山茱萸中生物活性物質(zhì)的分離、鑒定及其神經(jīng)保護(hù)作用

欒 娜，王 欣，鐘祥鍵，周 娜，雋 京，冀麟麟，李金杰，尚小雅

(北京聯(lián)合大學(xué) 生物活性物質(zhì)與功能北京市重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100191)

阿爾茲海默癥(Alzheimer disease, AD)是發(fā)生在老年或老年前期的中樞性神經(jīng)退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為漸進(jìn)性記憶減退、認(rèn)知功能障礙、人格改變及語言障礙等神經(jīng)精神癥狀[1]。由于缺乏有效的預(yù)防及治療措施，AD已成為繼心腦血管疾病、癌癥和卒中的第四大致死病因，目前沒有可治愈的藥物[2]。從天然可食用材料中尋找具有潛在抗老年癡呆作用的成分是開發(fā)抗老年癡呆藥物和功能食品的重要方向，具有神經(jīng)保護(hù)活性的天然產(chǎn)物是作為開發(fā)的重點(diǎn)研究對象。

山茱萸(CornusofficinalisSieb.et Zucc.)別名肉棗、藥棗、石棗等，為木蘭綱(Magnoliopsida)山茱萸目(Cornales)山茱萸科(Cornaceae)山茱萸屬(Cornus)植物，主產(chǎn)于我國山西、河南等地，主要使用部位為成熟果肉，其性酸、澀、具有補(bǔ)益肝腎和澀精固脫之功效[3-4]。山茱萸在食品工業(yè)中的應(yīng)用已比較廣泛[5-7]，2018年已被中國食品藥品監(jiān)督管理局(China Food and Drug Administration，CFDA)正式收錄在藥食兩用資源目錄中。大量研究表明：山茱萸主要化學(xué)成分有環(huán)烯醚萜及其苷類、三萜類、黃酮類、鞣質(zhì)類、有機(jī)酸類等[8-12]，具有神經(jīng)保護(hù)、抗炎、降糖、抑菌、抗腫瘤、肝保護(hù)等多種生理活性[13-16]。山茱萸含有多種藥理活性，但研究多集中于粗提物水平[17-19]。

本課題組對山茱萸乙醇提取物進(jìn)行初步分離，發(fā)現(xiàn)大孔吸附樹脂用體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液洗脫部位顯示較好的神經(jīng)保護(hù)活性，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其中含量最大的莫諾苷已有文獻(xiàn)報道具有神經(jīng)保護(hù)作用[20]，剔除莫諾苷后的組分進(jìn)行活性測定仍發(fā)現(xiàn)有較好的神經(jīng)保護(hù)活性；為了明確活性因子是什么，本研究采用多種色譜分離技術(shù)和波譜學(xué)方法，對剔除莫諾苷后的活性組分進(jìn)行系統(tǒng)分離純化，并對分離得到的化合物進(jìn)行了體外神經(jīng)保護(hù)活性篩選，除莫諾苷外，新發(fā)現(xiàn)有2個化合物具有較好的神經(jīng)保護(hù)活性。研究為明確山茱萸神經(jīng)保護(hù)活性的化學(xué)組成，進(jìn)一步開發(fā)利用該植物提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山茱萸購買于河南西峽，經(jīng)宣武醫(yī)院王文教授鑒定為山茱萸CornusofficinalisSieb.et Zucc.的果實(shí)，留樣保存于北京聯(lián)合大學(xué)生物活性物質(zhì)與功能食品北京市重點(diǎn)實(shí)驗室。HP-20型大孔吸附樹脂，日本三棱公司；Sephadex LH-20凝膠，Pharmacia公司；柱色譜硅膠(160～200目)和薄層色譜硅膠GF254，青島海洋化工廠；低壓反相硅膠色譜柱和正相氰基色譜柱，ISCO公司；SH-SY5Y細(xì)胞，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所；胰蛋白酶(1×104U/mg)和PRMI 1640培養(yǎng)基，Thermo Fisher公司；3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)，Dojindo La公司；FBS，HyClone公司；氯仿、甲醇、乙醇及硫酸等試劑均為分析純，北京化學(xué)試劑廠；HPLC用溶劑為色譜純，美國Fisher公司；實(shí)驗用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Combiflash Companion型快速分離儀(正反相硅膠制備柱)，ISCO公司；Inova 500型核磁共振儀，Varian公司；2545型高效液相色譜儀[配Sunfire C18型制備柱(19 mm×250 mm×5 μm), Waters 2998型檢測器]，Waters公司；純水機(jī)，美國Pall公司；紫外燈，SWEEP公司；酶標(biāo)儀，Molecular Device公司。

1.3 實(shí)驗方法

1.3.1活性成分的提取與分離純化方法

山茱萸25 kg，采用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇水溶液超聲提取3次，每次1 h，合并3次提取液減壓濃縮得到浸膏(4.3 kg)。將浸膏分散于水中，上樣至用水平衡的HP-20型大孔吸附樹脂色譜柱，分別用水、20%乙醇(體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液)、60%乙醇(體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇水溶液)、95%乙醇(體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇水溶液)洗脫，濃縮各洗脫部分，得到4個部位。其中20%乙醇洗脫部位1.25 kg。將20%乙醇洗脫部位溶解，過正相硅膠柱，以V(氯仿)∶V(甲醇)=10∶90～0∶100進(jìn)行梯度洗脫，得到V(氯仿)∶V(甲醇)=91∶9、89∶11和甲醇組分，共計3個組分(A1、A2、A3)。將A1部分過反相硅膠柱，以V(乙醇)∶V(水)=5∶95～100∶0進(jìn)行梯度洗脫，得到組分A1-1～A1-14。組分A1-4首先通過正相硅膠柱色譜，以V(氯仿)∶V(甲醇)=95∶5～0∶100進(jìn)行梯度洗脫，得到A1-4-1～A1-4-7，組分A1-4-2中有明顯斑點(diǎn)，通過Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以V(氯仿)∶V(甲醇)=67∶33進(jìn)行洗脫，反復(fù)多次，得到化合物1(125 g)。組分A1-3通過正相硅膠柱色譜，以V(氯仿)∶V(甲醇)=95∶5～50∶50進(jìn)行梯度洗脫，得到組分A1-3-1～A1-3-6，其中A1-3-3首先經(jīng)過閃式低壓反相色譜，以V(甲醇)∶V(水)=40∶60～100∶0進(jìn)行梯度洗脫，得到組分再經(jīng)過Sephadex LH-20，V(氯仿)∶V(甲醇)=67∶33洗脫，最后經(jīng)高效液相色譜，以V(甲醇)∶V(水)=45∶55進(jìn)行制備，得到化合物2(31 mg)和化合物3(26 mg)；A1-3-2組分分別經(jīng)過Sephadex LH-20凝膠柱色譜和閃式低壓反相柱色譜，得到化合物4(15 mg)。組分A1-3-5經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜，以V(石油醚)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=45∶45∶10洗脫，得到化合物9(176 mg)。將A1-1組分過正相硅膠柱，以V(氯仿)∶V(甲醇)=98∶2～90∶10進(jìn)行梯度洗脫，得到A1-1-1～A1-1-6組分，A1-1-1組分中有明顯的主要斑點(diǎn)，通過濃硫酸顯色為綠色，將此組分反復(fù)通過Sephadex LH-20，以V(氯仿)∶V(甲醇)=67∶33為洗脫劑，富集此綠色斑點(diǎn)，將綠色斑點(diǎn)富集組分通過正相硅膠柱色譜，以V(石油醚)∶V(丙酮)=80∶20為洗脫劑，得到化合物8(92 mg)。A1-2組分反復(fù)通過Sephadex LH-20凝膠柱，以V(石油醚)∶V(氯仿)∶V(甲醇)=45∶45∶10進(jìn)行洗脫得到組分A1-2-1～A1-2-4，其中A1-2-3亞組分通過閃式低壓氰基色譜柱，以V(石油醚)∶V(丙酮)=95∶5～67∶33進(jìn)行梯度洗脫，最后通過高效液相色譜，以V(甲醇)∶V(水)=65∶35進(jìn)行洗脫，得到化合物5(19 mg)和化合物6(9 mg)。組分A1-2-4進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以V(石油醚)∶V(丙酮)=86∶14～67∶33進(jìn)行梯度洗脫，得到化合物7(12 mg)。組分分離流程見圖1。

1.3.2神經(jīng)保護(hù)活性的測定

神經(jīng)保護(hù)活性測定參考孫芳玲等[20]方法，評價活性成分對H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用情況，測定方法稍作修改。SH-SY5Y細(xì)胞以RPMI-1640培養(yǎng)基輔以體積分?jǐn)?shù)為10%胎牛血清于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞每2～3 d更換培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.25%胰蛋白酶消化進(jìn)行傳代培養(yǎng)，實(shí)驗選取對數(shù)生長期細(xì)胞。細(xì)胞以每孔5×103個的濃度接種于96孔板中，24 h后加入H2O2，H2O2終濃度為200 μmol/L，1 h后加入化合物處理細(xì)胞，24 h后采用3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)比色法在酶標(biāo)儀上測定560 nm處吸光度值，以此反映細(xì)胞的存活情況。

1.3.3活性成分中單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

對分離得到的單體化合物，首先采用TLC和HPLC檢測其純度，對于純度大于95%的樣品，進(jìn)行核磁共振氫譜和碳譜及質(zhì)譜數(shù)據(jù)的測試，然后將測定的數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報道的數(shù)據(jù)進(jìn)行對比，進(jìn)而鑒定分離得到的單體化合物的結(jié)構(gòu)。

化合物1：白色無定型粉末，ESI-MS給出分子離子峰為m/z429[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 7.54(1H, s, H-3), 5.91(1H, d,J=9.3 Hz, H-1), 5.16(1H, dd,J=9.7, 2.2 Hz, H-7), 4.79(1H, d,J=7.9 Hz, H-1′), 4.35(1H, m, H-8), 3.89(1H, dd,J=12.3, 2.2 Hz, H-6′β), 3.71(3H, s, 11-OMe), 3.66(1H, dd,J=12.2, 6.3 Hz, H-6′α), 3.38(1H, m, H-5′), 3.31(1H, dd,J=9.0, 9.0 Hz, H-3′), 3.25(1H, m, H-4′), 3.15(1H, dd,J=7.9, 9.3 Hz, H-2′), 3.14(1H, m, H-5), 1.97(1H, m, H-6β), 1.87(1H, m , H-9), 1.62(1H, m, H-6α), 1.32(3H, d,J=6.9 Hz, H-10)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 168.7(C-11), 154.5(C-3), 111.6(C-4), 100.1(C-1′), 95.5(C-1), 93.6(C-7), 78.5(C-3′), 77.9(C-5′), 75.0(C-2′), 71.6(C-4′), 67.0(C-8), 62.8(C-6′), 51.7(11-OMe), 40.4(C-10), 33.5(C-6), 27.8(C-5), 19.7(C-10)?；衔?的NMR譜圖見圖2，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[21]報道一致，由此確定化合物1為7-β-莫諾苷。

圖2 7-β-莫諾苷的NMR譜

化合物2：白色無定型粉末，ESI-MS給出分子離子峰m/z457[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 7.49(1H, s, H-3), 5.87(1H, d,J=9.3 Hz, H-1), 4.76(1H, d,J=7.9 Hz, H-1′), 4.73(1H, d,J=3.4 Hz, H-7), 4.26(1H, m, H-8), 3.86(1H, dd,J=12.3, 2.2 Hz, H-6′β), 3.67(3H, s, H-12), 3.63(1H, dd,J=12.2, 6.3 Hz, H-6′α), 3.37(1H, dd,J=9.0, 9.0 Hz, H-3′), 3.35(1H, m, H-5′), 3.33(3H, s, H-13), 3.28(1H, m, H-4′), 3.18(1H, m, H-2′), 3.02(1H, m, H-5), 1.90(1H, m, H-6β), 1.80(1H, m, H-9), 1.50(1H, m, H-6α), 1.33(3H, d,J=7.0 Hz, H-10).13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 168.6(C-11), 154.5(C-3), 111.6(C-4), 100.1(C-1′), 99.5(C-7), 95.6(C-1), 78.5(C-3′), 77.9(C-5′), 75.0(C-2′), 71.7(C-4′), 66.8(C-8), 62.9(C-6′), 54.9(7-OCH3), 51.8(C-12), 40.3(C-9), 33.8(C-6), 28.0(C-5), 19.6(C-10)?；衔?的NMR譜圖見圖3，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道一致，由此確定化合物2為7-β-O-甲基莫諾苷。

圖3 7-β-O-甲基莫諾苷的NMR譜

化合物3：白色無定型粉末，ESI-MS給出分子離子峰m/z457[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 7.50(1H, s, H-3), 5.80(1H, d,J=9.3 Hz, H-1), 4.77(1H, d,J=7.9 Hz, H-1′), 4.59(1H, dd,J=9.6, 1.85 Hz, H-7), 3.92(1H, m, H-8), 3.87(1H, dd,J=12.3, 2.2 Hz, H-6′β), 3.68(3H, s, H-13), 3.65(1H, dd,J=12.2, 6.3 Hz, H-6′α), 3.48(1H, m, H-5′), 3.47(3H, s, 7-OCH3), 3.37(1H, dd,J=9.0, 9.0 Hz, H-3′), 3.28(1H, m, H-4′), 3.19(1H, dd,J=9.3, 7.9 Hz, H-2′), 2.82(1H, m, H-5), 1.99(1H, m, H-6β), 1.80(1H, m, H-9), 1.38(3H, d,J=7.0 Hz, H-10), 1.14(1H, m, H-6α)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 168.6(C-11), 154.5(C-3), 110.7(C-4), 104.6(C-1′), 99.8(C-7), 95.7(C-1), 78.5(C-3′), 77.9(C-5′), 75.0(C-2′), 74.2(C-8), 71.7(C-4′), 62.9(C-6′), 56.8(7-OMe), 51.8(C-12), 40.1(C-9), 35.7(C-6), 31.8(C-5), 19.7(C-10)。化合物3的NMR譜圖見圖4，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[22]報道一致，由此確定化合物3為7-α-O-甲基莫諾苷。

圖4 7-α-O-甲基莫諾苷的NMR譜

化合物4：白色無定型粉末，ESI-MS給出分子離子峰為m/z427[M+Na]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 7.49(1H, s, H-3), 5.63(1H, d,J=6.0 Hz, H-1), 4.74(1H, m, H-8), 4.66(1H, d,J=7.9 Hz, H-1′), 3.87(1H, dd,J=12.0, 1.8 Hz, H-6′β), 3.69(3H, s, 11-OMe), 3.63(1H, dd,J=12.0, 6.1 Hz, H-6′α), 3.22～3.36(4H, m, H-2′, 3′, 4′, 5′), 3.16(1H, m, H-5), 2.95(1H, dd,J=17.1, 7.5 Hz, H-6α), 2.60(1H, dd,J=17.1, 6.0 Hz, H-6β), 2.41(1H, m, H-9), 1.49(3H, d,J=7.0 Hz, H-10)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 174.3(C-7), 168.1(C-11), 154.3(C-3), 111.4(C-4), 100.0(C-1′), 94.3(C-1), 78.5(C-3′), 77.9(C-5′), 76.7(C-2′), 74.7(C-8), 71.6(C-4′), 62.8(C-6′), 51.8(11-OMe), 39.8(C-6), 34.3(C-9), 27.9(C-5), 18.4(C-10)。化合物4的NMR譜圖見圖5，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[23]報道一致，由此確定化合物4為金吉苷。

圖5 金吉苷的NMR譜

化合物5：無色油狀物，ESI-MS給出分子離子峰為m/z171[M+H]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 4.37(1H, dd,J=11.6, 4.3 Hz, H-1α), 4.14(1H, dd,J=11.6, 3.9 Hz, H-1β), 4.02(1H, m, H-6), 2.71(1H, dd,J=15.0, 7.2 Hz, H-4α), 2.86(1H, m, H-5), 2.31(1H, dd,J=15.0, 4.5 Hz, H-4β), 2.10(1H, m, H-7β), 2.01(1H, m, H-9), 1.79(1H, m, H-8), 1.31(1H, m, H-7α), 1.04(3H, d,J=6.9 Hz, H-10)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 176.7(C-3), 76.2(C-6), 70.0(C-1), 43.9(C-9), 42.9(C-5), 42.4(C-7), 35.2(C-8), 34.0(C-4), 13.1(C-10)?；衔?的NMR譜圖見圖6，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[24]報道一致，由此確定化合物5為cornolactones D。

圖6 Cornolactones D的NMR譜

化合物6：白色固體，ESI-MS給出分子離子峰為:m/z299[M+H]+；1H NMR(DMSO, 500 MHz):δ7.18(1H, d,J=1.5 Hz, H-8), 6.51(1H, d,J=3.5 Hz, H-4′), 5.30(1H, d,J=3.5 Hz, H-3′), 4.98(H, s, H-2), 4.46(2H, s, H-6′), 3.77(2H, m, H-6, 9β), 3.59(1H, m, H-9α), 3.48(2H, m, H-7), 1.15(3H, t,J=7.0 Hz, H-10);13C NMR(CDCl3, 125 MHz):δ197.1(C-3), 160.5(C-5′), 149.4(C-2′), 126.8(C-4), 121.7(C-8), 121.4(C-3′), 110.3(C-4′), 97.9(C-2), 80.8(C-5), 74.4(C-6), 63.9(C-9), 62.2(C-7), 56.0(C-6′), 15.0(C-10)。化合物6的NMR譜圖見圖7，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[25]報道一致，由此確定化合物6為pollenfuran A。

圖7 Pollenfuran A的NMR譜

化合物7：白色固體，ESI-MS給出分子離子峰m/z349[M+H]+；1H NMR(CDCl3, 500 MHz):δ6.85(1H, d,J=8.0 Hz, H-5′), 6.83(1H, d,J=8.0 Hz, H-5″), 6.67(1H, dd,J=8.0.2.0 Hz, H-6′), 6.65(1H, dd,J=8.0.2.0 Hz, H-6″), 6.57(1H, d,J=2.0 Hz, H-2′), 6.55(1H, d,J=2.0 Hz, H-2″), 5.54(1H, d,J=6.0 Hz, H-3), 3.87(1H, m, H-1β), 3.80(3H, s, OMe), 3.76(3H, s, OMe), 3.74(1H, m, H-1α), 3.42(1H, m, H-1?β), 3.27(1H, m, H-1?α), 3.11(1H, m, H-2), 1.12(3H, t,J=7.0 Hz, H-2?);13C NMR(CDCl3, 125 MHz):δ146.4(C-3′), 146.2(C-3″), 145.2(C-4″), 144.5(C-4?), 131.9(C-1′), 130.9(C-1″), 121.9(C-6′), 120.7(C-6″), 114.1(C-5′), 113.7(C-5″), 112.1(C-2″), 109.7(C-2′), 83.6(C-3), 64.5(C-1), 64.4(C-1?), 55.9(C-OMe), 54.2(C-2), 15.4(C-2?)?；衔?的NMR譜圖見圖8，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[26]報道一致，由此確定化合物7為threo-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol。

圖8 threo-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol的NMR譜

化合物8：棕色油狀物，ESI-MS顯示m/z125[M-H]-。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 9.50(1H, s, H-7), 7.35(1H, d,J=3.6 Hz, H-3), 6.55(1H, d,J=3.6 Hz, H-4), 4.58(2H, s, H-6)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 179.4(C-7), 163.2(C-5), 153.9(C-2), 124.6(C-3), 110.9(C-4), 57.6(C-6)?；衔?的NMR譜圖見圖9，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[27]報道一致，由此確定化合物8為5-羥甲基糠醛。

圖9 5-羥甲基糖醛的NMR譜

化合物9：白色無定型粉末，ESI-MS給出分子離子峰m/z155[M+H]+。1H-NMR(CD3OD, 500 MHz)δ: 7.37(2H, m, H-2,6), 6.73(1H, d,J=7.9 Hz, H-4)。13C-NMR(CD3OD, 125 MHz)δ: 170.2(C-7), 151.2(C-3), 146.0(C-4), 123.8(C-1), 123.0(C-6), 117.7(C-5), 115.7(C-2)。化合物9的NMR譜圖見圖10，譜圖數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[28]報道一致，由此確定化合物9為3,4-二羥基苯甲酸。

圖10 3，4-二羥基苯甲酸的NMR譜

2 結(jié)果與分析

2.1 活性成分的分離和結(jié)構(gòu)鑒定分析

采用大孔吸附樹脂、正相常壓硅膠、Sephadex LH-20凝膠、閃式低壓正反相硅膠、反相高壓液相等色譜方法從顯示具有神經(jīng)保護(hù)活性的組分中共分離得到9個單體化合物，根據(jù)核磁共振譜、質(zhì)譜，同時結(jié)合已知文獻(xiàn)數(shù)據(jù)對比對分離得到的化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，鑒定其結(jié)構(gòu)分別為7-β-莫諾苷(1)、7-β-O-甲基莫諾苷(2)、7-α-O-甲基莫諾苷(3)、金吉苷(4)、cornolactones D(5)、pollenfuran A(6)、threo-2,3-bis(4-hydroxy-3-methoxyphenyl)-3-ethoxypropan-1-ol(7)、5-羥甲基糠醛(8)和3,4-二羥基苯甲酸(9)(結(jié)構(gòu)見圖11)。從化合物類型上分化合物1～5為環(huán)烯醚萜類化合物，其中化合物1～4為環(huán)烯醚萜單糖苷；化合物6和8為呋喃化合物，化合物7和9為酚酸類化合物。其中化合物6和7為首次從山茱萸屬植物中分離得到，化合物5為首次從山茱萸中分離得到。

圖11 山茱萸果實(shí)中鑒定的9個單體化合物結(jié)構(gòu)式

在分離過程中發(fā)現(xiàn)，由于環(huán)烯醚萜苷類成分苷元為單萜，含有一個葡萄糖，極性較大，但在反相硅膠柱色譜上的保留較弱，化合物1采用純水即可從色譜柱上洗脫，化合物2～4僅用體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇水溶液即可洗脫，而其他成分則需在含醇量大于30%后方可洗脫，這種采用水和低濃度乙醇水洗脫的反相硅膠柱色譜方法可用于環(huán)烯醚萜苷類成分的快速大量富集?；衔?和化合物2結(jié)構(gòu)相似，僅1個甲氧基的區(qū)別，分離過程中采用Sephadex LH-20凝膠柱色譜分離，當(dāng)使用甲醇為洗脫劑時無法分離，而采用V(氯仿)∶V(甲醇)=2∶1為洗脫劑時可一次性分離，這為結(jié)構(gòu)相似的成分的快速分離提供了一定參考。化合物2和化合物3在結(jié)構(gòu)上為差向異構(gòu)體，此類結(jié)構(gòu)通常在分離時需采用手性色譜柱，而化合物2和3采用常規(guī)C18反相色譜柱即可實(shí)現(xiàn)分離，但洗脫劑需為乙腈水系統(tǒng)，甲醇水系統(tǒng)無法實(shí)現(xiàn)分離。

2.2 活性成分對神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)作用

將分離得到的單體活性成分化合物在濃度10 μmol/L下，對H2O2損傷的SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用進(jìn)行研究，以僅給予空白溶液細(xì)胞為對照組，以僅H2O2損失處理細(xì)胞為模型組，結(jié)果顯示，化合物1～3能夠顯著提高細(xì)胞存活率，其中化合物1(莫諾苷)活性最好，細(xì)胞存活率為85.2%，這與之前研究報道的結(jié)果一致[20]。對山茱萸果實(shí)中鑒定的9個化合物結(jié)構(gòu)與活性相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)化合物1～4的結(jié)構(gòu)類型一樣，差別只是取代基不同，但神經(jīng)保護(hù)活性的差別卻很大，推測化合物2和3的羥基酯化降低了神經(jīng)保護(hù)活性，而化合物4中羥基被羰基取代，活性消失，說明C7上-OH可能為山茱萸環(huán)烯醚萜苷類成分的活性基團(tuán)?；衔?為環(huán)戊烷型環(huán)烯醚萜苷元，但未表現(xiàn)出顯著的神經(jīng)保護(hù)活性，是否是成苷之后活性提高，還需要進(jìn)一步研究。這9個化合物對H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞保護(hù)作用的影響結(jié)果見表1。

表1 化合物對H2O2損傷SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用

3 結(jié) 論

本研究對山茱萸乙醇提取物中大孔吸附樹脂體積分?jǐn)?shù)為20%的乙醇水溶液洗脫部位進(jìn)行了化學(xué)成分研究，從顯示神經(jīng)保護(hù)活性的組分中分離鑒定了9個化合物，包括環(huán)烯醚萜及其苷類、呋喃型類、酚酸類。同時采用H2O2誘導(dǎo)的SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞損傷模型對分離得到的化合物進(jìn)行了神經(jīng)保護(hù)活性測試，結(jié)果顯示除已報道具有神經(jīng)保護(hù)活性的莫諾苷(細(xì)胞存活率85.2%±0.011%)外，7-β-O-甲基莫諾苷(化合物2，細(xì)胞存活率79.8%±0.033%)和7-α-O-甲基莫諾苷(化合物3，細(xì)胞存活率78.6%±0.062%)也顯示較好的神經(jīng)保護(hù)活性，說明環(huán)烯醚萜苷類成分可能為山茱萸神經(jīng)保護(hù)活性的主要活性成分類型，因此對其他神經(jīng)保護(hù)活性環(huán)烯醚萜苷的研究對于最終明確山茱萸神經(jīng)保護(hù)活性成分具有重要意義。