不同種類固相萃取柱對特醫(yī)食品中香料含量結果的影響

吳纖愫，鄭平安，周勇，陳才軍

1. 舟山市食品藥品檢測檢驗研究院（舟山 316021）；2. 浙江海力生生物科技股份有限公司（舟山 316021）

香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、麥芽酚和乙基麥芽酚等是食品中重要的增香劑。增香劑具備彌補食品本身味道缺陷、賦予或加強食品生動滋味的特點，被廣泛應用于食品，特別是乳制品、固體飲料、保健食品、特醫(yī)食品中[1-2]。添加食品級香料不會出現(xiàn)食品質量安全問題，但如果超標使用或者帶入，則會對人體造成潛在性危害，嬰幼兒、危重患者及圍手術期病人是對有害物質最敏感的群體[3-4]。特醫(yī)食品是為滿足進食受限，消化吸收障礙或代謝紊亂等這些最敏感的群體，專門加工配制而成的配方食品[5-7]。因此建立特醫(yī)食品中香精香料的檢測方法具有重要意義。

國內較多文獻中有關于香蘭素、乙基香蘭素等添加劑的檢測方法，主要有毛細管電泳法、液相色譜法、液相色譜-質譜法、氫火焰-氣相色譜法、伏安法、氣相色譜-質譜法等，多是應用于乳制品、牛奶、飲料等食品中[8-9]。對這些樣品而言，成分都過為單一，并沒有針對特醫(yī)食品的檢測方法，在樣品處理方法和檢測的靈敏度與特醫(yī)食品存在差異。在特醫(yī)食品中需要考察基質效應對含量準確性的影響，現(xiàn)有標準均不能滿足具有復雜基質的特醫(yī)食品檢測的需要。最新的有關文獻中有GC-MS和LC-MS這2種檢測技術來檢測食品中香料，但前處理操作復雜，儀器運行成本較為昂貴，不能很好滿足基層檢測單位的實驗室推廣應用。因此，需要對上述方法進行優(yōu)化和建立簡單易行的固相萃取檢測技術來滿足特醫(yī)食品中食用香精香料的檢測需要[10]。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

特殊醫(yī)學用途配方食品；香蘭素（純度99.9%）、香草酸（純度98.9%）、愈創(chuàng)木酚（純度98.9%）、4-羥基苯甲酸（純度99.9%）（上海安譜實驗科技股份有限公司）；乙基香蘭素（純度98.5%）（美國Sigma）；甲基香蘭素（純度98%）、乙基麥芽酚（純度98%）、鄰香草醛（純度97%）（加拿大TRC公司）；麥芽酚（純度99.8%）、丁香酚（純度99.0%）、香豆素（純度99.7%）（德國Dr. Ehrenstorfer）。

甲醇（色譜純，德國Meker公司）；磷酸（GR級，國藥集團化學試劑有限公司）；色譜柱Poroshell 120 SB-Aq（4.6 mm×100 mm，2.7 μm，美國安捷倫），Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，月旭科技（上海）股份有限公司）；固相萃取柱Welchrom?C18E（150 mg/6 mL）、Welchrom?P-SAX（150 mg/6 mL）、Welchrom P-WAX（150 mg/6 mL）（月旭科技（上海）股份有限公司），Poly-Sery HLB（500 mg/6 mL，上海安譜試驗科技股份有限公司），Captive EMR-Lipid小柱（600 mg/6 mL，美國安捷倫公司）；防交叉污染固相萃取裝置（SUPELCO VISIPREP 24TM DL，美國Supelco公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 標準儲備液及工作液的配制

將11個標準品分別精密稱取至20 mL容量瓶中，加甲醇配制成單個標準溶液。質量濃度分別為2.572 5，3.010 0，3.036 2，3.305 1，2.655 5，2.732 3，4.049 8，2.557 3，3.048 6，3.198 7和4.812 7 mg/mL，于-18 ℃冷凍保存。分別精密移取2.5 mL單個標準液，用甲醇準確定容至50 mL容量瓶，混勻后得到混合標準中間液1；精密移取1.0 mL混合標準中間液1，用甲醇準確定容至50 mL容量瓶，混勻得到混合標準中間液2。精密移取11種標準溶液各1.00，0.50，0.20，0.10，0.05和0.02 mL，分別置于20 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得系列標準曲線。

1.2.2 液相色譜條件

色譜柱：Poroshell 120 SB-Aq（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；DAD檢測波長280 nm；進樣體積5 μL；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；流動相：A 0.1%磷酸水溶液；B甲醇；梯度洗脫條件見表1。

1.2.3 樣品制備

樣品溶液制備：固體樣品用研缽研磨混合均勻，稱取1 g置于刻度比色管中，加10 mL甲醇，渦旋1 min，超聲提取10 min，以10 000 r/min離心10 min，靜置分層，取5.0 mL上清液，供凈化用（液體樣品取1 g置于刻度比色管，加甲醇至10 mL，與固體樣品同法制備）。

文言文是考試中的重頭戲，也是我們常說的“學生有三怕”之一。我們在教授課內文言文的同時，雖然能讓學生積累到不少有用的文言字詞，但如果不做上幾篇課外文言文，似乎也難以招架考試，而做課外文言文的目的主要在于熟悉題型，培養(yǎng)考感。

1.2.4 樣品凈化

Captive EMR-Lipid小柱處理方法：直接取上清液加至柱管內，上樣接收，重力自流，抽干小柱，接收液用氮吹儀35 ℃吹至溶液不到1 mL，用甲醇定容至1 mL。過0.45 μm濾膜濾過，濾液供高效液相色譜測定。

SPE固相萃取小柱處理方法：分別用5 mL甲醇、5 mL超純化水活化和平衡SPE柱，將上清液全部上柱，用8 mL甲醇洗脫，洗脫液用氮吹儀35 ℃吹至2 mL左右溶液，加甲醇定容至2 mL。

1.2.5 加標回收率試驗

稱取樣品（全營養(yǎng)配方粉、高脂配方粉、勻漿膳（高纖維）、營養(yǎng)混懸液）各3份，每份1 g，置于刻度比色管中，分別加入2.0和0.1 mL混標標準中間液1以及2.0 mL混標標準中間液2，分別作為高、中、低濃度回收率，加甲醇至10 mL，按樣品制備的方法制成加標回收溶液，待測定。

2 色譜條件的優(yōu)化和選擇

取11種香料標準品儲備液，通過紫外可見分光光度計對每個單標進行最大波長掃描，發(fā)現(xiàn)280 nm吸收波長處，各分析物的響應、峰型、分離度均有較好效果?？疾旒状?水、乙腈-水混合溶劑體系及其添加0.1%磷酸、0.1%三氟乙酸時對11種香料的色譜行為影響。通過試驗發(fā)現(xiàn)甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相且以1.2.2的梯度條件洗脫待測物質的分離度及峰形較好。

同時測定11種香料化合物對色譜柱的分離度等條件要求較高，難度在于目標物物理化學性質很接近，彼此間的微小差異不明顯，流動相中甲醇初始體積分數(shù)的改變會導致色譜峰出峰順序波動較大，且使用不同的色譜柱檢測11種香料化合物，出峰順序也不盡相同，普通色譜柱難以在較短的保留時間內分離。在儀器、流動相、柱溫、進樣量等條件相同的情況下，比較Agilent Poroshell 120 SB-AQ（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）和Ultimate LP-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）等不同類型、不同粒徑色譜柱對11種人工合成香料的分離情況。在梯度條件下，Ultimate LP-C18上除乙基香蘭素和香豆素外其他的香料化合物均達到分離目標，但出峰時間較長，丁香酚流出時間95 min左右，不適用于目標成分較多的分析測試；Agilent Poroshell 120 SB-AQ則在20 min內將目標峰全部流出，且11種目標被測組分與相鄰物質分離度良好。通過實驗室長期使用發(fā)現(xiàn)AQ柱柱效高、重現(xiàn)性好，可耐受高水相、低pH及高柱溫的極端條件，可匹配高效液相色譜儀（HPLC）和超高效液相色譜儀（UPLC），快速且高效地完成11種目標物質的色譜分離，提高檢測效率，適用于批次較大、樣品基質復雜的基層實驗室使用。圖2為最佳色譜條件下11種人工香料化合物的混合標準溶液色譜圖。

圖2 Agilent Poroshell 120 SB-AQ對11種人工合成香料的分離色譜圖

表2 2種色譜柱的性能區(qū)別

3 結果與討論

3.1 5種SPE固相萃取柱對11種香料化合物的加標回收率比較

由于特醫(yī)食品中蛋白質含量較高，用水對樣品進行浸泡處理時會帶入大量水溶性蛋白質，因此測定前需對樣品進行凈化處理。根據(jù)香蘭素、乙基香蘭素、甲基香蘭素、愈創(chuàng)木酚、香草酸、丁香酚、麥芽酚、乙基麥芽酚、香豆素、4-羥基苯甲酸、鄰香草醛這11種人工合成香料弱酸性的特質[11]，設計多種固相萃取小柱[12-13]，分別是Welchrom? P-SAX混合強陰離子小柱、Welchrom P-WAX混合弱陰離子小柱、Poly-Sery HLB親水-親脂小柱[14]、Welchrom C18E封尾的C18小柱和Captive EMR-Lipid增強型脂質去除過濾柱，對目標化合物進行有效的分離、凈化和富集。通過加入混合標準中間液1（1.0 mL）直接上柱，甲醇10 mL洗脫、35 ℃氮吹至近干，定容1 mL，過0.45 μm濾膜，按1.2.2色譜條件上機檢測，測定5種小柱凈化處理后回收率。Welchrom C18E柱、Poly-Sery HLB柱和Captive EMR-Lipid小柱混標過柱回收率均為滿意。結果見表3。

3.2 樣品加標過固相萃取柱的回收率影響

選擇特醫(yī)食品中全營養(yǎng)配方粉和營養(yǎng)混懸液各1 g，加1.0 mL混合標準中間液1，加甲醇至10 mL，與1.2.3和1.2.4樣品前處理方法同法處理過柱，見表4。Poly-Sery HLB柱的固體樣品回收率為22%～63%，Welchrom C18E小柱作為分散固相萃取基質難以完全去除脂質，過柱后的樣液有部分乳狀物積蓄，難以濾過，對儀器損害較大，需復溶至2～5 mL，想要達到檢出限需加倍稱樣量。Captive EMR-Lipid小柱有較好回收率和重復性，快速、簡便，滿足檢測要求且回收率良好，對樣品基質選擇范圍更廣泛，操作過程中上樣無需活化和平衡，樣液直接加載至Captive EMR-Lipid小柱以吸附脂肪和磷脂及蛋白質，除雜凈化效果好，可明顯提高樣品前處理工作效率，適用于基層實驗室對特醫(yī)食品的初篩。試驗均使用Captive EMR-Lipid為固相萃取小柱進行處理。

表3 不同類型固相萃取小柱對11種人工合成香料的回收率結果 %

表4 不同固相萃取方法對樣品中11種人工合成香料回收率影響

3.3 不同溶劑對特醫(yī)食品基質中11種人工合成香料的提取回收率影響

考慮到11種人工合成香料均極性較大，易溶于醇，試驗用甲醇、甲醇-水（不同比例）、乙醇、乙腈等為提取溶劑，以常見全營養(yǎng)配方粉為研究對象，考察回收率影響。由于廠家會采用一些分子包埋技術來保護營養(yǎng)粉配方成分[15]，因此在加入提取溶劑前，先添加適量水分來浸潤樣品，添加甲醇提取以增加待測組分的包埋釋放；因目標化合物有酚羥基基團，具有弱酸性[16]，考慮其提取凈化過程在酸性條件下進行。由圖3和圖4可知，選用乙醇、乙腈雖可沉淀蛋白，降低干擾物的響應，但目標物隨之流失。以甲醇為提取溶劑時，可獲得理想的回收率；選擇不同酸度、不同比例甲醇溶液則對4-羥基苯甲酸、乙基麥芽酚、鄰香草醛這3種香料影響較大，回收率隨著甲醇比例增加而明顯提高，且重現(xiàn)性好。確定甲醇為提取溶劑。

圖3 不同溶劑提取11種人工合成香料的回收率結果

圖4 不同比例的甲醇和不同酸度的甲醇提取11種人工合成香料的回收率結果

3.4 11種香料化合物萃取效果的優(yōu)化

3.4.1 甲醇提取量的選擇

考察10 mL甲醇直接提取和10 mL甲醇分2次提?。? mL、5 mL），取5.0 mL上清液氮吹至1 mL，結果表明，2種提取方式結果差別不大，直接提取混標過柱回收率較好，可達95%～101%。

3.4.2 萃取時間的優(yōu)化

選擇不同的超聲時間萃取，取上清液過EMR-Lipid小柱，洗脫液濃縮后，濾過，檢測。圖5表明，11種人工合成香料在不同超聲時間上的萃取結果，最佳萃取時間10 min。

綜合比較混合標準中間液1（各取2.0 mL）加標水平下各因素組合的回收率和凈化效果，使用10 mL甲醇作為提取劑，漩渦1 min，超聲10 min，以10 000 r/min離心10 min，5.0 mL上清液直接上樣過EMR-Lipid柱，重力自流，可獲得良好提取、凈化效果。

圖5 不同萃取時間下11種人工合成香料的回收率結果

3.5 Captive EMR-Lipid凈化及濃縮步驟的優(yōu)化

試驗采用通過式凈化方式將提取溶液加載到EMR- Lipid固相萃取柱[17]，針對脂類物質進行必要的凈化，直接收集流出液完成凈化，取定量濃縮管，用氮吹儀濃縮至少于1 mL，定容至1 mL，達到最低檢出限。香料屬于揮發(fā)性物質，會隨著溫度升高而揮發(fā)，故分別以35，40和45 ℃為氮吹溫度考察11種人工香料化合物的回收率，以35 ℃為氮吹溫度時，目標物質幾乎沒有損失，確定最佳氮吹溫度35 ℃。見圖6。

圖6 氮吹儀水浴溫度對11種人工合成香料的回收率影響

3.6 液-液萃取法和Captive EMR-Lipid柱的檢測結果比較

利用香蘭素等成分在酸性和堿性溶液中分別以鹽和分子形式存在的特點，采用液液萃取的方法進行前處理，乙醚液萃取加酸溶液的樣品，棄去水層；加一定量NaOH溶液萃取后，棄去乙醚層；加酸調pH至酸性，用乙醚萃取后，揮干乙醚，用甲醇定容，濾過0.45 μm濾膜，進樣檢測，與Captive EMR-Lipid柱的檢測結果比較，樣品加標回收率為21.9%～76.9%。

3.7 不同類型的特醫(yī)食品加標回收率結果

按特醫(yī)食品脂肪、蛋白質含量的高低和劑型的不同，在4種樣品中添加不同濃度的各分析物進行回收率試驗，3種添加水平的平均回收率為84%～107%。所得結果見表5。

表5 各成分的回收率及精密度結果（n=3）

轉下頁

接表5

化合物 添加水平/(μg·mL-1) 全營養(yǎng)配方粉 高脂配方粉 勻漿膳 (高纖維型) 營養(yǎng)混懸液回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/% 回收率/% RSD/%鄰香草醛 404.980 0 98 2.9 92 2.9 94 2.3 102 2.6 20.249 0 90 0.7 90 0.7 96 1.7 95 6.3 8.099 6 87 3.4 86 1.0 85 0.5 84 6.6香豆素 255.730 0 104 0.1 101 1.0 101 2.6 96 3.6 12.786 5 90 1.8 94 0.6 92 1.6 94 2.3 5.114 6 87 2.2 98 0.4 87 0.6 92 1.2乙基香蘭素 304.860 0 104 1.3 93 0.9 92 2.1 96 3.0 15.243 0 100 2.9 96 1.4 98 0.99 100 0.3 6.097 2 89 0.4 84 2.2 84 0.5 86 3.3甲基香蘭素 319.870 0 96 2.9 98 2.7 101 3.1 95 1.0 15.993 5 87 0.6 107 3.1 84 2.1 86 0.3 6.397 4 103 3.3 86 0.9 89 2.6 87 4.6丁香酚 481.270 0 100 2.6 86 2.1 90 1.9 94 0.6 24.063 5 88.6 2.4 100 1.4 87 2.5 88 2.3 9.625 4 107 2.7 90 0.8 89 3.8 87 1.0

4 結論

針對特醫(yī)食品基質通過不同種固相萃取柱凈化后的加標回收率考察試驗，選擇對特醫(yī)食品基質凈化效果較好的Captive EMR-Lipid（增強型脂質去除過濾柱），并結合高效液相色譜儀進行檢測，DAD光譜圖定位，方法具有回收率高、操作簡便快速、易于批處理等優(yōu)點，可用于特醫(yī)食品中香蘭素等11種人工合成香料的檢測分析。