氣相色譜質(zhì)譜法檢測(cè)雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺

喬青青，郝莉花，鞏凡，劉燕，趙芳

1. 河南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)院（鄭州 450047）；2. 河南省食品安全數(shù)據(jù)智能重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（鄭州 450047）

氟苯尼考又名氟甲砜霉素，是新一代氯霉素類動(dòng)物專用廣譜抗生素，其抗菌廣譜、吸收好、體內(nèi)分布廣、安全高效，近年來(lái)已在美洲、亞洲和歐洲的20多個(gè)國(guó)家生產(chǎn)銷售，被廣泛用于畜牧和水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1-3]。隨著氟苯尼考在養(yǎng)殖中大量、不規(guī)范應(yīng)用，它在畜禽、水產(chǎn)品等動(dòng)物性食品中的殘留問題也日益被重視[4-6]。氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)會(huì)迅速代謝，主要代謝物為氟苯尼考胺。中國(guó)、美國(guó)及歐盟均規(guī)定了動(dòng)物組織中氟苯尼考的最大殘留限量[1]，農(nóng)業(yè)部235號(hào)公告《動(dòng)物性食品中獸藥最高殘留限量》中規(guī)定了氟苯尼考在動(dòng)物食品中的最大殘留量，標(biāo)志殘留物為氟苯尼考胺[9]。最新公布的GB 31650—2019《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中獸藥最大殘留限量》中修訂了氟苯尼考在動(dòng)物體內(nèi)的標(biāo)志殘留物為氟苯尼考及氟苯尼考胺，同時(shí)規(guī)定家禽產(chǎn)蛋期禁用[10]。因此，建立雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同時(shí)測(cè)定的方法具有重要的意義。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)氟苯尼考及氟苯尼考胺的殘留檢測(cè)方法雖有報(bào)道[11-16]，但氟苯尼考和氟苯尼考胺極性差異大，若直接使用液相色譜質(zhì)譜法測(cè)定較難維護(hù)色譜條件，衍生后使用氣相色譜單級(jí)質(zhì)譜法測(cè)定容易被假陽(yáng)性干擾。研究建立的采用氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜法同時(shí)檢測(cè)雞蛋中氟苯尼考及其代謝物氟苯尼考胺的殘留。該方法針對(duì)雞蛋的基質(zhì)，通過衍生消除了極性差異，采用的飛行時(shí)間質(zhì)譜法提高分辨率可以降低假陽(yáng)性的干擾，因此，該方法適合同時(shí)檢測(cè)雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺的殘留。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

氟苯尼考、氟苯尼考胺標(biāo)準(zhǔn)品（Dr. Ehrenstorfer）；雞蛋，市售；乙腈（TEDIA，色譜級(jí)）；

HLB固相萃取柱（60 mg，Oasis，PRiME HLB）；C18固相萃取柱（100 mg，Agilent Bond Elut C18）；氨水、乙酸乙酯、正己烷（分析純）；衍生化試劑：N, O-雙（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（BSTFA）：三甲基氯硅烷（TMCS）（99∶1）（macklin）；試驗(yàn)用水為一級(jí)水。

氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（Agilent，7200，配有CI離子源）；旋渦混合器（Vortex Mixer，QL-866）；高速冷凍離心機(jī)（Dynamica，Velocity 14R）；氮吹儀（廈門科睿特，TTL-DC）；電子天平（上海箐海儀器有限公司，F(xiàn)A2004N）。

1.2 樣品前處理

雞蛋樣品經(jīng)去殼，均勻制備后，準(zhǔn)確稱?。?± 0.2）g試樣，精確到0.000 1 g，于50 mL具塞塑料離心管中，加25 mL 98∶2乙酸乙酯-氨水溶液，渦動(dòng)1 min，以12 000 r/min離心5 min，取上清液于50 mL離心管中。殘?jiān)尤?5 mL乙酸乙酯-氨水溶液，重復(fù)提取2次，合并有機(jī)相，50 ℃水浴氮吹吹干。

凈化：準(zhǔn)確加入3 mL水溶解混勻并準(zhǔn)確量取1 mL于活化后的C18固相萃取小柱，加入4 mL水并控制流速2～3 mL/min，抽干后再加入6 mL甲醇并控制流速2～3 mL/min，抽干并收集甲醇相，50 ℃氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.3 衍生化

在氮?dú)獯蹈傻奶崛∥镏屑尤?00 μL乙腈復(fù)溶，再加入衍生化試劑100 μL，蓋塞并渦旋混合20 s，在60 ℃水浴反應(yīng)30 min。取出冷卻至室溫，在50 ℃的水浴中氮?dú)獯蹈桑瑴?zhǔn)確加入1.0 mL正己烷，渦旋混勻，供氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜測(cè)定。

1.4 儀器條件

色譜條件：色譜柱Agilent HP-5MS UI（30 m× 0.25 mm×0.25 μm）彈性石英毛細(xì)管柱；載氣，He（99.999%）；恒流模式，柱流量1.2 mL/min；不分流進(jìn)樣，進(jìn)樣量1 μL；進(jìn)樣口溫度250 ℃；柱初始溫度60 ℃，保持1 min，程序升溫以20 ℃/min至160 ℃，然后10 ℃/min至260 ℃保持3 min；傳輸線溫度280 ℃。質(zhì)譜條件：負(fù)化學(xué)源（NCI）；離子源溫度，150 ℃；接口溫度，250 ℃；反應(yīng)氣，甲烷（純度≥99.99%）；溶劑延遲時(shí)間，13 min；采集模式，SCAN，掃描m/z= 180～450；采集速率5.00質(zhì)譜圖/s。

1.5 測(cè)定方法

取樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液各1 μL，通過自動(dòng)進(jìn)樣器注入氣相色譜儀中進(jìn)行分析，以保留時(shí)間、定性離子豐度比定性，定量離子豐度外標(biāo)法計(jì)算樣品中氟苯尼考和氟苯尼考胺的含量。目標(biāo)化合物特征離子質(zhì)荷比見表1，質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物質(zhì)譜圖

表1 氟苯尼考和氟苯尼考胺硅烷化衍生物特征離子質(zhì)荷比

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

母液配制：用感量0.000 1 g的電子天平準(zhǔn)確稱取10.0 mg標(biāo)準(zhǔn)品，溶于10.00 mL甲醇中，配成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)母液。

基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作：將母液加入至提取、凈化后的陰性樣品殘?jiān)?，配制?，5，10，50和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，取1.00 mL工作溶液，氮?dú)獯蹈珊笱苌?，以進(jìn)樣濃度為橫坐標(biāo)、定量離子豐度為縱坐標(biāo)，作基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 固相萃取柱洗脫溶劑的優(yōu)化

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白基質(zhì)中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標(biāo)量100 μg/kg，分別使用2，3，4，5和6 mL水淋洗小柱，后用6 mL甲醇淋洗，洗脫后溶液經(jīng)處理，儀器測(cè)定，以化合物加標(biāo)回收率指標(biāo)做單因素試驗(yàn)，考察結(jié)果如圖2所示。

由圖2可以看出，洗脫劑水的用量會(huì)顯著影響氟苯尼考胺的回收率，洗脫量為4 mL時(shí)，回收率為70%，已經(jīng)不滿足檢驗(yàn)回收率要求；洗脫量為3 mL時(shí)，可以保證氟苯尼考、氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，同時(shí)也能夠盡可能將極性雜質(zhì)洗脫出來(lái)。

圖2 洗脫劑水的用量對(duì)回收率的影響

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入空白基質(zhì)中，然后加入已活化的C18固相萃取柱，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標(biāo)量100 μg/kg，使用3 mL水淋洗小柱，抽干后分別使用4，5，6，7和8 mL甲醇淋洗，洗脫后溶液經(jīng)處理，儀器測(cè)定，以化合物加標(biāo)回收率指標(biāo)做單因素試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，當(dāng)洗脫劑甲醇用量超過5 mL時(shí)，氟苯尼考和氟苯尼考胺的回收率在90%～110%，滿足檢驗(yàn)回收率要求，這說明這2種化合物已經(jīng)洗脫出小柱，洗脫量的增加會(huì)導(dǎo)致弱極性雜質(zhì)同時(shí)洗脫出來(lái)，影響檢驗(yàn)效果，因此甲醇用量應(yīng)盡可能減少，然而氟苯尼考胺在甲醇用量超過6 mL時(shí)才能充分洗脫，因此甲醇用量在6 mL較合適，在此條件下，2種化合物回收率均在90%～110%，滿足檢驗(yàn)回收率要求。

圖3 洗脫劑甲醇的用量對(duì)回收率的影響

2.2 溶劑提取次數(shù)對(duì)回收率的影響

將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液加入均質(zhì)好的樣品中，氟苯尼考與氟苯尼考胺加標(biāo)量100 μg/kg，渦旋混勻，然后加入25 mL氨化乙酸乙酯，渦旋混勻后放入離心機(jī)，以12 000 r/min，離心5 min，用吸管將上清液轉(zhuǎn)移并凈化后上機(jī)測(cè)試，重復(fù)提取過程，以化合物累計(jì)回收率為指標(biāo)，提取次數(shù)對(duì)提取量的影響見圖4。

由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)增加，3種化合物累計(jì)回收率均升高，當(dāng)提取次數(shù)2次時(shí)，回收率已經(jīng)超過80%，回收率和檢出限均可以滿足檢驗(yàn)要求。因此將提取次數(shù)設(shè)定為2次可以滿足檢驗(yàn)要求。

圖4 提取次數(shù)對(duì)回收率的影響

試驗(yàn)將溶劑用量減少至15 mL或20 mL，離心后上清液較難吸取，不易操作，因此單次萃取量25 mL較適宜。

2.3 線性范圍、檢出限、精密度、回收率

用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)母液配制成2，5，10，50和100 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，做線性回歸，氟苯尼考R2= 0.999，氟苯尼考胺R2=0.998。通過陰性樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)品的方法進(jìn)行檢出限試驗(yàn)。結(jié)果顯示，氟苯尼考和氟苯尼考胺添加水平為0.5 μg/kg，當(dāng)質(zhì)量提取精確度為0.002%時(shí)，信噪比S/N為5.6和3.7，由此可以確定該方法氟苯尼考和氟苯尼考胺的檢出限為0.5 μg/kg。在已知的陰性樣品中分別添加0.5，1.5和10.0 μg/kg的3個(gè)水平2種標(biāo)準(zhǔn)品的混合工作溶液，每個(gè)水平重復(fù)3次，氟苯尼考及氟苯尼考胺的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）（n=3）見表2。

表2 雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD（n=3）

3 結(jié)論

試驗(yàn)建立了氣相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜同時(shí)檢測(cè)雞蛋中氟苯尼考和氟苯尼考胺殘留的方法，采用C18固相萃取柱作為前處理凈化柱能夠保證目標(biāo)化合物具有較高回收率。試驗(yàn)采用的衍生方案消除了氟苯尼考與氟苯尼考胺較大的極性差異，采用的飛行時(shí)間質(zhì)譜法提高分辨率，可以降低假陽(yáng)性的干擾，該方法簡(jiǎn)單、快速、高效，可用于雞蛋中氟苯尼考及氟苯尼考胺的同時(shí)測(cè)定。