蔗糖濃度對白芨種子培養(yǎng)的影響

石麗敏，宋費(fèi)玲，許巧賢，盧華兵，陶正明，姜武，吳志剛

(1.浙江省東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100；2.浙江省亞熱帶植物研究所，浙江 溫州 325005)

白芨(BletillastriataReichb)是多年生草本地生蘭科白芨屬植物，也叫白及，別名冰球子、地螺絲、連及草等。主要分布在貴州、廣西、安徽、四川、云南、陜西和甘肅等地，多生長在海拔高度為950～3 500 m的疏生灌木和雜草山坡多石的闊葉林下，具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。白芨花色豐富，花型端莊而優(yōu)雅、葉態(tài)美觀，具有極高的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1-3]。白芨自然繁殖力低，種子需與真菌共生才能萌發(fā)，加上長期采挖，使得野生白芨資源日漸枯竭，成為瀕危植物，被列為國家重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材品種[4]。近年來，市場對白芨的需求量不斷上升，但由于野生資源有限，而用傳統(tǒng)的無性繁殖方式繁殖系數(shù)低，無法滿足大面積栽培需要，因此，利用組織培養(yǎng)技術(shù)繁育種苗成為當(dāng)前人工栽培的主要種苗來源。在植物組織培養(yǎng)中, 蔗糖既可作為碳源物質(zhì)促進(jìn)細(xì)胞生長, 同時(shí)也可作為滲透壓調(diào)節(jié)物質(zhì)維持細(xì)胞內(nèi)外滲透壓的平衡[5]。糖的用量不僅影響著培養(yǎng)物的生長速度和生長量，還影響其代謝水平、次生代謝物的合成以及細(xì)胞的形態(tài)和發(fā)生，是影響植物組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵因素之一[6]。

我們在成功篩選出白芨種子培養(yǎng)相關(guān)培養(yǎng)基配方的基礎(chǔ)上，在培養(yǎng)基中添加不同濃度的蔗糖，考察蔗糖濃度對白芨種子培養(yǎng)中種子萌發(fā)分化以及生根壯苗過程的影響，以選擇適宜的蔗糖濃度，更好地進(jìn)行白芨組培苗生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試白芨的成熟蒴果(種齡5個(gè)月以上)采于浙江省東陽玉米研究所塘西試驗(yàn)基地。

1.2 方法

白芨成熟蒴果經(jīng)過表面消毒處理后，剖開蒴果取出種子，接種到萌發(fā)分化培養(yǎng)基上，經(jīng)過一段時(shí)間的誘導(dǎo)，種子萌發(fā)形成原球莖并分化成小苗，將分化形成的小苗轉(zhuǎn)移到生根壯苗培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，添加7.0 g·L-1瓊脂，調(diào)節(jié)pH 5.8左右。

1.2.1 外植體的消毒

將白芨的蒴果先用自來水沖洗干凈，再置于洗潔精溶液中搖洗10 min，取出蒴果用自來水洗凈，瀝干水后，在超凈工作臺(tái)上先用75%的酒精消毒2 min；倒去酒精，再用0.1%的升汞消毒15 min；倒去升汞消毒液，用無菌水沖洗4～5次，瀝干備用。接種時(shí)，將經(jīng)過表面消毒的蒴果放在無菌的不銹鋼盤上，切除頭尾約0.5 cm，然后將蒴果中段沿縱軸切開，取出種子，均勻地接種到培養(yǎng)基表面。

1.2.2 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為(25±2)℃，以日光燈為光源，光照強(qiáng)度為2 000～2 500 lx，每天照光12 h。

1.2.3 種子萌發(fā)分化

MS基本培養(yǎng)基添加一定濃度的激素為基本種子萌發(fā)分化培養(yǎng)基，設(shè)置添加0、1%、2%、3%、4%，5個(gè)濃度的蔗糖處理。將種子接種在萌發(fā)分化培養(yǎng)基中，每處理接種 5皿，接種后的培養(yǎng)皿移入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。45 d后統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)生長情況。

1.2.4 生根壯苗

MS培養(yǎng)基添加一定濃度的激素為基本生根壯苗培養(yǎng)基，設(shè)置添加1%、2%、3%、4%，4個(gè)濃度的蔗糖處理。將分化出的幼苗轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基中，每個(gè)處理接種10瓶，每瓶接種40株。90 d后調(diào)查統(tǒng)計(jì)幼苗生長及生根情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)分化

白芨接種7 d后，種子開始萌發(fā)變綠，20 d左右分化成小苗，45 d左右長成約0.4 cm高的無根幼苗，可進(jìn)一步轉(zhuǎn)接到生根壯苗培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。

不同處理培養(yǎng)基上種子均能萌發(fā)和分化，且萌發(fā)率和分化率都高達(dá)99%(表1)；分化后，不同處理中幼苗生長發(fā)育情況有差異，其中不添加蔗糖處理的培養(yǎng)基上幼苗生長緩慢，相比其他處理幼苗更加矮小，其他幾個(gè)處理之間幼苗生長沒有明顯差異。表明前期種子萌發(fā)分化過程培養(yǎng)基中有無蔗糖對其沒有影響，但是分化成幼苗后，幼苗生長過程需要有蔗糖，蔗糖濃度對其影響不大，1%的濃度即可滿足幼苗生長需要。

表1 不同濃度蔗糖處理對白芨種子萌發(fā)分化的影響

2.2 生根壯苗

幼苗轉(zhuǎn)接進(jìn)生根壯苗培養(yǎng)基后10 d左右開始生根，生根率為100%。約40 d后幼苗基部開始膨大，形成球莖。由表2可知，不同濃度蔗糖處理，幼苗都能生根，根的數(shù)量和長度與蔗糖濃度成正比，隨著蔗糖濃度的增加，根的數(shù)量不斷增多，根的長度也不斷增加。隨著蔗糖濃度提高，小苗生長速度也越加快，株高越來越高。

表2 不同濃度蔗糖對生根壯苗情況的影響

3 小結(jié)與討論

蔗糖是植物組織培養(yǎng)中不可或缺的重要物質(zhì)，也是影響組培是否成功的關(guān)鍵因素之一。通過調(diào)查不同蔗糖濃度下白芨種子培養(yǎng)的生長發(fā)育情況，發(fā)現(xiàn)種子萌發(fā)成原球莖并分化成為幼苗的過程中，是否添加蔗糖、蔗糖的濃度都對其無顯著影響，說明白芨種子萌發(fā)分化過程不需要外源碳源，與St?ckel等[7-8]的蘭科藥用植物種子萌發(fā)完全依賴內(nèi)生真菌提供必要的碳源、氮源等多種營養(yǎng)物質(zhì)研究結(jié)果一致。在不添加蔗糖的培養(yǎng)基中幼苗生長緩慢，說明幼苗生長過程需要穩(wěn)定的碳源，但是蔗糖濃度對幼苗生長影響不大，可能是因?yàn)橛酌缭诜N子萌發(fā)分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)間短，從分化成幼苗到轉(zhuǎn)接只有25 d左右，1%的蔗糖濃度足以滿足生長需要。

小苗轉(zhuǎn)入壯苗生根培養(yǎng)基上后，培養(yǎng)基中的蔗糖濃度對其影響較大，隨著蔗糖濃度不斷增加，根的數(shù)量和長度也不斷增加，與王剛等[9]提出的蔗糖不僅作為碳水化合物提供營養(yǎng), 而且像激素一樣誘導(dǎo)根的形成和促進(jìn)根的生長, 其培養(yǎng)效果均隨著蔗糖濃度的增加而提高的論述一致。試驗(yàn)中隨著蔗糖濃度不斷增加，小苗生長速度也越快越整齊，株高也越高,說明蔗糖濃度在1%～4%，隨著濃度的增加，蔗糖對幼苗生長促進(jìn)作用越明顯，與劉江娜等[10]報(bào)道一致。由于試驗(yàn)中蔗糖濃度設(shè)置局限，未能對更高濃度蔗糖對生根壯苗的影響變化進(jìn)行探究，但從滿足移栽要求和節(jié)約生產(chǎn)成本角度出發(fā)，3%～4%的蔗糖濃度已基本可滿足白芨組培苗生產(chǎn)需要。本試驗(yàn)只是從蔗糖提供碳源的角度出發(fā)，分析了其對白芨種子培養(yǎng)生長發(fā)育的影響，今后可進(jìn)一步進(jìn)行蔗糖濃度對白芨種子培養(yǎng)中次生代謝物質(zhì)產(chǎn)生等方面的影響研究。