǎng)技術(shù)在抗稻瘟病育種工作中的可能性，且含pigm的株系對稻瘟病的抗性極強(qiáng)，這與前人的研究結(jié)果一致[12]。