LC-MS/MS測定果汁飲料中乳酸鏈球菌素

陳召桂，楊晉青，朱玲琳

1. 浙江五芳齋實(shí)業(yè)股份有限公司（嘉興 314031）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院（上海 200233）

乳酸鏈球菌素（Nisin）是一種由部分乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）或乳酸鏈球菌（Streptococcus uberis）菌株產(chǎn)生的一種陽離子多肽，能夠有效抑制大多數(shù)革蘭氏陽性細(xì)菌的生長。乳酸鏈球菌素作為一種新型天然的生物防腐劑，較之傳統(tǒng)防腐劑苯甲酸鈉、山梨酸鉀、丙酸鹽、富馬酸二甲酯，具有效果好、用量少、對人和生物生存環(huán)境沒有破壞和副作用等優(yōu)點(diǎn)[1-4]。GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[5]規(guī)定乳酸鏈球菌素使用范圍和最大使用量，在飲料（14.01包裝飲用水除外）中的最大使用量為0.2 g/kg（固體飲料按沖調(diào)倍數(shù)增加使用量）。國內(nèi)外對乳酸鏈球菌素的檢測方法研究成果較少，目前主要是使用瓊脂擴(kuò)散法、酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜法、高效液相色譜質(zhì)譜法等[6-9]。這些檢測方法各有優(yōu)缺點(diǎn)，而高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法具有溶劑用量小、分離效率高、檢測靈敏度高、假陽性低等優(yōu)勢[10]。目前針對飲料中乳酸鏈球菌素的檢測鮮有報(bào)道，故此次試驗(yàn)采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜對果汁飲料中乳酸鏈球菌素進(jìn)行檢測，從而彌補(bǔ)這方面的空白，為乳酸鏈球菌素的檢測方法標(biāo)準(zhǔn)的建立提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）。

乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1.0 mg/mL）：稱取0.100 0 g乳酸鏈球菌素于100 mL容量瓶中，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶解并定容至刻度，存放于4 ℃冰箱中備用。

乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液：取1.0 mL乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液溶劑稀釋至1.0 mg/L，備用。

乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液：用含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液稀釋乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)工作液，使其質(zhì)量濃度分別為100，80，50，20，10和5 μg/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；AB SCIEX QTRAP?6500質(zhì)譜儀（美國Sciex公司）；TB-114型分析天平（Mettler Toledo公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；超聲波清洗器（上海鯨德公司）；高速離心機(jī)（Eppendorf公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱Agilent PLRPS-S C18（2.1 mm×150 mm，3.0 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；流速為200 μL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣體積為20 μL。

質(zhì)譜條件：離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（CUR）10.0 psi；霧化氣（GS1）40.0 psi；加熱氣（GS2）10.0 psi；噴霧電壓（IS）5 000 V；去溶劑溫度（TEM）400 ℃；去簇電壓（DP）70 V；定量離子對m/z667.2/805.4，碰撞能（CE）20 eV；定性離子對m/z667.2/739.1，碰撞能（CE）20 eV。

1.2.2 樣品前處理?xiàng)l件

準(zhǔn)確稱取5.00 g試樣于50 mL離心管中，加入50.0 mL含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液，渦旋1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜方法

使用10 μg/mL乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液，通過流動注射泵進(jìn)入質(zhì)譜進(jìn)行母離子和子離子掃描優(yōu)化，得到乳酸鏈球菌素的母離子、子離子及碰撞能量等質(zhì)譜采集參數(shù)，如表1所示，其中m/z667.2/805.4為定量離子。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)

2.2 液相色譜方法

2.2.1 色譜柱選擇

乳酸鏈球菌素屬于大分子類物質(zhì)，色譜柱的大小、顆粒形狀及粒徑、顆粒表面積、孔徑、封端技術(shù)等對其分離度有決定性影響，因此選擇實(shí)驗(yàn)室常用XDB-C18、SB-C18、PLRPS-S-C18等色譜柱對乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離研究，以便找出合適的色譜柱。最終發(fā)現(xiàn)PLRPS-S-C18柱效高、選擇性好、分析速度快，因此將其作為乳酸鏈球菌素的檢測。

就國內(nèi)其它行業(yè)成功實(shí)施案例分析來看，為了在當(dāng)下的環(huán)境下更好地生存與發(fā)展，充分地利用了信息化和移動化的技術(shù)手段，并引入了先進(jìn)的JIT（準(zhǔn)時至）的管理理念，對鐵路企業(yè)審批業(yè)務(wù)環(huán)節(jié)上進(jìn)行了改革性的創(chuàng)新和應(yīng)用，讓審批業(yè)務(wù)由線下操作成功的轉(zhuǎn)型到線上操作，不僅大大提高了工作的效率，同時也節(jié)約了大量的時間成本和資源的消耗，取得很好的應(yīng)用效果。具體效果體現(xiàn)在以下幾個方面：

2.2.2 流動相的選擇

流動相的種類及配比直接影響組分的分離，因此需要對流動相組成選擇進(jìn)行優(yōu)化。因Nisin易溶于水，極性較強(qiáng)，質(zhì)譜電離時帶多個正電荷，故選擇有機(jī)相-甲酸水體系作為流動相。使用100 ng/mL的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行液相色譜方法優(yōu)化，分別選擇甲醇-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水和乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動相進(jìn)行梯度洗脫，洗脫梯度條件如表2所示。其中A相為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液，B相為有機(jī)相，比較發(fā)現(xiàn)使用乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%甲酸水作為流動相時，洗脫能力好，質(zhì)譜響應(yīng)高且色譜峰較窄，故選擇乙腈-質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的甲酸水溶液作為乳酸鏈球菌素檢測的流動相。色譜圖如圖1所示。

表2 梯度洗脫條件

圖1 乙腈-0.1%甲酸水的梯度洗脫色譜圖

2.3 樣品前處理方法

2.3.1 提取溶劑的選擇

由于乳酸鏈球菌素易溶于水，并且溶解度隨著pH的降低而顯著增加，不能完全溶解于純的甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑，所以選擇水、乙腈水溶液、含0.1%甲酸的乙腈水溶液分別作為提取溶劑，考察這3種不同提取溶劑對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效果。試驗(yàn)選取蘋果汁飲料為基質(zhì)樣品，稱取5.0 g試樣并向其中加入500 μg/kg的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)品，分別選用水、20%乙腈水溶液、含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作為提取溶劑，然后對其進(jìn)行超聲提?。ㄌ崛∠嗤瑫r間），重復(fù)測定6次，考察提取效率，結(jié)果見表3。

3種提取溶劑均能提取飲料中乳酸鏈球菌素。水對乳酸鏈球菌素提取效率較差，含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液提取效率明顯較高，而且純水難以過濾上機(jī)，存在雜質(zhì)難以沉淀的問題，不便于前處理過程；含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液明顯高于乙腈水溶液，而且考察到乳酸鏈球菌素在低pH下的溶解度較好，因此選擇含0.1%甲酸的20%乙腈水溶液作為最終的提取溶劑。

表3 不同提取溶劑對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效率

2.3.2 超聲時間和溫度的選擇

超聲提取時間是對測定結(jié)果影響較大的因素之一，因此選取不同的超聲時間進(jìn)行試驗(yàn)。分別選取5，10，15，20和30 min，在相同條件下進(jìn)行分析測定，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，隨著超聲提取時間的延長，提取效果提高不明顯。由于樣品是可溶性液體類飲料，乳酸鏈球菌素基本溶解在其中，只需滿足基質(zhì)效應(yīng)低的提取溶劑下提取，故選擇超聲提取時間10 min。

表4 不同提取時間對果汁飲料中乳酸鏈球菌素的提取效率

2.3.3 線性范圍與檢出限

分別取20 μL質(zhì)量濃度為100，80，50，20，10和5 μg/L乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)液，按上述色譜-質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。以相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標(biāo)、待測組分的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，經(jīng)線性回歸求得相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明待測組分在該濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

檢出限定義：響應(yīng)信號為噪音的3倍（S=3N）時所需的樣品量；定量限定義：響應(yīng)值為10倍基線噪音時所需的樣品量。當(dāng)取樣量為5.0 g時，將一定濃度的乳酸鏈球菌素標(biāo)準(zhǔn)樣品添加在空白基質(zhì)樣品中，定容體積為50.0 mL，在相同檢測條件下進(jìn)樣6針，按檢出限的定義分析數(shù)據(jù)，結(jié)果如表6所示。乳酸鏈球菌素的檢出限為20 μg/kg，定量限為50 μg/kg。

表5 線性范圍

表6 檢出限結(jié)果

2.3.4 方法回收率和精密度

選取陰性空白樣品基質(zhì)（蘋果果汁），分別添加低、中、高3個濃度水平（50，100和500 μg/kg），每一個添加水平重復(fù)測定6次，其回收率和精密度結(jié)果如表7所示。可以看出，回收率在79.5%～111.5%之間，且相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）＜10%，能夠滿足試驗(yàn)要求。

表7 回收率和精密度試驗(yàn)結(jié)果（n=6）

2.3.5 市售樣品分析

采集30個市售果汁飲料樣品，按照樣品處理方法對樣品進(jìn)行處理，根據(jù)儀器分析方法，對樣品中的乳酸鏈球菌素上機(jī)分析，樣品中均未檢出乳酸鏈球菌素，可能是由于乳酸鏈球菌素較化學(xué)防腐劑價格較貴等原因，在果汁飲料領(lǐng)域使用較少。

3 結(jié)論

通過優(yōu)化色譜條件和質(zhì)譜條件，選擇合適的提取溶溶液類型以及相應(yīng)體積，建立LC-MS/MS測定果汁飲料中乳酸鏈球菌素含量的檢測方法。該方法靈敏、準(zhǔn)確、專一性強(qiáng)，適用于果汁飲料中乳酸鏈球菌素的定性與定量檢測，可為果汁飲料中超限量使用添加劑提供有力的技術(shù)支撐，也為拓展到其他食品中乳酸鏈球菌素的檢測提供理論基礎(chǔ)。