UPLC-MS/MS法測(cè)定葡萄干中6種人工合成甜味劑

王遠(yuǎn) ，邢麗杰，李先義，羅瑞峰，劉玉晗

1. 新疆農(nóng)墾科學(xué)院（石河子 832000）；2. 石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）

葡萄干是一種具有豐富營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的干果，受到全世界的歡迎。葡萄干包含豐富的維生素和礦物質(zhì)[1]。新疆是我國(guó)葡萄干的主要產(chǎn)區(qū)，葡萄干產(chǎn)量占世界總量的8.33%，居世界第四位，主要產(chǎn)于吐魯番、哈密和南疆地區(qū)[2]。

人工合成甜味劑是一種能改善食品口味的外源添加劑，被廣泛應(yīng)用于食品加工行業(yè)。但是過量地使用或?yàn)E用甜味劑會(huì)危害人體健康，為此國(guó)家對(duì)甜味劑的使用范圍及用量進(jìn)行了嚴(yán)格規(guī)定[3]。GB 2760—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[4]中對(duì)安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜、紐甜等（圖1）適用范圍及添加限量均有明確規(guī)定。而在水果干類中，除了阿斯巴甜允許添加并作了相關(guān)規(guī)定外，其他均不得添加。

目前人工合成甜味劑的檢測(cè)分析主要集中在白酒、飲料、乳制品等方面，檢測(cè)方法主要有離子色譜法[5]、氣相色譜法[4]、毛細(xì)管電泳法[6]、高效液相色譜法[7-9]、離子色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[10]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[11-14]等。其中離子交換色譜法前處理過程較為復(fù)雜，氣相色譜法檢測(cè)甜味劑需要衍生化，步驟繁瑣。由于不同合成甜味劑的最大吸收波長(zhǎng)不一致，液相法很難滿足多種甜味劑同時(shí)檢測(cè)的要求。液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法是近年來(lái)食品檢測(cè)中常用的分析手段，具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高和抗基質(zhì)干擾能力強(qiáng)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于甜味劑的檢測(cè)。然而水果干中甜味劑的檢測(cè)分析報(bào)道較少，同時(shí)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中并沒有關(guān)于水果干類樣品的分析。因此此次試驗(yàn)通過對(duì)儀器參數(shù)和前處理?xiàng)l件的優(yōu)化，建立一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定葡萄干中人工合成甜味劑的方法。

圖1 6種人工合成甜味劑結(jié)構(gòu)式

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇、甲酸（HPLC級(jí)，德國(guó)CNW公司）；亞鐵氰化鉀和乙酸鋅（分析純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技有限公司）；超純水（18.2 MΩ·cm）。安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜標(biāo)準(zhǔn)品（美國(guó)Dr公司）。葡萄干來(lái)自新疆不同地區(qū)超市和農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，采集的葡萄干樣品先經(jīng)冷凍，然后進(jìn)行粉碎，制備好的樣品保存在-20 ℃冰箱中。

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀TQ-S（美國(guó)Waters公司）；MS3 basic漩渦混合器（德國(guó)IKA公司）；高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Sigma公司）；KQ-600DE超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器公司）；超純水儀（成都超純科技有限公司）。

1.3 儀器參數(shù)

1.3.1 色譜條件

BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積5 μL，流動(dòng)相為0.05%甲酸水（A）-乙腈（B），流速0.4 mL/min，梯度洗脫：0～3 min，95%～80%（A）；3～5 min，80%～10%（A）；5～6 min，10%～95%（A）。

1.3.2

電質(zhì)噴譜霧條離件子源，負(fù)離子電離（ESI-），脫溶劑氣800 L/h，干燥氣溫度400 ℃，錐孔氣50 L/h，離子源溫度150 ℃。在分析過程中，以離子對(duì)（1母離子和2個(gè)子離子）信息比較進(jìn)行定性分析；以母離子和響應(yīng)值最高的子離子進(jìn)行定量分析。6種人工合成甜味劑在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)離子對(duì)及質(zhì)譜條件

1.4 樣品處理

準(zhǔn)確稱取2.50 g制備好的葡萄干樣品，加入10 mL 0.1%甲酸水，充分渦旋混勻，超聲提取10 min。然后依次加入1 mL亞鐵氰化鉀和乙酸鋅，渦旋混勻后以10 000 r/min離心5 min。上清液轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中。在殘?jiān)欣^續(xù)加入10 mL 0.1%甲酸水渦旋混勻，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心5 min，合并上清液，用0.1%甲酸水定容至25 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，上機(jī)分析。

1.5 線性范圍及檢出限

6種人工合成甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：分別準(zhǔn)確量取適量6種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用0.1%甲酸水逐步稀釋成1，2，5，10，20，50，100和200 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)混合工作液。在優(yōu)化的色譜和質(zhì)譜條件下分析，以濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性擬合，分別得到6種甜味劑的線性方程和相關(guān)系數(shù)。分別計(jì)算3倍和10倍信噪時(shí)對(duì)應(yīng)的濃度，作為方法的檢出限和定量限。

1.6 回收率及精密度

為了考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，選取陰性葡萄干樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，分別添加低、中、高三個(gè)水平的6種甜味劑混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)添加水平連續(xù)重復(fù)測(cè)定6次。按照1.4小節(jié)進(jìn)行樣品前處理，在1.3.1小節(jié)的色譜條件和1.3.2小節(jié)的質(zhì)譜條件下測(cè)定，計(jì)算加標(biāo)樣品的回收率，同時(shí)計(jì)算其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜-質(zhì)譜分析

2.1.1 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化

分別配制質(zhì)量濃度為1 μg/mL的6種甜味劑單個(gè)標(biāo)準(zhǔn)溶液，由于甜味劑大多帶有羧基或羥基官能團(tuán)，在電噴霧離子源內(nèi)易形成負(fù)離子，且響應(yīng)強(qiáng)度較好。因此，通過對(duì)離子源參數(shù)、母離子、子離子、錐孔電壓、碰撞能量等參數(shù)的優(yōu)化，得到6種甜味劑的最佳質(zhì)譜參數(shù)，見表1。

2.1.2 分離條件的選擇

試驗(yàn)比較了不同有機(jī)相體系（甲醇和乙腈）與水相（添加甲酸）組成對(duì)6種甜味劑信號(hào)強(qiáng)度和分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在同樣的流速下，甲醇-水體系比乙腈-水體系產(chǎn)生的色譜柱壓力高，且超過了色譜柱最高耐壓值，因此選擇乙腈-水體系作為流動(dòng)相。同時(shí)比較了乙腈-水、乙腈-0.05%甲酸水和乙腈-0.1%甲酸水體系對(duì)6種甜味劑信號(hào)強(qiáng)度和分離效果的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，6種甜味劑在乙腈-水體系（圖2a）中較乙腈-甲酸水體系（圖2b）中峰形對(duì)稱性差、分離度低。在乙腈-甲酸水體系中，6種甜味劑在乙腈-0.05%甲酸水體系中響應(yīng)高于乙腈-0.1%甲酸水體系（圖3），故選取乙腈-0.05%甲酸水體系作為分離6種甜味劑的流動(dòng)相。

圖2 不同流動(dòng)體系下6種甜味劑的總離子流圖

圖3 不同流動(dòng)體系下6種甜味劑的響應(yīng)

2.2 提取條件的選擇

由于葡萄干樣品本身糖分含量較高，直接提取后，溶液很難通過濾膜，因此在提取過程中加入亞鐵氰化鉀和乙酸鋅進(jìn)行沉淀。結(jié)果發(fā)現(xiàn)提取溶液的通過性較好。根據(jù)甜味劑的結(jié)構(gòu)并結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)SN/T 3538—2013《出口食品中6種合成甜味劑的檢測(cè)方法液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法》[15]中甜味劑的提取方法，比較了純水、乙腈-水、甲醇-水、0.1%甲酸水、乙腈-0.1%甲酸水（體積比1∶1）、甲醇-0.1%甲酸水（體積比1∶1）6種體系的提取溶劑對(duì)6種甜味劑的提取效率。結(jié)果表明，純水、乙腈-水和乙腈-0.1%甲酸水3種體系對(duì)6種甜味劑的提取效率相對(duì)較低，有些組分回收率不足60%。而甲醇-0.1%甲酸水體系對(duì)6種甜味劑的提取效率較高，但是甜蜜素、阿斯巴甜和紐甜的回收率均超過130%，這可能是由于甲醇-0.1%甲酸水體系提取了葡萄干基質(zhì)中更多的其他組分，這些組分對(duì)甜味劑產(chǎn)生了基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)。0.1%甲酸水和甲醇-水這2種體系對(duì)6種甜味劑的提取效率均較好，但是當(dāng)0.1%甲酸水作為提取溶劑時(shí)，6種甜味劑的峰對(duì)稱性好（圖5a）；而當(dāng)甲醇-水作為提取溶劑時(shí)，安賽蜜和糖精鈉的峰均出現(xiàn)前伸，對(duì)稱性差（圖5b）。綜上分析，采用0.1%甲酸水作為提取溶劑，能有效地提取葡萄干中6種甜味劑。

圖4 不同提取溶劑下6種甜味劑的提取效率

圖5 不同提取溶劑下6種甜味劑的總離子流圖

2.3 線性相關(guān)性

采用外標(biāo)法定量，在上述儀器條件下進(jìn)行測(cè)定，以MS/MS定量離子色譜峰面積（y）對(duì)濃度（x）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求出相應(yīng)的線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)，6種甜味劑在相應(yīng)的濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系，且相關(guān)系數(shù)r均在0.99以上。按3倍信噪比和10倍信噪比計(jì)算，分別得到6種甜味劑的檢出限和定量限，結(jié)果見表2。安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的檢出限均為1 μg/kg，糖精鈉檢出限為2 μg/kg；安賽蜜、甜蜜素、阿斯巴甜、阿力甜和紐甜的定量限均為2.5 μg/kg，糖精鈉定量限為5 μg/kg。

2.4 方法的準(zhǔn)確度和精密度

按照1.6小節(jié)進(jìn)行回收率和精密度試驗(yàn)，計(jì)算加標(biāo)回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。從表3可以看出，陰性葡萄干樣品在3個(gè)添加水平下6種甜味劑的回收率在81.5%～ 106.7%之間，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.7%～6.9%之間。結(jié)果表明，該方法測(cè)定分析的結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。同時(shí)該方法將保留時(shí)間和化合物碎片信息結(jié)合，進(jìn)一步對(duì)化合物進(jìn)行定性，大大降低了檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性的可能。

表2 6種甜味劑的保留時(shí)間、線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

表3 6種甜味劑的平均回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.5 實(shí)際樣品的測(cè)定

圖6 6種甜味劑標(biāo)準(zhǔn)品和實(shí)際樣品的MRM圖

利用建立的方法對(duì)新疆地區(qū)不同品種的50個(gè)葡萄干樣品進(jìn)行6種甜味劑檢測(cè)，圖6分別是標(biāo)準(zhǔn)品（圖6a）和實(shí)際樣品（圖6b）的提取離子質(zhì)譜圖，結(jié)果均未檢出6種甜味劑，這說明在葡萄干的加工和銷售過程中，葡萄干在甜味劑的使用方面相對(duì)安全。

3 結(jié)論

此次試驗(yàn)通過對(duì)液相條件、質(zhì)譜條件和提取條件的優(yōu)化，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)定葡萄干中6種人工合成甜味劑的方法，并運(yùn)用該方法對(duì)新疆地區(qū)葡萄干樣品進(jìn)行測(cè)定。該方法前處理簡(jiǎn)單，靈敏度高，時(shí)間短，線性關(guān)系、準(zhǔn)確度和精密度良好，為葡萄干中人工合成甜味劑的檢測(cè)提供檢測(cè)依據(jù)，同時(shí)為水果干類中人工合成甜味劑的檢測(cè)提供技術(shù)參考。