醬香型白酒中氨基甲酸乙酯的快速檢測(cè)及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估

彭小東，李紅洲，談曉君，肖超，張建

1. 貴州省產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)檢測(cè)院（貴陽(yáng) 550014）；2. 國(guó)家酒類及加工食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（貴陽(yáng) 550014）

氨基甲酸乙酯（Ethyl Carbamate，EC），又稱尿烷，自然存在于發(fā)酵食品和飲料酒中，主要是在其發(fā)酵過(guò)程和存儲(chǔ)過(guò)程中產(chǎn)生[1-2]。早有研究表明，EC對(duì)動(dòng)物具有致癌作用，可導(dǎo)致動(dòng)物出現(xiàn)肺癌、淋巴癌和皮膚癌等疾病，其中對(duì)猴子的致癌作用表明EC對(duì)人類也可能存在致癌的風(fēng)險(xiǎn)[3-5]。2007年，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)將EC歸為2A類致癌物。許多國(guó)家在飲料酒中已有對(duì)EC最大允許限量進(jìn)行相關(guān)規(guī)定，雖然各國(guó)并不一致，但對(duì)蒸餾酒中EC的最大限量主要參考了加拿大的標(biāo)準(zhǔn)，為150 μg/L[6-7]。目前，國(guó)內(nèi)外暫時(shí)沒(méi)有針對(duì)中國(guó)白酒中EC的最大限量，但隨著人們對(duì)食品安全的日益關(guān)注以及中國(guó)白酒不斷走向世界，尤其是以茅臺(tái)為代表的醬香型白酒，對(duì)飲料酒安全方面的要求必將不斷提高。

目前，有關(guān)EC檢測(cè)的主要方法有GC-MS、LC-MS及HPLC-FLD等[8-10]，其中我國(guó)強(qiáng)制標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.223—2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中氨基甲酸乙酯的測(cè)定》是現(xiàn)階段最常用的檢測(cè)方法[11]，采用的是固相萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法，該方法具有靈敏度高、選擇性好和穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，但樣品的前處理過(guò)程較為繁瑣，檢測(cè)成本較高。為提高試驗(yàn)效率、簡(jiǎn)化前處理過(guò)程、節(jié)約試驗(yàn)成本，試驗(yàn)比較了液-液萃取和固相萃取2種前處理方式對(duì)EC提取的效果。同時(shí)，對(duì)來(lái)自100多家酒廠的326個(gè)醬香成品酒中的EC含量的監(jiān)測(cè)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（2018—2019年），并對(duì)醬香成品酒中的EC進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，為進(jìn)一步研究我國(guó)醬香白酒中EC提供數(shù)據(jù)支持，也為監(jiān)管部門(mén)制定白酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與材料

氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC-MS，5975C+7890A，EI源）；Milli-Q超純水裝置（美國(guó)，Millipore）；電子天平（梅特勒，感量為0.000 1 g）；旋渦混合儀（上海滬西分析儀器有限公司）。

氨基甲酸乙酯標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度99.0%，阿拉丁）；d5-氨基甲酸乙酯（純度98.0%，阿拉丁）；氯化鈉（分析純，國(guó)藥試劑）；乙酸乙酯（色譜純，F(xiàn)isher）；堿性硅藻土（Cat：HC1001000-9，Agela Technologies）；EC檢測(cè)專用商品柱（LOT：SBEQCA3999，CNW Technologies）。

酒樣：共326個(gè)酒樣，均為醬香成品酒（51%vol～ 54%vol）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

液-液萃取法：準(zhǔn)確移取2.0 mL酒樣于具塞玻璃離心管中，然后移取50 μL 5 μg/mL的氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)（d5-EC），加入0.5 g NaCl，渦旋振蕩溶解、混勻后，準(zhǔn)確加入2.0 mL乙酸乙酯，振蕩提取5 min，靜置分層后，吸取上層清液，待GC-MS上機(jī)分析。

固相萃取法：1）商品柱，參考標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.223—2014[11]的方法，準(zhǔn)確移取2.0 mL酒樣于具塞玻璃離心管中，然后加入50 μL 5 μg/mL的氨基甲酸乙酯內(nèi)標(biāo)（d5-EC）、0.3 g氯化鈉，超聲溶解，混勻，加樣到固相萃取柱上，在真空條件下將樣品溶液緩慢滲入萃取柱中，靜置10 min。經(jīng)10 mL正己烷淋洗，用10 mL 5%乙酸乙酯-乙醚溶液以約1 mL/min流速進(jìn)行洗脫，洗脫液經(jīng)裝有2 g無(wú)水硫酸鈉脫水后，收集于10 mL氮吹管中，室溫下氮?dú)獯抵良s0.5 mL，甲醇定容至1.00 mL制成待測(cè)液，供GC/MS分析。2）手動(dòng)填充固相萃取柱，準(zhǔn)確稱取4 g堿性硅藻土填充至10 mL的塑料針筒中（底部墊適量脫脂棉），制成固相萃取柱，其他前處理步驟同1）。

空白樣，用無(wú)水乙醇配制成53%vol酒精水溶液，其他處理同上。

1.2.2 GC-MS條件

氣相色譜條件：色譜柱，Agilent HP-INNOWAX石英毛細(xì)管柱，30 m×0.25 mm×0.25 μm；進(jìn)樣口溫度，220 ℃；載氣，氦氣，純度≥99.99%；流速，1 mL/min；進(jìn)樣方式，不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣體積，1 μL。程序升溫：50 ℃保持1 min，以8 ℃/min升至180 ℃。

質(zhì)譜條件：EI電離源，電子能量70 eV，離子源溫度，300 ℃；掃描范圍，m/z 45～600；采用多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（T-SRM）模式。EC選擇監(jiān)測(cè)離子m/z 44，62和89，定量離子m/z 62；d5-EC選擇監(jiān)測(cè)離子m/z 64，44和89，定量離子m/z 64。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

EC、d5-EC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：分別準(zhǔn)確稱取0.01 g（精確到0.000 1 g）EC和d5-EC標(biāo)準(zhǔn)品，分別置于兩個(gè)10 mL的容量瓶中，加入色譜甲醇溶解后，定容至刻度，質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液：用色譜甲醇對(duì)EC標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液進(jìn)行梯度稀釋，得到10，20，50，100，200和400 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液（內(nèi)含125.0 ng/mL的d5-EC）。

1.2.4 計(jì)算公式

1) EC含量按式（1）計(jì)算。

式中：X為樣品中EC的含量，μg/L；C為標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的樣品中EC的質(zhì)量濃度，ng/mL；C0為空白EC的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為提取液體積，mL；v為取樣體積，g；d為稀釋倍數(shù)。

2) 暴露邊界比（Margin of Exposure，MOE）按式（2）計(jì)算[12]。

式中：MOE為暴露邊界值；BMDL為基準(zhǔn)劑量下限，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)得到的基準(zhǔn)劑量下限值，mg/（kg·bw）；人群估計(jì)攝入量表示調(diào)查所得到的人群估計(jì)攝入值，mg/（kg·bw）。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

由圖1可知，d5-EC與EC的保留時(shí)間分別為13.645和13.735 min。

圖1 EC及d5-EC的總離子色譜圖

以EC與內(nèi)標(biāo)d5-EC響應(yīng)之比為橫坐標(biāo)，質(zhì)量濃度之比為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖2。EC在10～400 ng/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性良好，回歸方程：Y=1.470X+0.006 693，相關(guān)系數(shù)r2=1.000，以信噪比（S/N）的3倍計(jì)算檢出限，當(dāng)取樣量為2.0 mL時(shí)，EC的方法檢出限為1.2 μg/L。

圖2 EC的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同前處理方法的回收率

準(zhǔn)確移取2 mL醬香酒樣，檢測(cè)其EC的本底值，為56.01 μg/L。之后分別加入50，100和150 ng/mL的EC標(biāo)準(zhǔn)品溶液（內(nèi)含125 ng/mL的d5-EC），每個(gè)濃度做3個(gè)平行，進(jìn)行加標(biāo)試驗(yàn)，計(jì)算EC的平均回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），比較液-液萃取法和固相萃取法兩種前處理方式的提取效果，結(jié)果見(jiàn)表1。

液-液萃取法和固相萃取法（商品柱）均具有很好的回收率（回收率范圍在92.50%～102.12%之間），精密度也均很好（RSD＜3.64%），二者差異不明顯。手動(dòng)填充的固相萃取柱的回收率（83.62%～ 90.93%）和精密度（3.99%～8.55%）均較之前二者要低，這與人工手動(dòng)填充的固相萃取柱中的堿性硅藻土的密度不均勻，上樣及洗脫的過(guò)程中易產(chǎn)生氣泡有關(guān)，影響了回收率和穩(wěn)定性。由于固相萃取法的前處理過(guò)程較為復(fù)雜，較為耗費(fèi)時(shí)間，而且商品柱的費(fèi)用高，因此試驗(yàn)采用液-液萃取的前處理方法。

2.3 方法的精密度

選取3個(gè)EC含量不同的醬香成品酒，每個(gè)樣品做3個(gè)平行，按照1.2.1的方法（液-液萃取法）進(jìn)行前處理，上機(jī)分析，根據(jù)所得EC結(jié)果計(jì)算方法精密度（RSD），結(jié)果見(jiàn)表2。3個(gè)醬香型白酒中的EC所測(cè)數(shù)據(jù)的RSD＜2.91%，方法精密度良好。

表1 不同萃取方式EC的加標(biāo)回收率

表2 EC檢測(cè)方法的精密度

2.4 醬香成品白酒中EC含量的分布MOE危險(xiǎn)性評(píng)估

醬香成品酒中EC的檢測(cè)結(jié)果及分布情況見(jiàn)圖3和表3。結(jié)果顯示，326份醬香成品酒中，99.4%的酒樣中檢出了EC，平均含量為86.9 μg/L，其中有10.4%的酒樣EC含量超過(guò)了加拿大規(guī)定的蒸餾酒中EC的限量標(biāo)準(zhǔn)（150 μg/L），最高含量達(dá)359.4 μg/L，為限量標(biāo)準(zhǔn)的2.4倍。

圖3 醬香成品酒EC含量散點(diǎn)圖

EC的基準(zhǔn)劑量下限值（BMDL）每天為0.3 mg/（kg·bw）[13]。根據(jù)《2018年度醬酒報(bào)告》[14]，2018年全國(guó)醬香白酒總銷售量約6×108L，醬香型白酒的消費(fèi)人群占比在20%左右，對(duì)應(yīng)2018年人口（139 538萬(wàn)人）比值得到人均飲酒量為0.005 9 L/d。按醬香成品酒EC含量的平均水平（86.9 μg/L）計(jì)算，不考慮其他EC攝入途徑，人群估計(jì)攝入量每天為8.55 ng/（kg·bw）（人群標(biāo)準(zhǔn)體重以60 kg計(jì)），MOE值為35 088。基于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，當(dāng)MOE值＜10 000時(shí)，致癌風(fēng)險(xiǎn)較大，MOE越小，致癌風(fēng)險(xiǎn)越大[15]。由此可知，醬香型白酒中EC對(duì)人群的致癌風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較小。

表3 醬香成品酒中的EC含量

3 結(jié)論

采用GC-MS法對(duì)醬香型白酒中的EC進(jìn)行檢測(cè)分析，比較了液-液萃取法和固相萃取法兩種前處理方式，結(jié)果發(fā)現(xiàn)液-液萃取法與固相萃取法（商品柱）的回收率和精密度均很好；而手動(dòng)填充的堿性硅藻土固相萃取柱的回收率和精密度均低于二者。從前處理步驟的難易程度及試劑耗材的成本考慮，最終選擇液-液萃取法作為此次試驗(yàn)的前處理方法。該方法提高了提取效率，節(jié)約了試驗(yàn)成本，縮短了分析時(shí)間，適合大批量樣品的實(shí)驗(yàn)分析，EC的加標(biāo)回收率為92.5%～100.23%，檢出限為1.2 μg/L，相關(guān)系數(shù)r2=1.000，精密度RSD＜3%，表明該方法穩(wěn)定、靈敏度高。

此次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)326份醬香成品酒中有99.4%的酒樣檢出EC，表明EC普遍存在于醬香型白酒中，EC的平均含量為86.9 μg/L，其中10.4%的酒樣中EC的含量高于國(guó)際常用蒸餾酒限量標(biāo)準(zhǔn)（150 μg/L）。醬香成品酒中EC的MOE值為35 088，致癌風(fēng)險(xiǎn)相對(duì)較低，但不同酒廠的生產(chǎn)工藝各異，EC含量相差也較大，最高含量可達(dá)359.4 μg/L，為國(guó)際常用蒸餾酒限量標(biāo)準(zhǔn)的2.4倍，因此降低醬香白酒中EC的含量勢(shì)在必行，而現(xiàn)階段我國(guó)尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定白酒中EC的限量，應(yīng)盡快制定相應(yīng)的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，以標(biāo)準(zhǔn)促進(jìn)生產(chǎn)、規(guī)范生產(chǎn)，才能更好地保護(hù)消費(fèi)者的飲食健康。