新疆牛羊產(chǎn)業(yè)鏈中金黃色葡萄球菌的污染調(diào)查與毒力基因檢測

胥 蘭，劉英玉，麥 多，朱明月，蔣金豆，盧 煒，朱夢含，鄭曉風(fēng)，彭 斌

(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052)

0 引 言

【研究意義】金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus，SA)，廣泛分布于自然界中，如空氣、環(huán)境、土壤、食品等中[1]，由金黃色葡萄球菌引發(fā)的食物中毒事件比例高達45%，僅次于大腸桿菌和沙門氏菌，目前已經(jīng)成為第3大類致命病菌[2]。耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MethicillinresistantStaphylococcusaureus，MRSA)具有多重耐藥性，其耐藥性不斷增強[3]。【前人研究進展】新疆的細菌性食源性疾病的暴發(fā)也以金黃色葡萄球菌較多見[4]。金黃色葡萄球菌還可以產(chǎn)生大量的致病因子，腸毒素、溶血毒素、黏附素、殺白細胞毒素、中毒性休克綜合征毒素等[5]。研究表明,產(chǎn)腸毒素的基因通常與耐藥基因處于相同質(zhì)粒中[6]。黏附素主要包括纖連蛋白結(jié)合蛋白和凝集因子，主要結(jié)合宿主的纖連蛋白和纖維蛋白原，是一種重要的細菌表面識別黏附基質(zhì)分子。殺白細胞素是導(dǎo)致人類化膿感染和壞死性肺炎的原因之一[7]。中毒性休克綜合征毒素，是噬菌體I型金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的一種外毒素,可使淋巴細胞活化、增殖，釋放大量炎癥因子，最終導(dǎo)致炎癥失控和多個器官的損傷[8]?！颈狙芯壳腥朦c】研究烏魯木齊及周邊地區(qū)奶牛養(yǎng)殖場和牛羊屠宰場中金黃色葡萄球菌和MRSA的污染情況及其毒力基因的攜帶情況。【擬解決的關(guān)鍵問題】采集烏魯木齊及周邊地區(qū)牛養(yǎng)殖場和牛羊屠宰場752份樣品(糞樣、擠奶廳工具拭子、胴體拭子、屠宰工具拭子等)，采用國家標(biāo)準(zhǔn)方法進行金黃色葡萄球菌分離和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的鑒定，檢測10種常見毒力基因(sea、seb、sec、fnbA、fnbB、hla、hlb、clfa、pvl、tst)的編碼情況，為新疆動物性食品環(huán)節(jié)中金黃色葡萄球菌的流行病學(xué)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 樣品來源

樣品采集自烏魯木齊及周邊地區(qū)養(yǎng)殖場和屠宰場，共計752份。

1.1.2 試 劑

7.5%氯化鈉肉湯、Baird-Parker瓊脂、營養(yǎng)瓊脂、營養(yǎng)肉湯(青島海博生物技術(shù)有限公司)；金黃色葡萄球菌顯色培養(yǎng)基(法國科瑪嘉公司)；核酸染料、瓊脂糖和TAE(北京鼎國昌盛有限公司)；DNA Marker、2×TaqMasterMix Takara；無水乙醇(天津市致遠化學(xué)試劑有限公司)；金黃色葡萄球菌質(zhì)控菌株ATCC 29213(中國獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心)。

1.1.3 儀 器

AL204-IC電子天平(梅勒特-托利多儀器有限公司；BCD-219D冰箱(青島海爾股份有限公司)；生物安全柜(美國LABCONCO)；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；DHP-9162電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；DHG-9140A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海齊欣科學(xué)儀器有限公司)；ST-98AB多功能振蕩器(北京桑翌實驗儀器研究所)；HH-W600數(shù)顯三用恒溫水箱(金壇市醫(yī)療儀器廠)；DYCP-31DN水平電泳槽、DYY-6D型電泳儀電源、DYCP-31DN穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(北京市六一儀器廠)；CT018926基因擴增儀(PCR儀)和GELDOCXR凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)；KD210-AN(B)美的微波爐(佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司。

1.2 方 法

1.2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定

將采集的樣品按照國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.4-2016[9]進行操作。顯色培養(yǎng)基上疑似的菌落采取水煮法提取菌落的DNA。對金黃色葡萄球菌耐熱核酸酶基因nuc進行PCR檢測，引物序列如表1所示。反應(yīng)體系為20 μL，其中2×TaqMaster Mix 10 μL；ddH2O 8.2 μL，上下游引物各0.4 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)，72℃最后延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳后于凝膠成像系統(tǒng)進行判定。

1.2.2 MRSA菌株鑒定

選擇金黃色葡萄球菌甲氧西林耐藥決定子mecA[10]基因作為靶基因進行PCR擴增，陽性判定為MRSA，陰性判定為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MethicillinsensitiveStaphylococcusaureus，MSSA)。反應(yīng)體系為25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12 μL，ddH2O 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，47℃退火30 s，72℃延伸1 min，35個循環(huán)，72℃最后延伸10 min。取6 μL PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳后于凝膠成像系統(tǒng)進行判定。表1

1.2.3 毒力基因的檢測

對已鑒定的金黃色葡萄球菌按參照文獻[11]對腸毒素sea、seb、和sec，纖連蛋白結(jié)合蛋白fnbA、fnbB，溶血毒素hla、hlb，黏附素凝聚因子clfa，殺白細胞素pvl，毒素休克綜合征毒素tst，10種典型的金葡菌致病性毒力基因進行PCR擴增。PCR反應(yīng)體系為25 μL，其中2×TaqMaster Mix 12 μL，ddH2O 10 μL，上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL。PCR反應(yīng)參數(shù)為：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，各引物退火溫度，72℃延伸35 s，35個循環(huán)，72℃最后延伸10 min。取6 μL的 PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠中進行電泳后于凝膠成像系統(tǒng)進行判定。表1

表1 金黃色葡萄球菌的毒力基因和mecA的引物序列、Tm值及目的片段Table 1 The virulence genes and mecA of Staphylococcus aureus of the primer sequence, Tm value and target fragments

2 結(jié)果與分析

2.1 金黃色葡萄球菌分離鑒定

研究表明，共分離出金黃色葡萄球菌26株，總分離率為3.46%。奶牛養(yǎng)殖場的387份樣品中檢出17株金黃色葡萄球菌，分離率為4.39%。奶牛場1中糞樣25份檢出10株，檢出率為40%。奶牛場2中糞樣73份檢出1株，檢出率為1.37%。奶牛場3中糞樣86份和奶樣14份中各檢出1株，檢出率分別為1.16%、7.14%。奶牛場4中糞樣37份檢出2株、奶廳環(huán)境6份檢出1株，檢出率分別為5.41%、16.67%，其余樣品未檢出。奶牛場5中采奶器拭子30份檢出1株，檢出率為3.33%，其余樣品未檢出。屠宰場中樣品共計365份樣品，檢出9株，總分離率2.47%。屠宰場中，定點牛屠宰場1中91份樣品未檢出，定點牛屠宰場2中銷售的牛肉26份檢出2株，檢出率為7.69%，其余樣品未檢出。牛屠宰場中共計177份樣品，檢出2株，檢出率為1.13%。屠宰場中，定點羊屠宰場1中胴體拭子20份、肛拭子19份、內(nèi)臟拭子20份各檢出1株，檢出率分別為5%、5.26%、5%，其余樣品未檢出。定點羊屠宰場2中胴體拭子27份、操作用具拭子20份各檢出2株，檢出率分別為7.41%、10%，其余樣品未檢出。羊屠宰場中共計188份樣品，檢出7株，檢出率為3.72%。表2

表2 樣品信息及金黃色葡萄球菌和MRSA菌株分離Table 2 Sample information and isolation of Staphylococcus aureus and MRSA strains

2.2 MRSA菌株鑒定

研究表明，26株SA進行mecA基因的PCR擴增檢測，共檢出8株MRSA，占檢出率的30.77%。8株MRSA菌株中，7株來源于奶牛養(yǎng)殖場，1株來源于羊定點屠宰場。奶牛養(yǎng)殖場中，17株SA檢出7株，檢出率為41.18%。屠宰場中，9株SA檢出1株，檢出率為11.11%。

2.3 毒力基因的檢測

研究表明，檢出率較高的是hla(100%)、clfa(100%)、hlb(53.85%)，其次是fnbB(23.08%)、seb(19.23%)、tst(15.38%)、sea(11.54%)、sec(3.85%)、fnbA(3.85%)，pvl未檢出；所有菌株攜帶2種及2種以上的毒力基因，菌株中攜帶的毒力基因組合形式以hla和clfa為主。表3

表3 分離的金黃色葡萄球菌及MRSA、MSSA菌株毒力基因檢測Table 3 Detection of virulence genes of isolated Staphylococcus aureus and MRSA and MSSA strains

MRSA菌株中，檢出率較高的毒力基因是hla(100%)和clfa(100%)、hlb(75%)，其次是seb(50%)、fnbB(25%)、tst(12.5%)，sea、sec、pvl和fnbA均未檢出；MSSA菌株中，檢出率較高的毒力基因是hla(100%)和clfa(100%)、hlb(44.44%)，其次是fnbB(22.22%)、tst(16.67%)、sea(16.67%)、seb(5.56%)、sec(5.56%)、fnbA(5.56%)，pvl未檢出。MSSA菌株和MRSA菌株中攜帶的毒力基因組合形式都是以hla和clfa為主，且MSSA菌株的毒力基因攜帶率均高于MRSA菌株。表3

3 討 論

3.1 SA在牛羊不同產(chǎn)業(yè)鏈中的污染情況

養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，奶牛源金黃色葡萄球菌分離率為4.39%，金黃色葡萄球菌是引起奶牛臨床和亞臨床乳房炎及子宮內(nèi)膜炎的主要病原之一[12]。說明在養(yǎng)殖環(huán)節(jié)中，患有乳房炎奶牛是金黃色葡萄球菌的主要污染源。研究檢測的奶牛養(yǎng)殖場中糞樣、奶樣、采奶器拭子等存在金黃色葡萄球菌的污染，表明奶牛在飼養(yǎng)管理環(huán)節(jié)中，可能由于其采食的飼草料、水源以及排泄的糞便等造成了交叉污染和感染，增大了病原菌的傳播機會和范圍[13]。屠宰環(huán)節(jié)中，牛源金黃色葡萄球菌分離率為1.13%，羊源金黃色葡萄球菌分離率為3.72%，金黃色葡萄球菌污染情況嚴重源頭的調(diào)查有待研究。研究檢測的屠宰場中肉樣、胴體拭子、肛拭子、內(nèi)臟拭子等存在金黃色葡萄球菌的污染。在對肉類食品進行加工處理的過程中，必須做好保護和防范措施，衛(wèi)生條件達標(biāo)，操作規(guī)范，盡量減少人與環(huán)境對肉類食品造成的污染[14]。養(yǎng)殖環(huán)節(jié)總分離率為4.39%，屠宰環(huán)節(jié)總分離率為2.47%，在不同環(huán)節(jié)中，均存在金黃色葡萄球菌的污染情況，因此，想要控制金黃色葡萄球菌帶來的食源性疾病，就要在牛羊養(yǎng)殖環(huán)節(jié)、屠宰環(huán)節(jié)等過程進行全程控制，逐漸形成從養(yǎng)殖場到餐桌的食品衛(wèi)生質(zhì)量監(jiān)控體系[15]。

3.2 MRSA菌株的污染

分離的26株金黃色葡萄球菌存在8株MRSA，占檢出率的30.77%。8株MRSA菌株中，7株來源于奶牛養(yǎng)殖場，1株來源于羊屠宰場，表明養(yǎng)殖場和屠宰場中均存在MRSA菌株的污染，且養(yǎng)殖環(huán)節(jié)檢出率高于屠宰環(huán)節(jié)。近些年來，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌在畜群中的出現(xiàn)、流行，導(dǎo)致的乳腺炎奶牛難以治愈，通常被淘汰，嚴重影響奶牛場的經(jīng)濟效益[16]，因而奶牛中可能更易檢測到MRSA菌株，故而對奶牛場中MRSA菌株的監(jiān)測顯得尤為重要。

3.3 毒力基因攜帶

金黃色葡萄球菌致病力的強弱與其產(chǎn)生的毒素有關(guān)，主要包括腸毒素、溶血毒素、殺白細胞毒素、黏附素、中毒性休克綜合征毒素等，這些毒力因子具有不同的生物學(xué)特性，因而具有不同的致病特征[17]。研究檢測的菌株中，檢出率較高的是clfa(100%)、hla(100%)、hlb(53.85%)，與陳云[18]對73株甘肅牛源MRSA菌株檢測此clfa和hla2種毒力基因均為100%，王俊瑞[19]對60株呼和浩特住院患者分離的金黃色葡萄球菌檢測此2種毒力基因同為100%，與研究結(jié)果一致。fnbA和fnbB檢出率分別為3.85%、23.08%，tst檢出率為15.38%，fnb黏附蛋白，具有黏附作用，還能結(jié)合宿主細胞的細胞外基質(zhì)，使細菌完全被宿主的細胞外基質(zhì)包裹從而逃脫宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)視[20]。腸毒素是引起食物中毒的主要致病因子，sea、seb和sec3種腸毒素基因檢出率分別為11.54%、19.23%、3.85%，這與曹虹[21]報道的金黃色葡萄球菌腸毒素中以sea為主有所差異，表明不同來源的金黃色葡萄球菌腸毒素基因攜帶程度不同。研究結(jié)果顯示，MRSA菌株和MSSA菌株從整體上看hla、clfa、fnbB檢出率無明顯差異，另外MSSA菌株中sea、sec、tst、fnbA檢出率高于MRSA菌株，MRSA菌株中hlb、seb檢出率高于MSSA菌株。

4 結(jié) 論

新疆奶牛養(yǎng)殖場、牛屠宰場和羊屠宰場中金黃色葡萄球菌的分離率分別是4.39%、1.13%、3.72%。養(yǎng)殖場和屠宰場中各存在7株和1株MRSA菌株，奶牛養(yǎng)殖場檢出率高。所有菌株均攜帶2種及2種以上毒力基因，具有潛在的致病性。