HPLC-RID同時(shí)測(cè)定艾納香油中5種活性成分的含量

陳前袆 ，曹春月 ，陳偉，王魯，何珺*

1. 貴州大學(xué)藥學(xué)院（貴陽(yáng) 550025）；2. 西南特色藥用生物資源開發(fā)利用教育部工程研究中心（貴陽(yáng) 550025）

艾納香（Blumea balsamifera（L.）DC）為菊科艾納香屬多年生木質(zhì)草本植物[1]，是提取艾納香油、艾片以及艾粉的天然原料。艾納香油可通過對(duì)艾納香進(jìn)行水蒸氣蒸餾法、浸提法或溶劑提取法提取得到，其中主要含有L-龍腦、芳樟醇、樟腦、花椒油素、1-辛烯-3-醇、β-蒎烯、α-葎草烯等多種活性成分[2-3]。左旋龍腦[4]、芳樟醇[5-6]、樟腦[7]等具有很好的抑菌抗炎作用，花椒油素[8]具有抑制血小板聚集作用，1-辛烯-3-醇可用于食品添加劑。艾納香油被廣泛應(yīng)用于藥品行業(yè)，是我國(guó)貴州省特色藥例“咽立爽滴丸”“萬(wàn)金香氣霧劑”等的主要原料[9]。

目前關(guān)于艾納香油的報(bào)道主要集中于艾納香油的藥理作用[10-11]、GC-MS化學(xué)成分分析[12]方面，GC檢測(cè)艾納香油中活性成分含量也有部分報(bào)道。陳寶雯等[13]建立了同時(shí)測(cè)定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、L-樟腦、L-龍腦、β-石竹烯、花椒油素含量的方法。吳麗芬等[14]建立GC法同時(shí)測(cè)定艾納香油中β-蒎烯、芳樟醇、樟腦、L-龍腦、β-石竹烯5個(gè)成分的含量。陳貴等[15]建立GC法同時(shí)測(cè)定艾納香油中左旋龍腦、樟腦、β-石竹烯3種成分的含量。對(duì)于建立艾納香油液相測(cè)定方法還未見報(bào)道，而利用HPLC檢測(cè)手段測(cè)定左旋龍腦、β-石竹烯等已有部分報(bào)道。例如：RP-HPLC測(cè)定艾納香中花椒油素的含量[16]；HPLC-RID同時(shí)測(cè)定咽立爽口含滴丸中樟腦、石竹烯、龍腦、異龍腦含量[17]。此次試驗(yàn)建立HPLC-RID同時(shí)測(cè)定艾納香油中花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇5種活性成分的含量，其中關(guān)于艾納香油中1-辛烯-3-醇的含量測(cè)定還未見有相關(guān)報(bào)道。此次試驗(yàn)建立的HPLC-RID方法可為今后艾納香油的質(zhì)量控制及開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

BT25S型電子分析天平：塞多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；安捷倫1100型液相分析色譜儀（RID檢測(cè)器，安捷倫科技有限公司）；C18高效液相色譜柱（日本島津分析儀器有限公司）；其他為一般常規(guī)儀器。

1.2 對(duì)照品

芳樟醇對(duì)照品（批號(hào)BCBV9483，德國(guó)SIGMA公司）；花椒油素對(duì)照品（批號(hào)AW13，Absin公司）；1-辛烯-3醇對(duì)照品（批號(hào)BCBV4944，德國(guó)SIGMA公司）；左旋龍腦對(duì)照品（批號(hào)B118615，Aladdin公司）、樟腦對(duì)照品（批號(hào)HH5S-R43G，中國(guó)食品藥品檢定研究所）。上述對(duì)照品均供含量測(cè)定用。

1.3 樣品

艾納香油于2017年11月3日分別購(gòu)自貴州省羅甸縣紅水河鎮(zhèn)平亭村（S1）、貴州省羅甸艾利康藥業(yè)（S2）、貴州省羅甸全興藥業(yè)（S3）、貴州省羅甸艾原生態(tài)藥業(yè)（S4）；2016年11月6日購(gòu)自貴州省羅甸艾利康藥業(yè)（S5）；2015年購(gòu)于貴州省羅甸艾利康藥業(yè)（S6）。2018年12月購(gòu)自貴州省望謨（S7）；2019年購(gòu)自江西海麟香料有限公司6批：其生產(chǎn)時(shí)間分別為2019年10月（S8），2019年9月（S9），2018年1月（S10），2016年4月（S11），2017年5月（S12）和2019年11月（S13）。

1.4 試劑

甲醇（色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品儲(chǔ)備液的制備

供試品儲(chǔ)備液的制備：分別取50 mg S1～S13樣品，加甲醇溶解并定容至5 mL，作為供試品溶液儲(chǔ)備液。

2.2 混合對(duì)照品及供試品溶液的制備

混合對(duì)照品溶液的制備：取適量花椒油素對(duì)照品、樟腦對(duì)照品、1-辛烯-3-醇對(duì)照品、左旋龍腦對(duì)照品、芳樟醇對(duì)照品，加甲醇定容至5 mL，制成質(zhì)量濃度分別為0.279，0.362，0.455，0.430和0.448 mg/mL的溶液，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液的制備：分別取0.5 mL 2.1小節(jié)制備的供試品儲(chǔ)備液，加甲醇定容至3 mL，得供試品溶液。

2.3 色譜條件

Supersil-T C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。

3 結(jié)果與分析

3.1 系統(tǒng)適用性

精密量取5 μL 2.2小節(jié)制備的同一批供試品溶液與混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC分析，記錄色譜圖，見圖1和圖2。

圖1 混合對(duì)照品HPLC圖

圖2 艾納香油樣品HPLC圖

3.2 線性關(guān)系考察

精密吸取適量2.2小節(jié)制備的不同體積混合對(duì)照品溶液，分別置于5 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，得到系列濃度的混合對(duì)照品溶液。分別精密吸取5 μL系列濃度的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC-RID分析。以左旋龍腦、芳樟醇、花椒油素等5種對(duì)照品的濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸分析，結(jié)果見表1。取適量各對(duì)照品溶液，用甲醇稀釋成不同濃度后直接進(jìn)樣，直到某一濃度出峰是儀器噪音的3倍時(shí)，得到儀器檢出限，再乘以方法的稀釋倍數(shù)除以方法的稱樣量得到方法的檢出限。

表1 艾納香油中5種成分的線性關(guān)系考察結(jié)果

3.3 精密度試驗(yàn)

精密吸取5 μL 2.2小節(jié)制備的混合對(duì)照品溶液進(jìn)行HPLC-RID分析，重復(fù)進(jìn)樣6次進(jìn)行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測(cè)得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，分別為0.90%，0.53%，0.92%，0.64%和0.74%。表明儀器的精密度良好。

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

精密稱取6份同一供試品，按2.1小節(jié)對(duì)供試品進(jìn)行溶解并定容，得到供試品溶液，分別精密吸取5 μL上述供試品溶液進(jìn)行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測(cè)得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，分別為0.59%，1.12%，1.27%，1.26%和1.29%。表明此方法重復(fù)性良好。

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取6份5 μL 2.1小節(jié)制備的同一供試品溶液，分別于0，2，4，8，12和24 h在上述最佳色譜條件下進(jìn)行HPLC-RID分析，記錄色譜圖。測(cè)得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦及芳樟醇的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD，分別為0.90%，1.42%，1.48%，1.49%和1.18%。表明艾納香油樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

分別精密量取適量2.2小節(jié)制備的同一批供試品溶液，添加低（80%）、中（100%）、高（120%）三個(gè)水平的標(biāo)樣，溶解，搖勻，得到該試驗(yàn)項(xiàng)下的供試品溶液，備用。精密量取5 μL供試品溶液，在上述最佳色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜圖。測(cè)得花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦、芳樟醇的平均回收率，分別為99.626 9%（RSD=1.15%），100.500%（RSD=1.29%），99.575%（RSD=0.97%），99.634%（RSD=1.45%）和99.614%（RSD=1.45%）。

表2 艾納香油中各活性成分的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

3.7 樣品含量測(cè)定結(jié)果

精密吸取5 μL 2.1小節(jié)制備的13批供試品儲(chǔ)備液，測(cè)定1-辛烯-3-醇和芳樟醇的總含量，重復(fù)測(cè)定3次，記錄色譜圖。精密吸取5 μL 2.2小節(jié)制備的13批供試品溶液，測(cè)定花椒油素、樟腦及左旋龍腦的總含量，重復(fù)測(cè)定3次，記錄色譜圖。計(jì)算出各批次艾納香油各活性成分的含量范圍：花椒油素26.264～54.410 mg/g、樟腦26.065～66.745 mg/g、1-辛烯-3-醇6.171～ 15.341 mg/g、左旋龍腦83.678～151.762 mg/g和芳樟醇4.780～12.953 mg/g。

表3 13批艾納香油中各活性成分的含量測(cè)定結(jié)果（n=3） mg/g

4 討論與結(jié)論

前期利用HPLC-DAD技術(shù)對(duì)該5種活性成分進(jìn)行含量測(cè)定探究，其中左旋龍腦對(duì)照品與樟腦對(duì)照品在HPLC-DAD技術(shù)下其紫外吸收十分弱，以至于在紫外下幾乎無(wú)峰出現(xiàn)，艾納香油樣品中的左旋龍腦在紫外下也無(wú)峰顯現(xiàn)，同時(shí)1-辛烯-3醇、芳樟醇的紫外吸收也相對(duì)較弱，使得樣品中該2種活性成分的峰很小，而花椒油素的紫外吸收較強(qiáng)，在常用360 nm下仍有紫外吸收，但是出峰時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，因此HPLC-DAD技術(shù)無(wú)法同時(shí)測(cè)定左旋龍腦、花椒油素、芳樟醇、1-辛烯-3-醇及樟腦的含量，并浪費(fèi)時(shí)間與試劑。相對(duì)HPLC-DAD技術(shù)，此次試驗(yàn)采用的HPLC-RID方法簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)便，且各活性物質(zhì)的出峰時(shí)間很短，能同時(shí)測(cè)定該5種活性成分的含量，因此節(jié)省了大量的時(shí)間、精力及金錢。

在流動(dòng)相選擇上，比較了70%甲醇水、60%甲醇水和50%甲醇水對(duì)艾納香油樣品中活性成分分離度的影響，結(jié)果表明60%甲醇水較為適宜，70%甲醇水條件下樣品的分離度差，分離不好，50%甲醇水條件下艾納香油樣品出峰時(shí)間過長(zhǎng)，樣品的峰面積低，故綜合選擇60%甲醇水為最佳流動(dòng)相。

此次試驗(yàn)建立了HPLC-RID方法檢測(cè)樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦、花椒油素與芳樟醇的含量。色譜條件：Supersil-T C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm），流動(dòng)相甲醇-水（60∶40，V/V）等度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃，進(jìn)樣量5 μL。艾納香油中花椒油素、樟腦、1-辛烯-3-醇、左旋龍腦與芳樟醇的含量范圍分別為26.264～54.410，26.065～66.745，6.171～15.341，83.678～151.762和4.780～12.953 mg/g。試驗(yàn)表明，不同批次的艾納香油中相同活性成分的含量差異較大，整體情況而言，左旋龍腦的含量最高，1-辛烯-3-醇的含量較低。此次試驗(yàn)所建立的液相檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便，樣品處理簡(jiǎn)便化；通過相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證表明方法專屬性強(qiáng)，檢測(cè)靈敏度高，回收率好，重復(fù)性高，分析準(zhǔn)確，為今后艾納香油的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)，以及為只有HPLC沒有GC的中藥廠家及科研單位提供另一種檢測(cè)方法，同時(shí)為艾納香油質(zhì)量控制與藥效基礎(chǔ)研究提供不同的檢測(cè)方法，為艾納香油質(zhì)量檢測(cè)及綜合控制奠定基礎(chǔ)。